Summary
레이저 스캐닝 현미경 검사 법 긴 파장 다중 광자 형광 여기의 고급 광학 기술의 조합 안내 (sox10:EGFP)에 안내 (foxd3:GFP) zebrafish 태아 신경 크레스트 마이그레이션의 고해상도, 3 차원, 실시간 영상 캡처 구현 되었습니다.
Abstract
선 천 성 눈 craniofacial 변칙 중단 신경 크레스트, 몸 전체에 수많은 세포 유형을 철새 줄기 세포의 일시적인 인구에에서 반영 합니다. 신경 크레스트의 생물학 이해 제한, 공부 vivo에서 될 수 있는 유전자 세공 모델의 부족과 실시간으로 반영 되었습니다. Zebrafish는 신경 크레스트 등 철새 세포 인구를 공부에 대 한 특히 중요 한 개발 모델입니다. 개발 눈에 신경 크레스트 마이그레이션 검사, 레이저 스캔 현미경 긴 파장 다중 광자 형광 여기의 고급 광학 기술의 조합 같이 sox10 와 foxd3 가 되어 초기 신경 크레스트 차별화 규제 가능성이 신경 크레스트 셀에 대 한 마커를 대표 하는 수많은 동물 모델에서 유전자 변형 zebrafish 태아, 즉 Tg (sox10:EGFP) 및 안내 (foxd3:GFP)에 개발 눈의 고해상도, 3 차원, 실시간 동영상 캡처 구현 되었습니다. 다중 광자 시간 경과 영상 동작 및 초기 눈 개발에 기여 두 신경 크레스트 세포 인구의 철새 패턴 분별 하 사용 되었다. 이 프로토콜 예를 들어, zebrafish 신경 크레스트 마이그레이션 중 시간 경과 비디오를 생성 하기 위한 정보를 제공 하 고 많은 구조는 제 브라와 다른 모델 유기 체에서의 초기 개발을 시각화에 추가 적용할 수 있습니다.
Introduction
선 천 성 눈 질환 아동 실명을 일으킬 수 있으며 종종 두개골 신경 크레스트의 이상 때문. 신경 크레스트 세포는 신경 관에서 발생 하 고 몸 통하여 수많은 직물을 형성 하는 일시적인 줄기 세포. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 신경 크레스트 셀, prosencephalon 및 mesencephalon에서 파생 된 게 상승 뼈와 연골은 midface 정면 지역, 그리고 홍 채, 각 막, 배수 채널 및 sclera 눈의 앞쪽 세그먼트에서. 4 , 6 , 7 , Rhombencephalon 형태는 인 두 아치, 턱, 그리고 심장 유출 관에서 8 신경 크레스트 셀. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 연구 강조 했습니다 눈을 신경 크레스트의 기여 및 periocular 개발, 척 추가 있는 눈 개발에 이러한 세포의 중요성을 강조. 실제로, Axenfeld Rieger 증후군과 피터 스 플러스 증후군에서 관찰 신경 크레스트 셀 마이그레이션 및 분화의 방해는 craniofacial 눈 변칙와 이어질. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 따라서, 마이그레이션, 확산 및이 신경 크레스트 세포의 분화에 대 한 포괄적인 이해 선 천 성 눈 질환을 기본 복잡성에 대 한 통찰력을 제공할 것입니다.
Zebrafish는 zebrafish 눈의 구조는과 유사 하 포유류 들 그리고 많은 유전자는 제 브라와 포유류 사이의 보존 진화론으로 눈 개발 공부에 대 한 강력한 모델 생물 이다. 18 , 19 , 20 또한, zebrafish 태아는 투명 하 고 oviparous, 실시간으로 눈 개발의 시각화를 촉진.
