Summary
En kombination af de avancerede optiske teknikker i laser scanning mikroskopi med lang bølgelængde multi photon fluorescens excitation blev implementeret for at fange høj opløsning, tre-dimensionelle, real-time imaging af neural crest migration i Tg (sox10:EGFP) og Tg (foxd3:GFP) zebrafisk embryoner.
Abstract
Medfødt øje og kraniofaciale anomalier afspejler forstyrrelser i de neurale crest, en forbigående befolkning af vandrende stamceller, der giver anledning til mange celletyper i hele kroppen. Forståelse af neural crest biologi har været begrænset, hvilket afspejler en manglende genetisk tractable modeller, der kan blive undersøgt i vivo og real-time. Zebrafisk er et særlig vigtigt udviklingsmæssige model til at studere vandrende cellepopulationer, f.eks i neurale crest. For at undersøge neurale crest migration ind i tredje øjet, blev en kombination af de avancerede optiske teknikker i laser scanning mikroskopi med lang bølgelængde multi photon fluorescens excitation implementeret for at fange høj opløsning, tre-dimensionelle, real-time videoer af tredje øjet i transgene zebrafisk embryoner, nemlig Tg (sox10:EGFP) og Tg (foxd3:GFP), som sox10 og foxd3 har været vist i adskillige dyremodeller for at regulere tidlige neurale crest differentiering og sandsynligvis repræsenterer markører for neurale crest celler. Multi photon time-lapse imaging blev brugt til at skelne den opførsel og vandrende mønstre af to neurale crest cellepopulationer bidrager til tidlig udvikling af øjet. Denne protokol giver oplysninger til at generere time-lapse videoer under zebrafisk neurale crest migration, som et eksempel, og yderligere kan anvendes til at visualisere den tidlige udvikling af mange strukturer i zebrafisk og andre modelorganismer.
Introduction
Medfødt øjensygdomme kan forårsage barndommen blindhed og er ofte på grund af deformiteter i den kranielle neurale crest. Neurale crest celler er forbigående stamceller, der opstår som følge af neuralrøret og danne talrige væv i hele kroppen. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 neurale crest celler, der stammer fra prosencephalon og mesencephalon, give anledning til knogle og brusk af midface og frontal regioner, og iris, hornhinden, trabekelværket og sclera i den forreste segment af øjet. 4 , 6 , 7 , 8 neurale crest celler fra rhombencephalon form svælg arches, kæbe og hjerte udstrømning tarmkanalen. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 undersøgelser har fremhævet bidrag af neural crest til okulær og periocular udvikling, understreger betydningen af disse celler i hvirveldyr øje udvikling. Faktisk, afbrydelse af neurale crest celler migrering og differentiering føre til kraniofacial og okulær anomalier som observeret i Axenfeld-Rieger-syndrom og Peters Plus syndrom. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 således, en omfattende forståelse af migration, spredning og differentiering af disse neurale crest celler vil give indsigt i kompleksiteten bag medfødt øjensygdomme.
For zebrafisk er en kraftfuld model organisme for at studere okulær udvikling, som strukturerne af zebrafisk øjet ligner deres pattedyr modparter, og mange gener er evolutionært bevaret mellem zebrafisk og pattedyr. 18 , 19 , 20 Desuden zebrafisk embryoner er gennemsigtig og hunkøns, lette visualisering af øjet udvikling i realtid.
Uddybe tidligere offentliggjorte arbejde,6,7,20 vandrende mønstret af neurale crest celler blev beskrevet ved hjælp af multi photon fluorescens time-lapse imaging på transgene zebrafisk linjer mærket med grøn fluorescerende proteiner (NGL) under transcriptional kontrol af SRY (sex-bestemmende region Y)-box 10 (sox10) eller Forkhead boks D3 (foxd3) genet lovgivningsmæssige områder. 21 , 22 , 23 , 24. multi photon fluorescens time-lapse imaging er en kraftfuld teknik, der kombinerer de avancerede optiske teknikker i laser scanning mikroskopi med lang bølgelængde multi photon fluorescens excitation at fange høj opløsning, tre-dimensionelle billeder af prøver markeret med fluorophores. 25 , 26 , 27 anvendelse af multi foton laser har klare fordele over standard Konfokal mikroskopi, herunder øget væv penetration og nedsat fluorophore blegning.
Brug denne metode, var to forskellige populationer af neurale crest celler varierende i timing af migration og vandrende veje diskriminerede, nemlig foxd3-positive neurale crest celler i periocular udkom og udviklende øje og sox10-positive neurale crest celler i det kraniofaciale udkom. Med denne metode, er der indført en tilgang til at visualisere migration af okulær og craniofacial neurale crest migration i zebrafisk, gør det let at observere regulerede neurale crest migration i realtid under udvikling.
