Summary
Сочетание передовых оптических методов лазерной сканирующей микроскопии с длинные волны возбуждения флуоресценции мульти ФОТОН был реализован для захвата изображений с высоким разрешением, трехмерные, реального времени нейронные крест миграции в Tg (sox10:EGFP) и тг (foxd3:GFP) zebrafish эмбриона.
Abstract
Врождённая глаз и черепно-лицевых аномалий отражают сбои в нейронные крест, переходных населения мигрирующих стволовых клеток, которые порождают многочисленные типы клеток по всему телу. Понимание биологии нейронные крест был ограниченным, что отражает отсутствие генетически шансов справиться с возникающими моделей, которые могут быть изучены в естественных условиях и в режиме реального времени. Данио рерио представляет собой особо важное значение развития модель для изучения популяций мигрирующих клеток, например нейронные крест. Для изучения миграции нейронные крест в развивающихся глаз, сочетание передовых оптических методов лазерной сканирующей микроскопии с длиной волны возбуждения флуоресценции мульти ФОТОН был реализован для захвата видео с высоким разрешением, трехмерные, реальном времени развивающихся глаза в трансгенных данио рерио эмбрионов, а именно: Tg (sox10:EGFP) и тг (foxd3:GFP), как sox10 и foxd3 было показано в многочисленных животных моделей для регулирования раннего нейронные крест дифференциации и вероятно представляют маркеры для гребня нейронные клетки. Мульти Фотон покадровой изображения была использована для различить поведение и миграционные процессы двух нейронные крест клеточных популяций способствуют раннему развитию глаз. Этот протокол предоставляет информацию для создания покадровой видео во время миграции данио рерио нейронные крест, как, например и может применяться для визуализации раннего развития многих структур в данио рерио и других модельных организмов.
Introduction
Врожденных глазных болезней может привести к слепоте детство и часто из-за аномалий черепа нейронные крест. Гребень нейронные клетки являются переходные стволовые клетки, которые возникают от нервной трубки и образуют многочисленные тканях по всему телу. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 гребень нейронные клетки, производный от переднего мозга и среднего мозга, привести к кости и хряща средней зоны лица и лобной области, Ирис, роговицы, Трабекулярная сеть, и склеры в переднего сегмента глаза. 4 , 6 , 7 , 8 гребень нейронные клетки от ромбовидный мозг форма, которую Фарингальные арки, челюсти и сердечной отток тракта. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 исследования показали вклад нейронные крест для глазной и Периокулярная развития, подчеркивая важность этих клеток в развитии позвоночных глаз. Действительно нарушению миграции клеток нервной гребень и дифференциации привести к краниофациальных и глазные аномалии наблюдаются в Axenfeld Ригер синдром и синдром плюс Питерс. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 таким образом, полное понимание миграции, пролиферации и дифференцировки клеток эти нейронные крест даст понимание сложностей, лежащих в основе врожденных глазных заболеваний.
Данио рерио представляет собой мощную модель организм для изучения развития глазной, как структуры глаза у рыбок данио похожи на млекопитающих их коллегами, и многие гены эволюционно консервируют между данио рерио и млекопитающих. 18 , 19 , 20 Кроме того, данио рерио эмбрионов являются транспарентными и яйцекладущие, облегчения визуализации развития глаз в режиме реального времени.
Расширение на ранее опубликованные работы,6,7,20 мигрирующих шаблон гребень нейронные клетки был описан с помощью нескольких Фотон флуоресценции покадровой изображений на линиях трансгенных данио рерио, помечены Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) под контролем transcriptional SRY (секс определение региона Y)-коробке 10 (sox10) или Forkhead поле D3 (foxd3) ген регулирования регионов. 21 , 22 , 23 , 24. несколько фотонных флуоресценции покадровой изображений является мощная техника, которая сочетает в себе передовые оптические технологии лазерной сканирующей микроскопии с длиной волны мульти Фотон флуоресценции возбуждения для захвата изображений с высоким разрешением, трехмерные образцов, отмеченных флуорофоров. 25 , 26 , 27 использование лазера мульти Фотон имеет явные преимущества над стандартным confocal микроскопии, в том числе рост тканей проникновения и снижение Флюорофор отбеливания.
С помощью этого метода, два отдельных популяций нейронные крест клеток разного времени миграции и миграционных путей были дискриминации, а именно foxd3-позитивных гребень нейронные клетки в Периокулярная Мезенхима и развивающихся глаз и нейронные крест sox10-положительных клеток в краниофациальных мезенхимы. С помощью этого метода вводится подход к визуализации миграции глазной и черепно-лицевых невральной гребень миграции в данио рерио, что делает его легко наблюдать регулируемых нейронные крест миграции в режиме реального времени во время разработки.
