Summary
マウスは、妊娠性生物を勉強する広く使用されます。ただし、妊娠の終了は、縦断的な調査を排除する、多数の動物の使用を必要とするこのような研究に必要です。したがって、早期発見のための高周波超音波の非侵襲的手法と妊娠マウスに着床後イベントの監視について述べる。
Abstract
高周波超音波 (HFUS) は、非侵襲的子宮内胎児のリアルタイムの開発を監視するための一般的な方法です。マウスは体内モデルとして胚移植と妊娠の進行の勉強を日常的に使用されます。残念ながら、このようなマウスの研究は、フォロー アップの表現型解析を有効にする妊娠の中断を必要とします。この問題に対処するため立体 (3 D) HFUS 画像マウス胚の注入のサイトと、個々 の発達進行で子宮の早期検出と評価のためのデータを使用しました。我々 は、正確に胚移植サイト数を定量化すると同様に 9.5 d.p.c. を通じて 5.5 日ポスト膣 (d.p.c.) から C57BL6J/129S 妊娠マウスにおける発達の進行を監視ができた HFUS 3次元再構成画像とモデルを組み合わせて、探触子を用いる。含まれている測定: 数、場所、およびサイト間注入間隔と同様、着床のボリューム胚の生存率は、心臓の活動を監視することによって評価されました。すぐ着床後期間 (5.5 〜 8.5 d.p.c.) 再構成メッシュと固体のオーバーレイの両方で妊娠の子宮の形式にはそれぞれの子宮角内にある発展途上の妊娠の視覚的表現が有効になります。遺伝子改変マウスが子宮の機能不全から派生した女性の生殖形質を特徴付けるために使用するのにつれ、このメソッドは、検出、定量化、および初期注入イベント特徴づける体内への新しいアプローチを提供しています。3次元 HFUS イメージングのこの小説の使用は、正常に検出、視覚化、および非侵襲的方法で妊娠初期マウス胚着床を特徴付ける機能を示します。技術は、総組織と病理組織学的評価のために妊娠の中断に依存する現在の方法と比べて大幅に改善を提供しています。ここでメッシュと立体画像で子宮の形の改築に伴う信頼性と再現性のあるデータを生成するのにマウス妊娠初期の超音波を正常に実行するのに方法について説明ビデオ、テキスト形式を使用します。
Introduction
再発妊娠初期の損失は受胎後は最も一般的な合併症の 1 つと1,2を想像しようとするカップルの約 1% に影響を与えます。妊娠初期の損失のメカニズムは変わる: 本質的な胚の異常や子宮内膜の感受性1,3,4の欠陥に母体合併症から。自分の遺伝的少ないのためのマウス モデルは、初期胚移植の妊娠の調査のため広く利用されています。さらに、マウスと大規模な研究を実行する能力の短い妊娠時は、人間の生殖医学5の主要な臨床質問に対処でマウスの成長しているユーティリティを確保しています。つまり、マウスの実験的デザインの大半はまだ定量化妊娠6、中に注入サイトの場所、数、サイズ、および間隔のパターンを分析して順次妊娠日の安楽死させたことに多数のダムを必要とします。 7、8、それによって同じ動物に関する縦断的研究は除外。
クリニックで超音波は人間の胎児の生存、非侵襲的方法9,10,11の開発を監視する信頼性の高い、非常に貴重なツールです。最近では、高周波超音波 (HFUS) は、マウスの胎児の生存および妊娠12,13,14中の成長を監視する方法として限られたアプリケーションを検索し始めています。超音波画像における最近の技術の進歩は、動物の臓器の視覚的な復元と病態15,16、それ以降の監視の立体 (3 D) データのアプリケーションを許可しています。 17。この高度なイメージング技術の使用より小さいボリュームの変動、動物間の可変性を減らすために、病理学の進行または17の治療的介入の有効性を監視するための検出力は飛躍的に。この技術の主要なユーティリティは、営利的モデル15,16における悪性腫瘍の進行を監視してきましたが、3-d HFUS ばかり量的に表わすし、胚移植の積極的な成長を監視する使用されていますマウス子宮18で胎児の発育。
ここでは、初期の妊娠マウス子宮の再構成を生成する 2 D と 3 D データを生成するイメージング HFUS を実行する方法を示します。非侵襲的な方法でデータを収集するために研究者を許可する妊娠の終了を必要とせずこれらの初期胚の注入のイベントを検出するこの手法の有用性を示す.