이전에 게시 작업에 확대,6,,720 신경 크레스트 셀의 철새 패턴 사용 하 여 다중 광자 형광 이미징 SRY (섹스 결정 지역 Y)의 transcriptional 통제 녹색 형광 단백질 (GFP)으로 표시 하는 유전자 변형 zebrafish 선에 시간 경과 설명 했다-상자 10 (sox10) 또는 Forkhead 상자 D3 (foxd3) 유전자 규제 지역. 21 , 22 , 23 , 24. 다중 광자 형광 시간 경과 영상 레이저 스캐닝 현미경 표본 fluorophores 태그로의 고해상도, 3 차원 이미지를 긴 파장 다중 광자 형광 여기의 고급 광학 기술을 결합 하는 강력한 기술입니다. 25 , 26 , 27 다중 광자 레이저를 사용 하 여 표준 confocal 현미경 검사 법, 증가 조직의 침투 및 감소 fluorophore 표백 등 뚜렷한 장점이 있다.
이 메서드를 사용 하 여 마이그레이션 및 철새 통로의 타이밍에 다양 한 신경 크레스트 세포의 두 가지 인구 periocular mesenchyme 개발 눈에 차별, 즉 foxd3 양성 신경 크레스트 세포와 craniofacial mesenchyme sox10 양성 신경 크레스트 셀을 했다. 이 방법으로 zebrafish에 눈와 craniofacial 신경 크레스트 마이그레이션 마이그레이션 시각화 하는 방법을 도입, 개발 하는 동안 실시간으로 레 귤 레이트 된 신경 크레스트 마이그레이션 관찰 하기 쉽게.
이 프로토콜 Tg (sox10:EGFP)에 안내 (foxd3:GFP) 유전자 변형 zebrafish, 예를 들어 초기 눈 개발 하는 동안 시간 경과 비디오를 생성 하기 위한 정보를 제공 합니다. 이 프로토콜 zebrafish에 신경 크레스트 셀에서 파생 된 어떤 눈와 craniofacial 구조의 초기 개발의 고해상도, 3 차원, 실시간 시각화를 위한 추가로 적용할 수 있습니다. 또한,이 방법은 다른 조직 및 장기 제 브라와 다른 동물 모델의 개발의 시각화에 대 한 추가 적용할 수 있습니다.
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Representative Results
다중 광자 형광 시간 경과 영상 생성을 야기할 craniofacial 구조 및 안내 (sox10:EGFP)에 안내 (foxd3:GFP) 눈의 앞쪽 세그먼트 zebrafish 라인 두개골 신경 크레스트 셀의 마이그레이션 패턴을 공개 동영상 일련의. 예를 들어, sox10-긍정적인 신경 크레스트 셀 12와 30 hpf 사이 craniofacial 지역 (비디오 1, 그림 2)에 신경 튜브의 가장자리에서 마이그레이션합니다. Prosencephalon mesencephalon에서 셀 마이그레이션 등 및 periocular mesenchyme 채우는 개발 눈에 복 부. 또한,이 sox10-긍정적인 세포 frontonasal 프로세스를 형성합니다. rhombencephalon에서 신경 크레스트 세포 ventrally 마이그레이션 하 고 인 두 아치를. Foxd3의 이미징 시간 경과-30와 60 사이 긍정적인 신경 크레스트 셀 hpf 보여주었다 이러한 셀 시 컵 표면 ectoderm 사이 및 눈 균열을 통해 마이그레이션 (비디오 2, 그림 3). 이 foxd3-긍정적인 세포 주위 렌즈를 홍 채 기질을 형성 했다는 설이다.