Этот протокол содержит сведения для создания покадровой видео во время раннего развития глаз в тг (sox10:EGFP) и трансгенных данио рерио тг (foxd3:GFP), в качестве примера. Этот протокол может применяться для высокого разрешения, трехмерные, в реальном времени визуализации на ранних стадиях развития любой глазной и краниофациальной структуры, производные от гребня нейронные клетки в данио рерио. Кроме того этот метод также может применяться для визуализации развития других тканей и органов в данио рерио и других животных моделях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мульти Фотон флуоресценции покадровой изображений создаются серию видеофильмов, которые показали миграционных черепной нейронные крест клеток, которые порождают черепно-лицевых структур и переднего сегмента глаза в Tg (sox10:EGFP) и тг (foxd3:GFP) у рыбок данио линии. Например sox10 -положительных гребень нейронные клетки между 12 и 30 hpf мигрируют от края нервной трубки в челюстно-лицевой области (видео 1, рис. 2). Клетки от переднего мозга и среднего мозга мигрировать дорсальной и вентральной развивающихся глаз для заполнения Периокулярная мезенхимы. Кроме того эти sox10 -положительных клеток образуют лобно процесса. Гребень нейронные клетки от ромбовидный мозг мигрируют вентрально и порождают глоточные арки. Промежуток времени, визуализация foxd3-положительных гребень нейронные клетки между 30 и 60 hpf показал, что эти клетки перенесены между глазного бокала и поверхности эктодермы и через глазной щели (2 видео, рис. 3). Эти foxd3-положительных клеток объединились вокруг объектива, образуя стромы радужки.
Рисунок 1 . Установки. A. каждый компонент крепления аппарата, в том числе открытой ванной палатой, быстрого обмена платформы и стадии адаптер эмбриона. B. Ассамблея палаты открытой ванной. C. добавлением 2% раствора агарозы (60-70 ° C) в зале открытой ванной. D. размещение эмбриона в зале открытой ванной под микроскопом флуоресцентные. E. эмбриона (24 hpf) боков расположены в центре решения полимеризованной агарозы в зале открытой ванной. F. Добавление средств массовой информации к поверхности полимеризованной агарозы решения полностью покрывают эмбриона в зале открытой ванной. G. открытой ванной камеры помещают в платформе быстрого обмена и позиционируется в стадии адаптер. H. размещение эмбриона крепления аппарата на сцене мульти Фотон микроскопа. I. лазерный Сейф. Раздвижные двери (1 и 2) для пополнения открытой камеры указаны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Представитель deconvolved и Макс прогнозам изображения из нескольких Фотон покадровой изображений Tg (sox10:EGFP) zebrafish эмбриона от 12 до 30 hpf. Sox10 -положительных клеток мигрировали из переднего мозга (P) и среднего мозга (M) для заполнения Периокулярная Мезенхима (пунктирную окружность обозначает глаз) и лобно процесса (открытые стрелка). Sox10 -положительных клеток от ромбовидный мозг (R) мигрировали вентрально сформировать глоточные арки (закрытая стрелка). Изображения были получены каждые 20 мин в течение сроков и сшиты вместе для создания видео 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Представитель deconvolved и Макс прогнозам изображения из нескольких Фотон покадровой изображений Tg(foxd3:GFP) zebrafish эмбриона от 24 до 48 hpf. Foxd3 -положительных клеток вступил в передней камере глаза (звездочки обозначает объектив) между поверхности эктодермы и глазного бокала, с больше клеток, локализованные в спинной («D»)-задняя квадрант («P») по сравнению с передней («A») и квадрантов брюшной («V»). Кроме того foxd3 -положительных клеток миграции рядом и через глазной щели. Изображения были получены каждые 20 мин в течение сроков и сшиты вместе, чтобы создать видео 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Представитель deconvolved и Макс прогнозам изображения из нескольких Фотон покадровой изображений Tg(foxd3:GFP) zebrafish эмбриона от 30 до 60 hpf. Foxd3 -положительных клеток вступил в передней камере глаза (внешняя пунктирную окружность обозначает периферийных края глаза, пунктирная круг обозначает объектив) между поверхности эктодермы и глазного бокала, с больше клеток, локализованные в спинной («d»)-задняя квадрант («p») по сравнению с передней («») и квадрантов брюшной («v»). Кроме того, миграции рядом и через глазной щели foxd3 -положительных клеток (белая стрелка обозначает перенос нейронные крест, красная пунктирная линия разграничивает глазной щели). На 60 hpf, foxd3-положительных клеток полностью окружили объектив (закрытые стрелки), указывающее закрытия щели. Кроме того, в 60 hpf, foxd3 также была выражена в фоторецепторных клеток (открытые стрелки), который не был связан с выражением этого