Summary
Eine Kombination der erweiterten optischen Techniken der Laser-scanning-Mikroskopie mit langen Wellenlänge Multi-Photonen Fluoreszenzanregung wurde implementiert, um hochauflösende, dreidimensionale, Echtzeit-Bildgebung der Neuralleiste Migration mit Tg (Sox10:EGFP) und Tg (Foxd3:GFP) Zebrafish Embryos zu erfassen.
Abstract
Angeborene Auge und kraniofaziale Anomalien reflektieren Störungen in der Neuralleiste, eine vorübergehende Bevölkerung von wandernden Stammzellen, die Anlass zu zahlreichen Zelltypen im ganzen Körper. Verständnis der Biologie der Neuralleiste beschränkt wurde, spiegelt einen Mangel an genetisch gefügig Modelle, die studierte in Vivo und in Echtzeit. Zebrafisch ist ein besonders wichtig Entwicklungs Modell für das Studium wandernde Zellenbevölkerungen, wie der Neuralleiste. Um Neuralleisten-Migration in der dritten Auge zu untersuchen, wurde eine Kombination der erweiterten optischen Techniken der Laser-scanning-Mikroskopie mit langwelligen Multi-Photonen Fluoreszenzanregung implementiert, um hochauflösende, dreidimensionale, Echtzeit-Videos des dritten Auges in den transgenen Zebrafish Embryos, nämlich Tg (Sox10:EGFP) und Tg (Foxd3:GFP), zu erfassen wie sox10 und foxd3 , in zahlreichen Tiermodellen gezeigt haben zu frühen Neuralleiste Differenzierung regulieren und wahrscheinlich Marker für Zellen der Neuralleiste darstellen. Multi-Photonen Zeitraffer Bildgebung wurde verwendet, um das Verhalten und die Migrationsmuster zwei Neuralleiste Zellpopulationen zur frühen Augenentwicklung zu erkennen. Dieses Protokoll enthält Informationen zur Erzeugung von Zeitraffer-Videos während der Zebrafisch Neuralleiste Migration als Beispiel und kann weiter angewendet werden, um die frühe Entwicklung von vielen Strukturen in dem Zebrafisch und sonstige Modellorganismen zu visualisieren.
Introduction
Angeborene Augenkrankheiten können dazu führen, dass Blindheit im Kindesalter und sind häufig durch Anomalien der kranialen Neuralleiste. Zellen der Neuralleiste sind vorübergehende Stammzellen, die aus dem Neuralrohr entstehen und bilden zahlreiche Gewebe im gesamten Körper. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 Zellen der Neuralleiste, Prosencephalon und Mittelhirnes, abgeleitet ergeben sich die Knochen und Knorpel des Mittelgesichts und frontalen Regionen, und die Iris, Hornhaut, trabekuläre Geflecht und Sklera im vorderen Bereich des Auges. 4 , 6 , 7 , 8 Neuralleiste Zellen aus Rhombencephalon Form, die den Rachen Bögen, Kiefer und kardiale Ausflusstrakt. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 Studien haben die Beiträge von der Neuralleiste, okuläre und Periorbitalregion Entwicklung hervorgehoben, betonend, wie wichtig dieser Zellen im vertebrate Augenentwicklung. In der Tat, Störung der Neuralleiste Zellwanderung und Differenzierung führen zu okuläre und kraniofaziale Anomalien wie in Axenfeld-Rieger-Syndrom und Peters-Plus-Syndrom festgestellt. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 so, wird ein umfassendes Verständnis von Migration, Proliferation und Differenzierung dieser Zellen der Neuralleiste Einblick in die Komplexität der zugrunde liegenden angeborene Augenkrankheiten, zu schaffen.
Der Zebrabärbling ist ein leistungsfähiges Modellorganismus für okuläre Entwicklung zu studieren, wie die Strukturen des Auges Zebrafisch Pendants Säugetier-ähneln und viele Gene evolutionär zwischen Zebrafisch und Säugetiere konserviert sind. 18 , 19 , Darüber hinaus sind 20 Zebrafisch-Embryonen transparent und ovipar, erleichtert die Visualisierung der Augenentwicklung in Echtzeit.
