Summary
Uma combinação das técnicas de microscopia com longo comprimento de onda multi fóton fluorescência de excitação de laser ópticas foi implementada para capturar imagens de alta resolução, tridimensional, em tempo real de migração da crista neural em Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP) zebrafish embriões.
Abstract
Olho congênito e anomalias craniofaciais refletem as interrupções na crista neural, uma população transiente de migratórias células-tronco que dão origem a numerosos tipos de células por todo o corpo. Noções básicas sobre a biologia da crista neural tem sido limitada, refletindo a falta de modelos tractable geneticamente que podem ser estudados em vivo e em tempo real. Zebrafish é um modelo de desenvolvimento particularmente importante para o estudo de populações de células migratórias, tais como a crista neural. Para examinar a migração da crista neural no olho em desenvolvimento, uma combinação das técnicas de microscopia com comprimento de onda longo multi fóton fluorescência de excitação de laser ópticas foi implementada para capturar vídeos de alta resolução, tridimensionais, em tempo real do olho em desenvolvimento em embriões de zebrafish transgênicos, ou seja, Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP), como sox10 e foxd3 tem sido demonstrados em vários modelos animais para regular a diferenciação de crista neural precoce e provavelmente representam marcadores para as células da crista neural. Fóton multi imagem de lapso de tempo foi usada para discernir o comportamento e os padrões migratórios de duas populações de células da crista neural contribuindo para o desenvolvimento inicial do olho. Este protocolo fornece informações para gerar vídeos de lapso de tempo durante a migração da crista neural zebrafish, como exemplo e pode ser aplicado mais para visualizar o desenvolvimento precoce de muitas estruturas no zebrafish e outros organismos-modelo.
Introduction
Doenças congênitas do olho podem causar cegueira de infância e são muitas vezes devido a anomalias da crista neural cranial. Células da crista neural são transitórias células-tronco que surgem a partir do tubo neural e formam numerosos tecidos por todo o corpo. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 as células da crista Neural, derivadas do prosencéfalo e o mesencéfalo, originar o osso e cartilagem da há regiões frontais e a íris, córnea, malha trabecular e esclera no segmento anterior do olho. 4 , 6 , 7 , Células da crista Neural 8 do rombencéfalo forma que arcos da faringe, mandíbula e trato de saída cardíaca. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 estudos evidenciaram as contribuições da crista neural para ocular e periocular desenvolvimento, enfatizando a importância destas células no desenvolvimento do olho de vertebrados. Com efeito, migração de células da crista neural e diferenciação levar à anomalias craniofaciais e oculares como observado na síndrome de Axenfeld-Rieger e síndrome de Plus de Peters. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 assim, uma compreensão abrangente da migração, proliferação e diferenciação dessas células da crista neural irá fornecer insights sobre as complexidades subjacentes doenças oculares congênitas.
O peixe-zebra é um organismo modelo poderoso para estudar o desenvolvimento ocular, como as estruturas do olho zebrafish são semelhantes aos seus homólogos dos mamíferos, e muitos genes são conservados evolutivamente entre zebrafish e mamíferos. 18 , 19 , 20 além disso, zebrafish embriões são transparentes e ovíparos, facilitando a visualização do desenvolvimento do olho em tempo real.
Expansão no trabalho anteriormente publicado,6,7,20 o padrão migratório de células da crista neural foi descrita usando multi fóton fluorescência de lapso de tempo de imagem em linhas de zebrafish transgênicos rotuladas com proteína verde fluorescente (GFP) sob o controle transcricional do SRY (região sexo-determinando Y)-caixa 10 (sox10) ou D3 Forkhead Box regiões reguladoras do gene (foxd3). 21 , 22 , 23 , 24. lapso de tempo imagem multi fóton fluorescência é uma técnica poderosa que combina as avançadas técnicas de ópticas do laser, microscopia com longo comprimento de onda multi fóton fluorescência de excitação para capturar imagens de alta resolução, tridimensionais de espécimes marcados com fluorophores. 25 , 26 , 27 o uso do fóton multi laser tem vantagens distintas sobre microscopia confocal padrão, incluindo o tecido maior penetração e diminuição da fluoróforo branqueamento.
Usando este método, duas populações distintas de células da crista neural variando em tempo de migração e os caminhos migratórios foram discriminadas, ou seja positiva foxd3 crista neural células do mesênquima periocular e olho em desenvolvimento e crista neural de positivo sox10 células da mesênquima craniofacial. Com este método, é introduzida uma abordagem para visualizar a migração de migração ocular e craniofaciais crista neural no zebrafish, tornando-se fácil observar regulamentado crista neural migração em tempo real durante o desenvolvimento.