Denne protokol giver oplysninger til at generere time-lapse videoer i den tidlige øje udvikling i Tg (sox10:EGFP) og Tg (foxd3:GFP) transgene zebrafisk, som et eksempel. Denne protokol kan anvendes yderligere for høj opløsning, tre-dimensionelle, real-time visualisering af den tidlige udvikling af enhver okulær og craniofacial struktur, afledt af neurale crest celler i zebrafisk. Denne metode kan desuden yderligere anvendes til visualisering af udviklingen af andre væv og organer i zebrafisk og andre dyremodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multi photon fluorescens time-lapse imaging genereret en række videoer, der afslørede migrationsmønstre kraniel neurale crest celler, der giver anledning til kraniofaciale strukturer og anterior segment af øjet i Tg (sox10:EGFP) og Tg (foxd3:GFP) zebrafisk linjer. Som et eksempel vandrer sox10 -positive neurale crest celler mellem 12 og 30 hpf fra kanten af neuralrøret i regionen craniofacial (Video 1, figur 2). Celler fra prosencephalon og mesencephalon vandrer dorsal og ventral at udvikle øjet til at udfylde periocular udkom. Desuden, danner disse sox10 -positive celler frontonasal proces. Neurale crest celler fra rhombencephalon migrere ventrally og give anledning til svælg buer. Time-lapse imaging af foxd3-positive neurale crest celler mellem 30 og 60 hpf viste at disse celler migrerede mellem optik cup og overfladen ectoderm og gennem okulær revne (Video 2, figur 3). Disse foxd3-positive celler coalesced omkring linsen, danner iris stroma.
Figur 1 . Setup. A. hver komponent af embryonet montering apparater, herunder åbne bad kammer, hurtig udveksling platform og fase adapter. B. forsamling af åbne bad kammer. C. tilsætning af 2% Agarosen løsning (60-70 ° C) til den åbne bad afdeling. D. placering af embryo i åbne bad kammer under et mikroskop for fluorescerende. E. Embryo (på 24 hpf) placeret sideværts i midten af polymeriseret Agarosen løsning i open bad kammer. F. tilsætning af medier til overfladen af opløsningen polymeriseret Agarosen helt dække embryo i åbne bad kammer. G. åben bad kammer placeret i hurtig udvekslingsplatform og placeret i fase-adapter. H. placering af embryonet montering apparater på scenen i multi photon mikroskop. I. Laser pengeskab. Skydedøre (1 og 2) til opfyldning af den åbne afdeling er angivet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Repræsentative deconvolved og max-projiceret billeder fra multi photon time-lapse imaging af en Tg (sox10:EGFP) zebrafisk embryo fra 12 til 30 hpf. De sox10 -positive celler migrerede fra prosencephalon (P) og mesencephalon (M) til at udfylde periocular udkom (den stiplede cirkel angiver øjet) og frontonasal proces (åben pil). Sox10 -positive celler fra rhombencephalon (R) overført ventrally til at danne svælg buer (lukket pil). Billeder var der hvert 20 min under tidsrammen og syet sammen for at skabe Video 1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Repræsentant deconvolved og max-projiceret billeder fra multi photon time-lapse imaging af en Tg(foxd3:GFP) zebrafisk embryo fra 24 til 48 hpf. Foxd3 -positive celler i det forreste kammer i øjet (stjerne angiver linse) mellem overfladen ectoderm og optik cup, med flere celler er lokaliseret til den dorsale ("D")-posterior ("P") kvadrant sammenlignet med den forreste ("A"), og ventrale ("V") kvadranter. Derudover migrerede foxd3 -positive celler støder op til og gennem okulær revne. Billeder var der hvert 20 min under tidsrammen og syet sammen for at skabe Video 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Repræsentant deconvolved og max-projiceret billeder fra multi photon time-lapse imaging af en Tg(foxd3:GFP) zebrafisk embryo fra 30 til 60 hpf. Foxd3 -positive celler i det forreste kammer i øjet (yderste stiplede cirkel betegner perifere kanten af øjet, stiplede inderkreds betegner linse) mellem overfladen ectoderm og optik cup, med flere celler er lokaliseret til den dorsale ("d")-posterior ("p") kvadrant sammenlignet med den forreste ("en"), og ventrale ("v") kvadranter. Derudover foxd3 -positive celler migrerede støder op til og gennem okulær revne (hvid pilespids betegner overflytter neurale crest, rød stiplet linje afgrænser okulær revne). På 60 hpf, foxd3-positive celler helt omringet linse (lukket pile), der angiver lukning af revne. Derudover på 60 hpf, foxd3 kom også til udtryk i fotoreceptorer (åben pilespids), som ikke var forbundet med udtryk for denne transskription faktor i neurale crest celler. Billeder var der hvert 20 min under tidsrammen og syet sammen for at skabe Video 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1. Time-lapse video af en Tg (sox10:EGFP) zebrafisk embryo fra 12 til 30 hpf. Stjernen betegner øjet. Venligst klik her for at downloade denne video.