Erweiterung auf zuvor veröffentlichte Arbeit,6,7,20 das wandernde Muster der Zellen der Neuralleiste wurde beschrieben mit Multi-Photonen Fluoreszenz Zeitraffer imaging in transgenen Zebrafisch Zeilen beschriftet mit grün fluoreszierendes Protein (GFP) von SRY (Geschlecht-Bestimmung der Region Y) transcriptional kontrolliert-Box 10 (sox10) oder Forkhead-Box-D3 (foxd3) gen regulatorischen Regionen. 21 , 22 , 23 , 24. Zeitraffer Multi-Photonen-Fluoreszenz-Bildgebung ist eine leistungsstarke Technik, die die fortschrittliche optische Techniken der Laser-scanning-Mikroskopie mit langen Wellenlänge Multi-Photonen Fluoreszenzanregung hochauflösende, dreidimensionale Aufnahmen der Proben mit dem Stichwort Fluorophore kombiniert. 25 , 26 , 27 die Verwendung von Multi-Photonen-Laser hat deutliche Vorteile gegenüber standard konfokalen Mikroskopie, einschließlich erhöhte Gewebe eindringen und verminderte Fluorophore bleichen.
Mit dieser Methode wurden zwei verschiedene Populationen von Zellen der Neuralleiste unterschiedlicher Zeitpunkt der Migration und wandernde Wege Neuralleiste diskriminierte, nämlich foxd3-positiven Zellen in der Periorbitalregion Mesenchym und entwickelnde Auge und Neuralleiste sox10-positiven Zellen in der kraniofazialen Mesenchym. Mit dieser Methode wird ein Konzept für die Migration von okulären und kraniofaziale Neuralleiste Migration im Zebrafisch visualisieren eingeführt, macht es einfach, regulierten Neuralleiste Migration in Echtzeit während der Entwicklung zu beobachten.
Dieses Protokoll enthält Informationen zur Erzeugung von Zeitraffer-Videos während der frühen Augenentwicklung in Tg (Sox10:EGFP) und transgenen Zebrafisch Tg (Foxd3:GFP), als Beispiel. Dieses Protokoll kann weiter für die hochauflösende, dreidimensionale, Echtzeit-Visualisierung der frühen Entwicklung der okulären und kraniofaziale Struktur abgeleitet aus Zellen der Neuralleiste im Zebrafisch angewendet werden. Darüber hinaus kann diese Methode für die Darstellung der Entwicklung der anderen Gewebe und Organe im Zebrafisch und anderen Tiermodellen weiter angewendet werden.
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Representative Results
Time-Lapse Multi-Photonen-Fluoreszenz-Bildgebung erzeugt eine Reihe von Videos, die die Migrationsmuster der kranialen Neuralleiste Zellen aufgedeckt, die zu der kraniofazialen Strukturen und vorderen Segments des Auges in der Tg (Sox10:EGFP) und Tg (Foxd3:GFP) Zebrafisch Linien führen. Als Beispiel Wandern sox10 -positive Neuralleiste Zellen zwischen 12 und 30 hpf vom Rand des Neuralrohrs in der kraniofazialen Region (Video 1, Abbildung 2). Der Zellen aus dem Prosencephalon und Mittelhirnes Wandern dorsalen und ventralen entwickelnde Auge zum Auffüllen der Periorbitalregion Mesenchym. Darüber hinaus bilden diese sox10 -positiven Zellen des frontonasalen-Prozesses. Zellen der Neuralleiste aus der Rhombencephalon ventral zu migrieren und geben Anlass zu der pharyngealen Bögen. Time-Lapse Bildgebung des foxd3-positive Neuralleiste Zellen zwischen 30 und 60 hpf hat gezeigt, dass diese Zellen zwischen der Optik-Cup und der Oberfläche Ektoderm und durch das Okular Fissur migriert (Video 2, Abbildung 3). Diese foxd3-positiven Zellen verschmolzen, um das Objektiv, das Iris-Stroma bilden.