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Protocol
ケアと健康の国民の協会によって公開された実験動物の使用および機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認された動物のプロトコル ガイドに従って行われたこれらの研究議定書の下で薬の Baylor の大学の数、4203
。1。 超音波妊娠マウスの作製
1700 以降- 実績のある肥沃な男性とダムの場所を 交尾のタイミング をマウスに一晩開始。別のダムと男性 0700 時間 (h)、関係なく妊娠の正確な年代測定を確保するために膣にプラグがある場合
。 注: 0.5 日と見なされる交尾後の朝のポストの coitum 定め (d.p.c.) です 。
- 実績のある肥沃な男性とダムの場所を 交尾のタイミング をマウスに一晩開始。別のダムと男性 0700 時間 (h)、関係なく妊娠の正確な年代測定を確保するために膣にプラグがある場合
- 超音波のための準備
- シール麻酔誘導コンテナーで妊娠中のマウスを配置します 。
- 落ち着いたイソフルラン (2%) 吸入麻酔薬と酸素 (1 L/分) まで動物を失い立ち直り反射 (約 1-2 分のサイズに応じてマウスの)、(呼吸) 以外にも自発的な動きが観察されていません 。
- にノーズコーンとイソフルレン (2%) 吸入麻酔薬と酸素 (1 L/分) で仰臥位で鎮静マウスを置く。動物に眼軟膏を適用 ' s 目 。
- 綿棒で腹部全体、膣、胸骨に脱毛クリームを適用し、外側を側面します 。
- は、最大 3 分のままにクリームを許可する、クリームとティッシュで髪を取り外します。残りの髪は画像品質が低下、すべての髪が削除されることを確認します 。
2。超音波ステージの準備
- 探触子をオンにします 。
- トランスデューサーに 3-D モーター段階モーター ステージを添付します。
- 3 D にプラグ モーター、3 D モーター ケーブルを背面パネルの 3 D モーター コネクタに接続します。3 D モーター システムをイメージング ステーションに接続する上にクイック リリース ポストを使用してマウント システムにアタッチとクイック リリース マウント トランスデューサー クランプを貼る下 。
- 探触子クランプにプローブを接続します
3。 妊娠マウスをイメージング開始
- 場所マウス監視プラットフォームで仰臥位。マウスは継続的にイソフルラン麻酔 (1.5-2.5%) の間を受け取ると鼻の円錐形を介して酸素 (1 L/分)。心拍数監視プラットフォーム上のパッドにすべての足をそっとテープします。
- 上腹部超音波伝送ゲルの 1-2 の mL を適用します 。
- 手動モーター ステージを使用して下腹部に超音波プローブを置きます。
- 膀胱は、膣の開口部に頭の方だけ液体で満たされた暗闇の円として表示されますを見つけます 。
- 膀胱が見つかったら、プローブを移動非常にゆっくりと頭の方妊娠中の子宮は、妊娠サイトで丸いエリアと円柱の形として表示されますを視覚化します。これはチェーンに真珠のように見えるとして記述することができます 。
- したら 2 D イメージング、妊娠子宮が発見されました 。
4。2 D 超音波イメージング (図 1)
- 妊娠子宮を特定したら、膀胱に最も近い妊娠サイトから始まり、ゆっくりと順番には妊娠のサイトの数と場所を決定するため頭側移動します 。
- 腎臓、脾臓や肝臓が可視化プローブの位置を変更近い尾 (に近い膀胱) ユーザーがあまりにも頭の方まで行っていると 。
- 同じ方法で採卵をイメージします 。
- 超音波フレームは後の分析や測定のために保存する注入/妊娠サイトの中心部でときに画像をフリーズする
。 注: それは冷凍して後で分析のために保存画像の 1 秒未満かかります 。
手動でクリックしてマーカーとしてエコー エストロージェン反応を利用した - 測定注入距離、" メジャー " まず、ツールし、1 つの注入のサイトの場所をクリックします。次に、着床しコンピューターが自動的にその距離をレポート ラインを描画するをクリック、次にカーソルをドラッグします。ソフトウェアは、手動測定が報告が。この手順はないコンピューターですが、プログラムは測定先決を提供 decidualized サイト間の線で decidualized のサイト間の距離をマークするユーザーに依存している
- 注入、胎嚢サイズ、胎児極サイズを測定します 。
5。胎児心拍
注: 9.5 d.p.c. で胎児の心臓の鼓動を明確に視覚化する必要があります
。- プローブを非常にまだ維持しながらパルス波ドップラーをオンにし、表示のハートビートにこれを置きます 。