Video 2. Time-lapse video af en Tg (foxd3:GFP) zebrafisk embryo fra 24 til 48 hpf. Stjernen betegner linsen. Stjernen angiver den okulære revne. d, dorsale; v, ventrale; Pedersen, posterior; en anterior. Venligst klik her for at downloade denne video.
Video 3. Time-lapse video af en Tg (foxd3:GFP) zebrafisk embryo fra 30 til 60 hpf. Stjernen angiver linsen. Pilen angiver den okulære revne. d, dorsale; v, ventrale; Pedersen, posterior; en anterior. Venligst klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Multi photon time-lapse imaging giver i vivo sporing af forbigående og vandrende cellepopulationer. Denne kraftfulde teknik kan bruges til at studere embryonale processer i realtid, og i den nuværende undersøgelse, resultaterne af denne metode forbedret den nuværende viden om neurale crest celle migration og udvikling. Tidligere time-lapse imaging studier udnytter typisk Konfokal laser scanning mikroskopi. 29 , 30 , 31 , 32 her, præsenterer vi en multi photon teknik, som har mange fordele frem for traditionelle Konfokal mikroskopi. Grundlaget for multi foton mikroskopi er, at to fotoner af længere infrarøde bølgelængder er brugt til at ophidse fluorophore. Som et resultat, er der mindre spredning og dermed nedsat baggrund, giver dybere væv penetration, at opnå imaging dybder over 1 mm i biologisk væv med mere effektiv påvisning end Konfokal mikroskopi. Disse egenskaber også mindske fototoksicitet, som er en vigtig overvejelse med gentagne og hyppige billede erhvervelse. 25 , 26 , 27 fra disse egenskaber, to-foton mikroskopi kan billedet hele-orgel præparater og væv i små-dyrs modeller, (f.eks. mus, zebrafisk embryoner på 12 hpf - som i tilfældet med den nuværende undersøgelse). Yderligere, disse små dyremodeller aktiverer brugen af genetisk kodet fluorescerende proteiner, som kan være lokaliseret i væv af interesse. Brugen af multi foton mikroskopi kan således i høj grad forbedre image erhvervelse for time-lapse eksperimenter.
Der er mange trin i denne protokol, som afhænger af typen af multi foton laser og detection system bliver brugt. De fleste problemer med denne protokol opstår med laser indstillinger og erhvervelse af billeder baseret på detection system anvendes. Et praktisk kendskab til det enkelte system og adgang til teknisk support er kritisk. Derudover er tidligere erfaringer med Konfokal laser scanning mikroskopi nyttigt til fejlfinding. Den indledende system oprettet kan endvidere være tidskrævende. Men når systemet sat op er afsluttet, kun små justeringer er typisk kræves, når du bruger de samme transgene linjer.
I den foreliggende undersøgelse benyttedes zebrafisk embryoner mellem 12 og 60 hpf for disse eksperimenter. Under denne aldersgruppe er embryoner lille, let indlejret i Agarosen og let bedøvede med tricaine. Men embryonerne kan blive vækst og forsinket udviklingsmæssigt afhængigt af længden af eksperimentet. Derfor, pleje skal tages til at sikre, at embryoet er korrekt iscenesat i slutningen af forsøget.
Multi photon time-lapse imaging giver høj opløsning, tre-dimensionelle, real-time visualisering af celle migration, som ikke kun øger evnen til at studere i vivo zebrafisk embryogenese, men kan også anvendes til mange andre systemer. Selv om den skitserede protokol fokuserer på zebrafisk neurale crest celler migration, kan denne teknik nemt tilpasses til andre billeddiagnostiske formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbejde blev økonomisk støttet gennem tilskud fra National Eye Institute af National Institutes of Health (K08EY022912-01) og Vision forskning Core (P30 EY007003).
Acknowledgments
Forfatterne takker Thomas Schilling for venligt gifting Tg (sox10:eGFP) fisk og Mary Halloran for venligt gifting Tg(foxd3:GFP) fisk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope - FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
References
- Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
- Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-4208 (2005).