фактора транскрипции в клетках нервной гребень. Изображения были получены каждые 20 мин в течение сроков и сшиты вместе для создания видео 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Видео 1. Промежуток времени видео тг (sox10:EGFP) zebrafish эмбриона от 12 до 30 hpf. Звездочки обозначает глаз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 2. Промежуток времени видео тг (foxd3:GFP) zebrafish эмбриона от 24 до 48 hpf. Звездочки обозначает объектива. Звездочки обозначает глазной щели. d, спинной; v, вентральной; p, задняя; в передней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 3. Промежуток времени видео тг (foxd3:GFP) zebrafish эмбриона от 30 до 60 hpf. Звездочки обозначает объектива. Стрелка обозначает глазной щели. d, спинной; v, вентральной; p, задняя; в передней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мульти Фотон покадровой изображений позволяет отслеживать в естественных условиях переходных и мигрирующих клеточных популяций. Эта мощная техника может использоваться для исследования эмбриональных процессы в режиме реального времени, и в настоящем исследовании, результаты этого метода расширения текущих знаний гребень нейронные клетки миграции и развития. Предыдущие исследования покадровой изображений обычно используют Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. 29 , 30 , 31 , 32 здесь, мы представляем использование многолетних фотонной техники, которая имеет много преимуществ над традиционными confocal микроскопии. Основой многолетних Фотон микроскопии является, что два фотона больше инфракрасных волн используются для возбуждения Флюорофор. В результате есть меньше рассеяния и, таким образом, снижение фон, позволяя более глубокого проникновения в ткани, достижение изображений глубины, превышающие 1 мм в биологической ткани с более эффективного обнаружения чем confocal микроскопии. Эти свойства также уменьшение Фототоксичность, который является важным фактором с приобретением частые и повторяющиеся изображения. 25 , 26 , 27 из этих свойств, два Фотон микроскопии можно изображения всего орган препараты и ткань в малых животных моделях, (например мыши, данио рерио эмбрионов в 12 hpf - как и в случае настоящего исследования). Кроме того эти небольшие животные модели позволяют использование генетически закодированный флуоресцентных белков, которые могут быть локализованы в тканях интерес. Таким образом использование микроскопии мульти фотон может значительно улучшить получение изображения для покадровой экспериментов.
Есть многочисленные шаги в настоящем Протоколе, которые зависят от типа мульти Фотон лазерной системы и системы обнаружения используется. Большинство проблем с настоящим Протоколом возникают с параметрами лазерного и получение изображений, основанный на системе обнаружения используется. Знание на отдельные системы и доступ к технической поддержки имеют решающее значение. Кроме того предыдущий опыт работы с Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия полезен для устранения неполадок. Кроме того первоначальная система создана может занять много времени. Однако после завершения настройки системы, только небольшие изменения обычно требуются при использовании же трансгенных линий.
В настоящем исследовании данио рерио эмбрионов между 12 и 60 hpf использовались для этих экспериментов. В ходе этой возрастной диапазон эмбрионы малых, легко внедряется в агарозы и легко наркотизированных с tricaine. Однако эмбрионы могут стать рост и отстающих в зависимости от продолжительности эксперимента. Таким образом необходимо позаботиться о том, чтобы обеспечить, что эмбрион надлежащим образом проводится в конце эксперимента.
Промежуток времени визуализации нескольких ФОТОН дает высокого разрешения, трехмерные, в реальном времени визуализации ячейки миграции, который не только усиливает возможности учиться в vivo эмбриогенеза у рыбок данио, но может также применяться для многих других систем. Хотя указывается протокол посвящен данио рерио гребень нейронные клетки миграции, этот метод может быть легко адаптирована для других изображений целей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эта работа была финансовую поддержку через гранты от Национальный глазной институт национальных институтов здравоохранения (K08EY022912-01) и видение исследования Core (P30 EY007003).
Acknowledgments
Авторы благодарят Томас Шиллинг за любезно дар рыбы Tg (sox10:eGFP) и Мэри Хэллоран для любезно дар Tg рыбы(foxd3:GFP) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope - FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
References
- Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
- Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-4208 (2005).