Este protocolo fornece informações para gerar vídeos de lapso de tempo durante o desenvolvimento precoce de olho no Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP) zebrafish transgênico, por exemplo. Este protocolo pode ser mais aplicado para a visualização de alta resolução, tridimensional, em tempo real do desenvolvimento precoce de qualquer estrutura ocular e craniofacial, derivada de células da crista neural no zebrafish. Além disso, este método ainda pode ser aplicado para a visualização do desenvolvimento de outros tecidos e órgãos no zebrafish e outros modelos animais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Imagem de Time-Lapse multi fóton fluorescência gerou uma série de vídeos que revelaram os padrões de migração das células craniana crista neural que dão origem às estruturas craniofaciais e segmento anterior do olho no Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP) linhas de zebrafish. Por exemplo, sox10células positivas crista neural entre 12 e 30 hpf migram da borda do tubo neural na região craniofacial (Video 1, Figura 2). As células do mesencéfalo e prosencéfalo migram dorsal e ventral para o olho em desenvolvimento para popular a mesênquima periocular. Além disso, essas células positivas sox10 -formam o processo frontonasal. Células da crista neural do rombencéfalo migram ventralmente e dar origem aos arcos da faringe. Lapso de tempo da imagem latente de foxd3-células positivas crista neural entre 30 e 60 hpf mostrou que essas células migraram entre a taça óptica e ectoderma de superfície e através da fissura ocular (Video 2, Figura 3). Esses foxd3-células positivas se uniram ao redor da lente, formando o estroma da íris.
Figura 1 . Instalação. R. cada componente do embrião montagem de aparelhos, incluindo a câmara de banho aberta, adaptador de plataforma e palco de troca rápida. B. montagem da câmara de banho aberta. C. adição de solução de agarose 2% (60-70 ° C) para a câmara de banho aberta. M. colocação do embrião na câmara de banho aberto sob um microscópio fluorescente. E. embrião (às 24 hpf) posicionados lateralmente no centro da solução de agarose polimerizada na câmara de banho aberta. F. adição de mídia para a superfície da solução de agarose polimerizado para cobrir completamente o embrião na câmara de banho aberta. G. câmara de banho aberto colocado na plataforma de troca rápida e posicionado no adaptador de palco. H. colocação do embrião aparelho de montagem no palco do microscópio multi fóton. I. caixa de segurança de Laser. As portas deslizantes (1 e 2) para voltar a encher a câmara aberta são indicadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Representante deconvolved e max projectadas imagens de fóton multi imagem lapso de tempo de um Tg (sox10:EGFP) embrião de zebrafish de 12 para 30 hpf. As células positivas sox10migraram o prosencéfalo (P) e o mesencéfalo (M) para preencher o mesênquima periocular (o círculo pontilhado denota o olho) e processo frontonasal (seta aberta). Sox10 -células positivas desde o rombencéfalo (R) migraram ventralmente para formar os arcos da faringe (seta fechada). Imagens foram obtidas a cada 20 min durante o período de tempo e costuradas juntas para criar vídeo 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Representante deconvolved e max projectadas imagens de fóton multi imagem lapso de tempo de um Tg(foxd3:GFP) embrião de zebrafish de 24 a 48 hpf. Foxd3 -células positivas entradas em câmara anterior do olho (o asterisco indica lente) entre o ectoderma superficial e taça óptica, com mais células localizadas para o dorsal ("D")-quadrante posterior de ("P") em comparação com o anterior ("A") e ventrais quadrantes ("V"). Além disso, o foxd3 -células positivas migraram adjacentes para e através da fissura ocular. Imagens foram obtidas a cada 20 min durante o período de tempo e costuradas juntas para criar vídeo 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Representante deconvolved e max projectadas imagens de fóton multi imagem lapso de tempo de um Tg(foxd3:GFP) embrião de zebrafish de 30 a 60 hpf. Foxd3 -células positivas entradas em câmara anterior do olho (círculo pontilhado exterior denota bordas periféricas do olho, círculo pontilhado indica lente) entre o ectoderma superficial e taça óptica, com mais células localizadas para o dorsal ("d")-quadrante posterior de ("p") em comparação com o anterior ("a") e quadrantes ventral ("v"). Além disso, o foxd3 -células positivas migraram adjacentes para e através da fissura ocular (ponta de seta branca denota migrando crista neural, linha tracejada vermelha demarca fissura ocular). Em 60 hpf, foxd3-células positivas completamente rodeado da lente (fechado as setas), indicando o encerramento da fissura. Além disso, em 60 hpf, foxd3 também foi expressa em fotorreceptores (seta aberta), que não esteve associada a expressão deste fator de transcrição em células da crista neural. Imagens foram obtidas a cada 20 min durante o período de tempo e costuradas juntas para criar o vídeo 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo de 1. Time Lapse vídeo de um Tg (sox10:EGFP) embrião de zebrafish de 12 para 30 hpf. o asterisco indica o olho. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 2. Time Lapse vídeo de um Tg (foxd3:GFP) embrião de zebrafish de 24 a 48 hpf. o asterisco denota a lente. O asterisco indica a fissura ocular. d, dorsal; v, ventral; p, posterior; a, anterior. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo de 3. Time Lapse vídeo de um Tg (foxd3:GFP) embrião de zebrafish de 30 a 60 hpf. O asterisco indica a lente. A seta indica a fissura ocular. d, dorsal; v, ventral; p, posterior; a, anterior. Clique aqui para baixar este vídeo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fóton multi imagem de lapso de tempo permite o rastreamento em vivo de populações de células migratórias e transitória. Esta técnica poderosa pode ser usada para estudar processos embrionários em tempo real, e no presente estudo, os resultados deste método aprimorado o conhecimento atual da migração de células da crista neural e do desenvolvimento. Estudos de imagiologia lapso de tempo anteriores normalmente utilizam laser confocal, microscopia eletrônica de varredura. 29 , 30 , 31 , 32 aqui, apresentamos o uso de uma técnica de múltiplos fóton, que tem muitas vantagens sobre o tradicional microscopia confocal. A base do fóton multi microscopia é que dois fótons de comprimentos de onda infravermelhos são usados para excitar o fluoróforo. Como resultado, há menos dispersão e, portanto, diminuição de fundo, permitindo a penetração mais profunda do tecido, alcançar profundidades de imagem superior a 1 mm em tecidos biológicos com deteção mais eficiente do que a microscopia confocal. Essas propriedades também diminuem fototoxicidade, que é uma consideração importante com a aquisição de imagens repetidas e frequentes. 25 , 26 , 27 dessas propriedades, dois fotões microscopia pode imagem preparações todo-órgão e tecido em modelos animais de pequeno, (por exemplo, ratos, embriões de peixe-zebra em 12 hpf - como no caso do presente estudo). Além disso, esses modelos animais pequenos permitir o uso de proteínas fluorescentes geneticamente codificados, que pode ser localizada no tecido de interesse. Assim, o uso da microscopia de fóton multi pode aumentar consideravelmente a aquisição de imagens para experimentos de lapso de tempo.
Existem várias etapas neste protocolo, que dependem do tipo de sistema de laser e deteção de multi fóton sendo usado. A maioria dos problemas com este protocolo surgem com as configurações de laser e aquisição de imagens com base no sistema de deteção usado. O conhecimento do funcionamento do sistema individual e acesso ao suporte técnico são críticos. Além disso, a experiência anterior com laser confocal, microscopia eletrônica de varredura é útil para solução de problemas. Além disso, o sistema inicial estabelecido pode ser demorado. No entanto, uma vez que o sistema estabelecido é concluído, apenas pequenos ajustes são normalmente necessários ao usar as mesmas linhas transgénicas.
No presente estudo, embriões de zebrafish entre 12 e 60 hpf foram usados para estes experimentos. Durante esta faixa etária, os embriões são pequenas, facilmente incorporado em agarose e prontamente anestesiados com metanosulfonato. No entanto, os embriões podem tornar-se crescimento e atraso dependendo do comprimento do experimento. Portanto, deve-se ter cuidado para garantir que o embrião é apropriadamente encenado no final do experimento.
Imagem de Time-Lapse multi fóton produz visualização de alta resolução, tridimensional, em tempo real de migração celular, que não só melhora a capacidade de estudar na vivo zebrafish embriogênese, mas também pode ser aplicada a muitos outros sistemas. Embora o protocolo descrito centra-se na migração de células do zebrafish crista neural, esta técnica pode ser facilmente adaptada para outros fins de imagem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Este trabalho foi apoiado financeiramente através de subsídios do Instituto Nacional do olho dos National Institutes of Health (K08EY022912-01) e núcleo de pesquisa de visão (P30 EY007003).
Acknowledgments
Os autores graças a Thomas Schilling para gentilmente gifting o peixe Tg (sox10:eGFP) e Mary Halloran para gentilmente gifting peixe Tg(foxd3:GFP) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope - FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
References
- Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
- Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-4208 (2005).