- Minoux, M., Rijli, F. M. Molecular mechanisms of cranial neural crest cell migration and patterning in craniofacial development. Development. 137, 2605-2621 (2010).
- Trainor, P. A. Specification of neural crest cell formation and migration in mouse embryos. Sem Cell Dev Biol. 16, 683-693 (2005).
- Johnston, M. C., Noden, D. M., Hazelton, R. D., Coulombre, J. L., Coulombre, A. Origins of avian ocular and periocular tissues. Exp Eye Res. 29, 27-43 (1979).
- Bohnsack, B. L., Kahana, A. Thyroid hormone and retinoic acid interact to regulate zebrafish craniofacial neural crest development. Dev Biol. 373, 300-309 (2013).
- Chawla, B., Schley, E., Williams, A. L., Bohnsack, B. L. Retinoic acid and pitx2 regulate early neural crest survival and migration in craniofacial and ocular development. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. , (2016).
- Trainor, P. A., Tam, P. P. L. Cranial paraxial mesoderm and neural crest cells of the mouse embryo-codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in branchial arches. Development. 121 (8), 2569-2582 (1995).
- Hong, C. S., Saint-Jeannet, J. P. Sox proteins and neural crest development. Sem Cell Dev Biol. 16, 694-703 (2005).
- Steventon, B., Carona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Sem Cell Dev Biol. 16, 647-654 (2005).
- Dressler, S., et al. Dental and craniofacial anomalies associated wth Axenfeld-Rieger syndrome with PITX2 mutation. Case Report Med. , 621984 (2010).
- Ozeki, H., Shirai, S., Ikeda, K., Ogura, Y. Anomalies associated with Axenfeld-Rieger syndrome. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 237 (9), 730-734 (1999).
- Strungaru, M. H., Dinu, I., Walter, M. A. Genotype-phenotype correlations in Axenfeld-Rieger malformation and glaucoma patients with FOXC1 and PITX2 mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 228-237 (2007).
- Tumer, Z., Bach-Holm, D. Axenfeld-Rieger syndrome and spectrum of Pitx2 and Foxc1 mutations. Eur J Hum Genet. 17, 1527-1539 (2009).
- Schoner, K., et al. Hydrocephalus, agenesis of the corpus callosum, and cleft lip/palate represent frequent associations in fetuses with Peters plus syndrome and B3GALTL mutations. Fetal PPS phenotypes, expanded by Dandy Walker cyst and encephalocele. Prenat Diagn. 33 (1), 75-80 (2013).
- Aliferis, K., et al. A novel nonsense B3GALTL mutation confirms Peters plus syndrome in a patient with multiple malformations and Peters anomaly. Ophthalmic Genet. 31 (4), 205-208 (2010).
- Lesnik Oberstein,, S, A., et al. Peters Plus syndrome is caused by mutations in B3GALTL, a putative glycosyltransferase. Am J Hum Genet. 79 (3), 562-566 (2006).
- Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
- Bohnsack, B. L., Kasprick, D., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. A zebrafish model of Axenfeld-Rieger Syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (1), 7-22 (2012).
- Williams, A. L., Eason, J., Chawla, B., Bohnsack, B. L. Cyp1b1 regulates ocular fissure closure through a retinoic acid-independent pathway. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1084-1097 (2017).
- Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neual crest by regulation of Mitf. Dev Biol. 332 (2), 408-417 (2009).
- Dutton, K., Dutton, J. R., Pauliny, A., Kelsh, R. N. A morpholino phenocopy of the colourless mutant. Genesis. 30 (3), 188-189 (2001).
- Dutton, K. A., et al. Zebrafish colourless encodes sox10 and specifies non-ectomesenchymal neural crest fates. Development. 128 (21), 4113-4125 (2001).
- Kucenas, S., Takada, N., Park, H. C., Woodruff, E., Broadie, K., Appel, B. CNS-derived glia ensheath peripheral nerves and mediate motor root development. Nat Neurosci. 11, 143-151 (2008).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Denk, W., Delaney, K. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle developmnt to changes in retinoic acid and insulin-like growth factor signaling. PLoS ONE. 6, e22991 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Laio, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10:kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. J Vis Exp. (79), e50525 (2013).
- Lopez, A. L. R., Garcai, M. D., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Live confocal microscopy of the developing mouse embryonic yolk sac vasculature. Methods Mol Biol. 1214, 163-172 (2015).
- McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4D confocal microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods Enzymol. 476, 351-377 (2010).