그림 1 . 설치. A. 오픈 목욕 챔버, 빠른 교환 플랫폼 및 어댑터를 포함 하 여 장치를 장착 하는 태아의 각 구성 요소. B. 오픈 목욕 챔버의 어셈블리입니다. C. 또한 오픈 목욕 실로 2 %agarose 솔루션 (60-70 ° C). D. 형광 현미경 오픈 목욕 챔버에 배아의 배치. E. 태아 (24 hpf) 옆으로 오픈 목욕 실에서 생산 agarose 솔루션의 중앙에 위치. F. 뿐만 아니라 생산 agarose 솔루션의 표면에 미디어의 완전히 오픈 목욕 챔버에 배아를 커버. G. 오픈 목욕 챔버 빠른 교환 플랫폼에 배치 하 고 무대 어댑터에 위치. H. 다중 광자 현미경의 무대 장치를 장착 하는 배아의 배치. I. 레이저 안전 상자입니다. 개방 챔버를 채우는 대 한 슬라이딩 도어 (1 및 2)가 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . Deconvolved 대표 및 다중 광자는 Tg의 시간 경과 영상에서 최대 예상 이미지 (sox10:EGFP) 30 12에서 zebrafish 태아 hpf. Sox10-긍정적인 세포 (점선된 동그라미는 눈) periocular mesenchyme와 frontonasal 과정 (오픈 화살표) prosencephalon (P)와 mesencephalon (M)에서 마이그레이션됩니다. Rhombencephalon (R)에서 Sox10-긍정적인 세포 (닫힌된 화살표) 인 두 아치를 형성 하기 위하여 ventrally 마이그레이션됩니다. 이미지는 기간 동안 매 20 분을 얻은 고 비디오 1을 만드는 데 함께 수 놓은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . Deconvolved 대표 및 최대 예상 이미지는 Tg의 다중 광자 시간 경과 영상에서(foxd3:GFP) 48 24에서 zebrafish 태아 hpf. Foxd3-긍정적인 세포 눈의 앞쪽 챔버에 입력 (별표 나타냅니다 렌즈) 표면 ectoderm 사이의 시 컵 등 ("D")로 셀-후부 ("P") 사분면 앞쪽 ("A")와 복 부 ("V") 사분면 비교. 또한, foxd3-긍정적인 세포 눈 균열을 통해 인접 한 마이그레이션. 이미지는 기간 동안 매 20 분을 얻은 고 비디오 2를 만드는 데 함께 수 놓은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . Deconvolved 대표 및 최대 예상 이미지는 Tg의 다중 광자 시간 경과 영상에서(foxd3:GFP) 60 30에서 zebrafish 태아 hpf. Foxd3-긍정적인 세포 눈의 앞쪽 챔버에 입력 (외부 점선된 원을 상징 눈의 주변 가장자리, 내부 점선된 동그라미 렌즈를 나타냅니다) 표면 ectoderm 사이의 시 컵 등 ("d")로 셀-후부 ("p") 사분면은 앞쪽에 비해 ("a")와 복 부 ("v") 탐. 또한, foxd3-긍정적인 세포 눈 균열을 통해 인접 한 마이그레이션 (흰색 화살표는 마이그레이션 신경 크레스트, 빨간색 파선 정하는 눈 균열). 60 hpf, foxd3-긍정적인 세포 완전히 둘러싸고는 균열의 폐쇄를 나타내는 렌즈 (닫힌된 화살표). 또한, 60에서 hpf, foxd3 또한 표현 되었다 (오픈 화살촉), 대뇌에이 녹음 방송 요인은 신경 크레스트 셀에서의 표현에 연관 되었다. 이미지는 기간 동안 매 20 분을 얻은 고 비디오 3를 만드는 데 함께 수 놓은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 1입니다. 져의 시간 경과 비디오 (sox10:EGFP) 30 12에서 zebrafish 태아 hpf. 눈을 나타냅니다 별표. 이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 2입니다. 져의 시간 경과 비디오 (foxd3:GFP) 48 24에서 zebrafish 태아 hpf. 별표 나타냅니다 렌즈. 별표가 나타냅니다 눈 게를. d, 등 쪽; v, 복 부; p, 후부; a, 앞쪽. 이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 3입니다. 져의 시간 경과 비디오 (foxd3:GFP) 60 30에서 zebrafish 태아 hpf. 별표는 렌즈를 나타냅니다. 화살표는 눈 균열을 나타냅니다. d, 등 쪽; v, 복 부; p, 후부; a, 앞쪽. 이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