- レコード、心臓鼓動脈動
。 注: 中心部から離れてこの手順も記録できます脈動に臍帯 。
6。 3-D 超音波買収
- 後、妊娠中の子宮は 2 D 画像の可視化されて目的の 3-D イメージのおおよその中間点にある領域にプローブを位置づけ。たとえば、3-D でリンゴを撮像された 1 つ場合プローブされるべきである最初する位置 (すなわちオブジェクトの真ん中) をリンゴの芯が予測されています 。
- の目的のイメージの中にプローブを用いた 3-D 取得を取得します。3 D モーター ステージは一連の手順またはフレームのために子宮全体でこの距離を旅行、どのような調査官の欲望全体に取り込むつもりで 。
- 意図されていた構造がリアルタイム超音波部分を完了する前に 3 D スキャンで完全にキャプチャされたことを確認します。後でポスト処理のためこの 3次元の情報を保存します。2 D と 3 D の超音波取得の所要時間は約 10-20 分経験のあるユーザーによって実行されるときです 。
7 3次元再構成後処理 (図 2)
- 3次元画像処理の必要なデータをロードします。 。
- 選択 " 平行・回転メソッド "、すべての 3 D 画像のフレーム 1 つの 3-D に負荷が " ボックス " ユーザーは、フレーム単位での目的のオブジェクトをトレースし。ステップを選択サイズ 0.08 mL。画像ブロックの一方の端から始まり、空間内で撮影されている画像を理解するスクロールします。
- イメージと手動でトレース オブジェクトのアウトラインの一方の端で開始します 。
- 次の 2 D イメージ スライスをスクロールまたは " フレーム " オブジェクトのアウトラインを手動でトレースと 。
- 手動で注釈/トレース ユーザーによってすべてのフレームがされるまで、このプロセスを続行します 。
- をクリックして " を終了 " 3次元画像と総体積の計算を取得する 。
- メッシュと左上隅の矢印は、固体のオーバーレイを選択します 。
- を保持または削除する周辺の超音波イメージ情報をわかりやすくするために選択します。それぞれの 3次元復元が 10 〜 20 分間かかることがあります
8。手続き後ケア
- 超音波が完了したら、麻酔ガスをオフに、プラットフォームから、マウスを削除しふきます、動物から、超音波ジェルを洗い流します 。
- は、パディング領域の腹臥位でケージに戻ってマウスを配置します。動物は自然に目を覚まし、移動するまで監視します 。
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Representative Results
図 1に示されているように、高周波超音波は注入サイト開発、早くも 5.5 着実にポイントを検出できます。ライターのエコーを使用して 6.5 着実に着床のマーカーとして decidualized 子宮内膜は着床と間隔を定量化するこれらのサイトの数をことができます。妊娠として 7.5 d.p.c.、暗い低エコーの胎嚢と胎仔のポールまで進行は簡単に識別もできます。
図 2に示すように、マウス子宮の 3次元画像の後処理の完了された構成は視覚化することができます。6.5 着実にメッシュと固体オーバーレイ形式の両方で高周波超音波組成は視覚的描写を提供するために使用できます。別の例では、この時の 7.5 着実メッシュと固体オーバーレイ別子宮の最終的な合成画像を示します。
図 1: 注入サイト開発と妊娠中の胎児の成長のモニタリングの高周波超音波検出します。図 1 aのように、5.5 d.p.c. 軽量無エコーに decidualized 子宮内膜 (D) には着床を定量化する間隔数ことができます。図 1 bのように、別の子宮角のエストロージェン サイト (D) は子宮角 (U) によって結合されます。7.5 d.p.c. によって暗い低エコー嚢 (GS) と胎児ポール (F) は、簡単に識別できる図 1です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: マウス子宮の妊娠初期の三次元再構成します。6.5 着実で図 2 a、高周波超音波メッシュで固体のオーバーレイのように、形式が表示されます。7.5 着実にメッシュと固体のオーバーレイの高周波超音波画像、図 2 bに示すように、形式が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