Abbildung 1 . Richten Sie ein. A. jede Komponente des Embryos Einbau Apparate, einschließlich der offenen Bad Kammer, schnellen Austausch-Plattform und Bühne-Adapter. B. Montage der offenen Bad Kammer. C. Zusatz von 2 % Agarose-Lösung (60-70 ° C) an die offenen Bad Kammer. D. Platzierung des Embryos in der offenen Bad Kammer unter dem Fluoreszenz-Mikroskop. E. Embryo (bei 24 hpf) in der Mitte der polymerisierten Agarose-Lösung in der offenen Bad Kammer seitlich positioniert. F. Zusatz von Medien an die Oberfläche der polymerisierten Agarose-Lösung auf den Embryo in der offenen Bad Kammer vollständig zu bedecken. G. offenes Bad Kammer platziert in der schnellen Austausch-Plattform und an der Bühne Adapter positioniert. H. Platzierung des Embryos Einbau Apparate auf der Bühne des Multi-Photonen-Mikroskop. I. Laser Safe. Die Schiebetüren (1 und 2) zum Nachfüllen der offenen Kammer sind angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Vertreter deconvolved und Max projiziert Bilder aus Multi-Photonen Zeitraffer Bildgebung ein TG (Sox10:EGFP) Zebrafischembryo von 12 bis 30 hpf. Die sox10 -positiven Zellen wanderten aus den Prosencephalon (P) und Mittelhirnes (M) zum Auffüllen der Periorbitalregion Mesenchym (die gestrichelte Kreis kennzeichnet das Auge) und frontonasalen (offene Pfeil). Sox10 -positiven Zellen aus Rhombencephalon (R) migriert, ventral um den Rachenraum Bögen (geschlossene Pfeil) zu bilden. Bilder wurden alle 20 Minuten während des Zeitrahmens erhalten und erstellen Video 1 zusammengenäht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Vertreter deconvolved und Max projiziert Bilder aus Multi-Photonen Zeitraffer Bildgebung ein TG(Foxd3:GFP) Zebrafischembryo von 24 bis 48 hpf. Foxd3 -positiven Zellen eingegeben in die Vorderkammer des Auges (Sternchen kennzeichnet Objektiv) zwischen der Oberfläche Ektoderm und Optik-Pokal, mit mehr Zellen lokalisiert an der dorsalen ("D")-posterior Quadrant ("P") im Vergleich mit dem vorderen ("A") und ventralen ("V") Quadranten. Darüber hinaus wanderten foxd3 -positiven Zellen neben und durch das Okular Fissur. Bilder wurden alle 20 Minuten während des Zeitrahmens erhalten und erstellen Video 2 zusammengenäht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Vertreter deconvolved und Max projiziert Bilder aus Multi-Photonen Zeitraffer Bildgebung ein TG(Foxd3:GFP) Zebrafischembryo von 30 bis 60 hpf. Foxd3 -positiven Zellen eingegeben in die Vorderkammer des Auges (äußeren gestrichelten Kreis kennzeichnet peripheren Kanten des Auges, gepunkteter Kreis kennzeichnet Objektiv) zwischen der Oberfläche Ektoderm und Optik-Pokal, mit mehr Zellen lokalisiert an der dorsalen ("d")-posterior Quadrant ("p") im Vergleich mit der vorderen ("a") und Ventral ("V") Quadranten. Darüber hinaus foxd3 -positiven Zellen neben und durch das Okular Fissur migriert (weiße Pfeilspitze bezeichnet Migration Neuralleiste, rote gestrichelte Linie abgrenzt okuläre Fissur). Bei 60 hpf, foxd3-positiven Zellen vollständig umkreist das Objektiv (geschlossenen Pfeile), unter Angabe der Schließung des Risses. Darüber hinaus bei 60 hpf, foxd3 drückte sich auch in Photorezeptoren (offene Pfeilspitze), die war nicht verbunden mit dem Ausdruck dieser Transkriptionsfaktor in Zellen der Neuralleiste. Bilder wurden alle 20 Minuten während des Zeitrahmens erhalten und erstellen Video 3 zusammengenäht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Video 1. Zeitraffer-Video von einem Tg (Sox10:EGFP) Zebrafischembryo von 12 bis 30 hpf. Das Sternchen steht für das Auge. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.
Video 2. Zeitraffer-Video von einem Tg (Foxd3:GFP) Zebrafischembryo von 24 bis 48 hpf. Das Sternchen steht für das Objektiv. Das Sternchen kennzeichnet die okuläre Fissur. d, dorsal; V, ventralen; p, posterior; a, anterior. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.
Video 3. Zeitraffer-Video von einem Tg (Foxd3:GFP) Zebrafischembryo von 30 bis 60 hpf. Das Sternchen steht für das Objektiv. Der Pfeil kennzeichnet die okuläre Fissur. d, dorsal; V, ventralen; p, posterior; a, anterior. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.