다중 광자 시간 경과 영상 과도 하 고 철새 세포 인구의 비보에 추적을 수 있습니다. 이 강력한 기술은 실시간으로 미 발달 과정을 공부 하 사용할 수 있습니다 그리고 현재 연구에이 방법의 결과 신경 크레스트 셀 마이그레이션 및 개발의 현재 지식 향상. 이전 시간 경과 이미징 연구는 일반적으로 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 이용 한다. 29 , 30 , 31 , 32 여기, 우리는 전통적인 confocal 현미경 검사 법에 비해 많은 장점이 있는 다중 광자 기술의 사용을 제시. 다중 광자 현미경 검사 법의 기초가 이다 긴 적외선 파장의 두 광자 fluorophore는 흥분 하는 데 사용 됩니다. 그 결과, 더 적은 산란 및 따라서 감소 배경, 깊은 조직 침투를 사용 하도록 설정, 이미징 깊이 confocal 현미경 검사 법 보다 더 효율적인 탐지와 생물학 조직에 1mm를 초과 달성입니다. 이러한 속성은 또한 phototoxicity를 반복 하 고 자주 이미지 수집 중요 한 고려 사항 감소. 25 , 26 , 27 이 속성에서 2 광자 현미경 수 이미지 전체 기관 준비 및 작은 동물 모델에서 조직 (예: 마우스, 12에서 zebrafish 태아 hpf-현재 연구의 경우). 또한, 이러한 작은 동물 모델 관심의 조직에 지역화 될 수 있는 유전자 인코딩된 형광 단백질의 사용 가능 따라서, 다중 광자 현미경의 사용 크게 시간 경과 실험에 대 한 이미지 수집을 강화할 수 있습니다.
이 프로토콜에 사용 되는 다중 광자 레이저 및 탐지 시스템의 종류에 따라 달라 지는 수많은 단계가 있습니다. 이 프로토콜 대부분 문제가 발생 레이저 설정 및 사용 하는 검출 시스템에 따라 이미지의 수집 합니다. 개별 시스템 및 기술 지원에 대 한 액세스의 작동 지식이 중요 하다. 또한, 이전 경험과 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 문제 해결에 도움이 됩니다. 또한, 초기 시스템 설정 시간이 소요 될 수 있습니다. 그러나 시스템 설정 완료 되 면,, 작은 조정만은 같은 유전자 변형 라인을 사용 하는 경우에 일반적으로 필요한입니다.
현재 연구에서 12와 60 hpf 사이 zebrafish 태아가이 실험을 위해 사용 되었다. 이 나이 범위 동안 배아 agarose에서 쉽게 임베디드 작고 쉽게 tricaine와 마 취 있습니다. 그러나, 태아 성장 될 수 있다 그리고 발달 실험의 길이 따라 지연. 따라서, 배아 실험의 끝에 개최 적절 하 게 되도록 배려를가지고 한다.
다중 광자 시간 경과 영상 뿐만 아니라 zebrafish embryogenesis vivo에서 공부 하는 능력을 강화 하지만 많은 다른 시스템에도 적용 될 수 있다 세포 이동의 고해상도, 실시간 3 차원 시각화를 생성 합니다. Zebrafish 신경 크레스트 셀 마이그레이션 개요 프로토콜에서는,이 기술을 쉽게 적용할 수 있습니다 다른 이미징 목적.
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Disclosures
이 작품은 국립 눈 연구소 건강의 국가 학회 (K08EY022912-01) 및 비전 연구 코어 (P30 EY007003)의 보조금을 통해 재정적으로 지원 되었다.
Acknowledgments
저자는 토마스 실링 친절 하 게 선물 안내 (sox10:eGFP) 물고기와 메리 Halloran 친절 하 게 안내(foxd3:GFP) 물고기 gifting에 대 한 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope - FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
References
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