3次元 HFUS イメージングのこの小説の使用は、正常に検出、視覚化、および非侵襲的方法で妊娠初期マウス胚着床を特徴付ける機能を示します。技術は、総組織と病理組織学的評価のために妊娠の中断に依存する現在の方法と比べて大幅に改善を提供しています。しかし、組織学的方法まだと思われるより最適なより拡大しより細胞レベルで評価が必要なときや、遺伝子・ タンパク質解析が必要な場合に注意してください。注入欠陥および早い妊娠の損失19,20,21,22を表示する新しいマウスモデルの増加に伴い、これの能力は初期を検出する超音波技術を高度な5.5 着実以降からの妊娠は、妊娠中期12,13での検出に限られていた以前の超音波方法で明確な利点を提供します。また、このメソッドは、中心が 8.5 9.5 着実23,24を実行可能な胎児の確認を可能にする間、ビートを開始すぐに心臓の動きを検出します。同じ動物の初期の妊娠イベントを追跡する機能を意味少ない動物実験ごとに必要なより正確な分析は、このような縦の実験的デザイン25,26,で実行できる27。
プロトコルで 3 つの最も重要な手順がいるに注意してください: (1) 正確な妊娠日を知る(2) 子宮を見つけて、正しい解剖学的サイト上にプローブを位置づけするオペレーターの能力3次元復元を生成する (3) 正確なテクニック。以下のトラブルシューティングのガイドラインは有用証明した: 膀胱が最初に識別されることを確保することによって、ユーザーが開始できる超音波で子宮を見つけることが困難な場合。膀胱は、通常黒い円と見られているし、膣口に頭の方はすぐに。でも超音波の直前に排尿を受けたマウス、膀胱が完全に空ではありません、したがって (我々 の経験) で信頼性の高いマーカーにすることができます。膀胱が識別されると、プローブをゆっくりと移動頭側子宮が見られるまで。膀胱が小さいかを視覚化することができません、ユーザーことができますから始まるの側面、腎臓に劣るで見つけることができる卵巣で子宮を視覚化する試行します。この体系的なアプローチを使用して、各の着床や胎児の発育を観察できます、図 1のように。場合によっては、体内のさまざまな形と、子宮の位置によって図 2に示すように子宮が腹部に配置されている方法のため超音波検査の時に子宮の目的の地域を得ることが困難場合があります。ユーザーは、転換や子宮内部を超音波でキャプチャできる望ましい子宮領域でより有利な位置を再調整するマウス プラットフォーム平面を傾けることができます。最後に、ユーザーは、超音波セッションが完了した後すぐに取得した超音波画像をすばやくスクロールして、超音波検査中に目的の子宮画像が得られることを確認できます。マイナーな制限は、超音波のセッション中に、視覚的な復元の 3-D メッシュ/固体オーバーレイを実行できないことです。超音波像が正確であるためには、研究者は、能力を得ていると動物が総組織標本に超音波所見の精度と関連付けるための超音波後安楽死をお勧めします。測定および解剖学。
一方、妊娠マウスのモデリングについてここで述べる、この技術の将来のアプリケーションは異常早期妊娠イベントを定量化する適用されます。HFUS と再構成を検出および数、サイズ、および成長および/または開発の異常である妊娠の場所を監視する調査官が許可されます。異常の非侵襲的表現型特性など、成長と不十分な絨毛性侵略異常胚移植分布、すなわち欠陥子宮内膜エストロージェン-増加が表示されます遺伝子組み換えマウスの数は今このイメージング法を用いた妊娠中断することがなく縦分析できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 は非常に栄趙、杰李 Ying ヤンの協力をありがとうございます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VisualSonics Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform/Machine | VisualSonics, inc. | VS-11945 | |
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, inc. | SA-11982 | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission Gel | Parker | #SKU PLI 01-08 | |
| Isoflurane (IsoThesia) 100mL bottle | Henry Shein | #29404 | |
| PuraLubenAnimal Ophthalmic Ointment | Dechra | #12920060 |
References
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