- Minoux, M., Rijli, F. M. Molecular mechanisms of cranial neural crest cell migration and patterning in craniofacial development. Development. 137, 2605-2621 (2010).
- Trainor, P. A. Specification of neural crest cell formation and migration in mouse embryos. Sem Cell Dev Biol. 16, 683-693 (2005).
- Johnston, M. C., Noden, D. M., Hazelton, R. D., Coulombre, J. L., Coulombre, A. Origins of avian ocular and periocular tissues. Exp Eye Res. 29, 27-43 (1979).
- Bohnsack, B. L., Kahana, A. Thyroid hormone and retinoic acid interact to regulate zebrafish craniofacial neural crest development. Dev Biol. 373, 300-309 (2013).
- Chawla, B., Schley, E., Williams, A. L., Bohnsack, B. L. Retinoic acid and pitx2 regulate early neural crest survival and migration in craniofacial and ocular development. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. , (2016).
- Trainor, P. A., Tam, P. P. L. Cranial paraxial mesoderm and neural crest cells of the mouse embryo-codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in branchial arches. Development. 121 (8), 2569-2582 (1995).
- Hong, C. S., Saint-Jeannet, J. P. Sox proteins and neural crest development. Sem Cell Dev Biol. 16, 694-703 (2005).
- Steventon, B., Carona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Sem Cell Dev Biol. 16, 647-654 (2005).
- Dressler, S., et al. Dental and craniofacial anomalies associated wth Axenfeld-Rieger syndrome with PITX2 mutation. Case Report Med. , 621984 (2010).
- Ozeki, H., Shirai, S., Ikeda, K., Ogura, Y. Anomalies associated with Axenfeld-Rieger syndrome. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 237 (9), 730-734 (1999).
- Strungaru, M. H., Dinu, I., Walter, M. A. Genotype-phenotype correlations in Axenfeld-Rieger malformation and glaucoma patients with FOXC1 and PITX2 mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 228-237 (2007).
- Tumer, Z., Bach-Holm, D. Axenfeld-Rieger syndrome and spectrum of Pitx2 and Foxc1 mutations. Eur J Hum Genet. 17, 1527-1539 (2009).
- Schoner, K., et al. Hydrocephalus, agenesis of the corpus callosum, and cleft lip/palate represent frequent associations in fetuses with Peters plus syndrome and B3GALTL mutations. Fetal PPS phenotypes, expanded by Dandy Walker cyst and encephalocele. Prenat Diagn. 33 (1), 75-80 (2013).
- Aliferis, K., et al. A novel nonsense B3GALTL mutation confirms Peters plus syndrome in a patient with multiple malformations and Peters anomaly. Ophthalmic Genet. 31 (4), 205-208 (2010).
- Lesnik Oberstein,, S, A., et al. Peters Plus syndrome is caused by mutations in B3GALTL, a putative glycosyltransferase. Am J Hum Genet. 79 (3), 562-566 (2006).
- Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
- Bohnsack, B. L., Kasprick, D., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. A zebrafish model of Axenfeld-Rieger Syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (1), 7-22 (2012).
- Williams, A. L., Eason, J., Chawla, B., Bohnsack, B. L. Cyp1b1 regulates ocular fissure closure through a retinoic acid-independent pathway. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1084-1097 (2017).
- Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neual crest by regulation of Mitf. Dev Biol. 332 (2), 408-417 (2009).
- Dutton, K., Dutton, J. R., Pauliny, A., Kelsh, R. N. A morpholino phenocopy of the colourless mutant. Genesis. 30 (3), 188-189 (2001).
- Dutton, K. A., et al. Zebrafish colourless encodes sox10 and specifies non-ectomesenchymal neural crest fates. Development. 128 (21), 4113-4125 (2001).
- Kucenas, S., Takada, N., Park, H. C., Woodruff, E., Broadie, K., Appel, B. CNS-derived glia ensheath peripheral nerves and mediate motor root development. Nat Neurosci. 11, 143-151 (2008).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Denk, W., Delaney, K. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle developmnt to changes in retinoic acid and insulin-like growth factor signaling. PLoS ONE. 6, e22991 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Laio, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10:kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. J Vis Exp. (79), e50525 (2013).
- Lopez, A. L. R., Garcai, M. D., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Live confocal microscopy of the developing mouse embryonic yolk sac vasculature. Methods Mol Biol. 1214, 163-172 (2015).
- McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4D confocal microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods Enzymol. 476, 351-377 (2010).