- Minoux, M., Rijli, F. M. Molecular mechanisms of cranial neural crest cell migration and patterning in craniofacial development. Development. 137, 2605-2621 (2010).
- Trainor, P. A. Specification of neural crest cell formation and migration in mouse embryos. Sem Cell Dev Biol. 16, 683-693 (2005).
- Johnston, M. C., Noden, D. M., Hazelton, R. D., Coulombre, J. L., Coulombre, A. Origins of avian ocular and periocular tissues. Exp Eye Res. 29, 27-43 (1979).
- Bohnsack, B. L., Kahana, A. Thyroid hormone and retinoic acid interact to regulate zebrafish craniofacial neural crest development. Dev Biol. 373, 300-309 (2013).
- Chawla, B., Schley, E., Williams, A. L., Bohnsack, B. L. Retinoic acid and pitx2 regulate early neural crest survival and migration in craniofacial and ocular development. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. , (2016).
- Trainor, P. A., Tam, P. P. L. Cranial paraxial mesoderm and neural crest cells of the mouse embryo-codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in branchial arches. Development. 121 (8), 2569-2582 (1995).
- Hong, C. S., Saint-Jeannet, J. P. Sox proteins and neural crest development. Sem Cell Dev Biol. 16, 694-703 (2005).
- Steventon, B., Carona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Sem Cell Dev Biol. 16, 647-654 (2005).
- Dressler, S., et al. Dental and craniofacial anomalies associated wth Axenfeld-Rieger syndrome with PITX2 mutation. Case Report Med. , 621984 (2010).
- Ozeki, H., Shirai, S., Ikeda, K., Ogura, Y. Anomalies associated with Axenfeld-Rieger syndrome. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 237 (9), 730-734 (1999).
- Strungaru, M. H., Dinu, I., Walter, M. A. Genotype-phenotype correlations in Axenfeld-Rieger malformation and glaucoma patients with FOXC1 and PITX2 mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 228-237 (2007).
- Tumer, Z., Bach-Holm, D. Axenfeld-Rieger syndrome and spectrum of Pitx2 and Foxc1 mutations. Eur J Hum Genet. 17, 1527-1539 (2009).
- Schoner, K., et al. Hydrocephalus, agenesis of the corpus callosum, and cleft lip/palate represent frequent associations in fetuses with Peters plus syndrome and B3GALTL mutations. Fetal PPS phenotypes, expanded by Dandy Walker cyst and encephalocele. Prenat Diagn. 33 (1), 75-80 (2013).
- Aliferis, K., et al. A novel nonsense B3GALTL mutation confirms Peters plus syndrome in a patient with multiple malformations and Peters anomaly. Ophthalmic Genet. 31 (4), 205-208 (2010).
- Lesnik Oberstein,, S, A., et al. Peters Plus syndrome is caused by mutations in B3GALTL, a putative glycosyltransferase. Am J Hum Genet. 79 (3), 562-566 (2006).
- Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
- Bohnsack, B. L., Kasprick, D., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. A zebrafish model of Axenfeld-Rieger Syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (1), 7-22 (2012).
- Williams, A. L., Eason, J., Chawla, B., Bohnsack, B. L. Cyp1b1 regulates ocular fissure closure through a retinoic acid-independent pathway. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1084-1097 (2017).
- Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neual crest by regulation of Mitf. Dev Biol. 332 (2), 408-417 (2009).
- Dutton, K., Dutton, J. R., Pauliny, A., Kelsh, R. N. A morpholino phenocopy of the colourless mutant. Genesis. 30 (3), 188-189 (2001).
- Dutton, K. A., et al. Zebrafish colourless encodes sox10 and specifies non-ectomesenchymal neural crest fates. Development. 128 (21), 4113-4125 (2001).
- Kucenas, S., Takada, N., Park, H. C., Woodruff, E., Broadie, K., Appel, B. CNS-derived glia ensheath peripheral nerves and mediate motor root development. Nat Neurosci. 11, 143-151 (2008).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Denk, W., Delaney, K. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle developmnt to changes in retinoic acid and insulin-like growth factor signaling. PLoS ONE. 6, e22991 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Laio, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10:kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. J Vis Exp. (79), e50525 (2013).
- Lopez, A. L. R., Garcai, M. D., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Live confocal microscopy of the developing mouse embryonic yolk sac vasculature. Methods Mol Biol. 1214, 163-172 (2015).
- McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4D confocal microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods Enzymol. 476, 351-377 (2010).