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Discussion
Multi-Photonen-Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht die in Vivo Verfolgung von Transienten und wandernden Zellpopulationen. Diese leistungsstarke Technik kann verwendet werden, um embryonale Prozesse in Echtzeit zu studieren, und in der vorliegenden Studie, die Ergebnisse dieser Methode erweitert das aktuelle Wissen der Neuralleiste Zelle Migration und Entwicklung. Time-Lapse bildgebende Studien nutzen in der Regel konfokale Laser-scanning-Mikroskopie. 29 , 30 , 31 , 32 hier präsentieren wir Ihnen die Nutzung einer Multi-Photonen-Technik, hat viele Vorteile gegenüber traditionellen konfokalen Mikroskopie. Die Basis der Multi-Photonen-Mikroskopie ist, dass zwei Photonen des längeren Infrarot-Wellenlängen verwendet werden, um das Fluorophor begeistern. Dadurch gibt es weniger Streuung und damit verringerte Hintergrund, ermöglicht tieferes Gewebe eindringen, bildgebende Tiefen von mehr als 1 mm im biologischen Gewebe mit effizienter Erkennung als konfokalen Mikroskopie zu erreichen. Diese Eigenschaften verringern auch Phototoxizität, ist eine wichtige Überlegung mit wiederholten und häufige Bildaufnahme. 25 , 26 , 27 von diesen Eigenschaften zwei-Photonen-Mikroskopie kann Bild ganz-Orgel Vorbereitungen und Gewebe im kleinen Tiermodelle (z.B. Mäuse, Zebrafisch-Embryonen bei 12 hpf - wie im Fall der vorliegenden Studie). Darüber hinaus ermöglichen diese kleiner Tiermodelle genetisch codierte fluoreszierende Proteine, die in das Gewebe des Interesses lokalisiert werden kann. So kann die Verwendung von Multi-Photonen-Mikroskopie Bilderfassung für Zeitraffer Experimente erheblich verbessern.
Es gibt zahlreiche Schritte in diesem Protokoll, abhängig von der Art der Multi-Photonen-Laser und Erkennung System verwendet wird. Die meisten Probleme mit diesem Protokoll ergeben sich mit dem Lasereinstellungen und Erwerb der Bilder auf dem Detektionssystem verwendet. Grundkenntnisse des individuellen Systems und der Zugang zum technischen Support sind entscheidend. Frühere Erfahrungen mit konfokale Laser-scanning-Mikroskopie ist darüber hinaus hilfreich zur Fehlersuche. Darüber hinaus kann das Ausgangssystem richten Sie zeitaufwändig sein. Sobald das System eingerichtet abgeschlossen ist, sind jedoch nur kleine Anpassungen in der Regel erforderlich bei der Verwendung der gleichen transgenen Linien.
In der vorliegenden Studie wurden Zebrafisch-Embryonen zwischen 12 und 60 hpf für diese Experimente verwendet. Während dieser Altersgruppe sind die Embryonen klein, leicht in Agarose eingebettet und mit Tricaine leicht betäubt. Jedoch können die Embryonen Wachstum und Entwicklungsverzögerungen abhängig von der Länge des Experiments. Daher muss darauf geachtet werden, um sicherzustellen, dass der Embryo am Ende des Experiments entsprechend inszeniert wird.
Multi-Photonen Zeitraffer Imaging liefert hochauflösende, dreidimensionale, Echtzeit-Visualisierung der Zellwanderung, die nicht nur verbessert die Fähigkeit, in Vivo Zebrafisch Embryogenese zu studieren, sondern kann auch auf vielen anderen Systemen angewendet werden. Obwohl die beschriebenen Protokoll auf Zebrafisch Neuralleiste Zellwanderung konzentriert, kann diese Technik für andere bildgebende Zwecke problemlos angepasst werden.
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Disclosures
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Eye Institute der National Institutes of Health (K08EY022912-01) und Vision Forschung Core (P30 EY007003) finanziell unterstützt.
Acknowledgments
Die Autoren danken Thomas Schilling für freundlicherweise gifting Tg (Sox10:eGFP) Fisch und Mary Halloran für freundlicherweise gifting Tg(Foxd3:GFP) Fisch.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope - FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
References
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