Summary
Une combinaison des techniques optiques avancées de lecture avec excitation de fluorescence multi-photons longue longueur d’onde de laser a été mis en œuvre pour capturer l’imagerie haute résolution, en trois dimensions, en temps réel de la migration de la crête neurale en Tg (sox10:EGFP) et les embryons de poissons zèbres Tg (foxd3:GFP).
Abstract
L’oeil congénitales et des anomalies cranio-faciales reflètent les perturbations dans la crête neurale, une population nomade de cellules souches migratrices qui donnent lieu à nombreux types de cellules dans tout le corps. Comprendre la biologie de la crête neurale a été limité, ce qui reflète un manque de modèles génétiquement tractable pouvant être étudié in vivo et en temps réel. Poisson zèbre est un modèle de développement particulièrement important pour l’étude des populations de cellules migratrices, comme la crête neurale. Afin d’examiner la migration de la crête neurale dans le œil en voie de développement, une combinaison des techniques optiques avancées de lecture avec excitation de fluorescence multi-photons de grande longueur d’onde de laser a été mis en place pour capturer des vidéos de haute résolution, en trois dimensions, en temps réel de le œil en développement chez les embryons de poisson-zèbre transgéniques, nommément Tg (sox10:EGFP) et Tg (foxd3:GFP), comme sox10 et foxd3 ont été présentés dans plusieurs modèles animaux de réglementer une différenciation précoce crête neurale et représentent probablement des marqueurs de cellules neurales de crête. Les Time-lapse imagerie multiphotonique servait à discerner le comportement et les habitudes migratoires des deux populations de cellules neurales de crête contribuant au développement d’oeil au début. Ce protocole fournit des informations pour générer des vidéos time-lapse pendant la migration de poisson-zèbre de crête neurale, à titre d’exemple et peut être davantage appliqué pour visualiser le début du développement de nombreuses structures dans le poisson-zèbre et autres organismes modèles.
Representative Results
L’imagerie de fluorescence multi-photons Time-lapse a généré une série de vidéos qui a révélé les patrons de migration des cellules de la crête neurale crânienne qui donnent lieu à des structures cranio-faciales et les segment antérieur de le œil dans le Tg (sox10:EGFP) et Tg (foxd3:GFP) lignes de poisson-zèbre. À titre d’exemple, sox10 -cellules neurales de crête positive entre 12 et 30 hpf migrent du bord du tube neural dans la région cranio-faciale (Video 1, Figure 2). Les cellules du prosencéphale et mésencéphale migrent dorsale et ventrale à le œil en développement pour remplir le mésenchyme périoculaire. En outre, ces cellules positives sox10forment le processus fronto. Les cellules neurales de crête du rhombencéphale migrent sur le ventre et donnent lieu à des arcs pharyngiens. Time-lapse imagerie de foxd3-cellules neurales de crête positive entre 30 et 60 hpf ont montré que ces cellules migrent entre la cupule optique et l’ectoderme de surface et par la fissure oculaire (Video 2, Figure 3). Ces foxd3-cellules positives se regroupaient autour de la lentille, formant le stroma de l’iris.
Figure 1 . Programme d’installation. A. chaque composant de l’embryon à l’appareil, y compris la salle de bain, adaptateur échange rapide de plate-forme et les étapes de montage. B. l’Assemblée de la chambre de bain. C. Addition de la solution d’agarose à 2 % (60-70 ° C) à la chambre de bain. D. mise en place de l’embryon dans la salle de bain sous un microscope à fluorescence. E. embryon (à 24 hpf) placé latéralement dans le centre de la solution d’agarose polymérisé dans la salle de bain. F. ajout de médias à la surface de la solution d’agarose polymérisée pour couvrir complètement l’embryon dans la salle de bain. G. chambre de bain placé dans la plateforme d’échange rapide et placé dans l’adaptateur de la scène. H. mise en place de l’embryon à l’appareil de montage sur la scène du microscope multiphotonique. I. boîtier de sécurité Laser. Les portes coulissantes (1 et 2) pour le remplissage de la chambre ouverte sont indiqués. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Représentant deconvolved et max-projeté des images de Time-lapse imagerie multiphotonique un Tg (sox10:EGFP) embryon de poisson zèbre de 12 à 30 hpf. Les cellules positives sox10ont migré du prosencéphale (P) et le mésencéphale (M) pour remplir le mésenchyme périoculaire (le cercle en pointillés représente le œil) et les processus fronto (flèche open). Sox10 -cellules positives depuis le rhombencéphale (R) ont migré sur le ventre pour former les arcs pharyngiens (flèche fermée). Images ont été obtenues toutes les 20 minutes pendant le laps de temps et cousues ensemble pour créer la vidéo 1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Représentant deconvolved et max-projeté des images de Time-lapse imagerie multiphotonique un Tg(foxd3:GFP) embryon de poisson zèbre de 24 à 48 hpf. Foxd3 -cellules positives est entrés dans la chambre antérieure de le œil (l’astérisque désigne lentille) entre l’ectoderme de surface et la cupule optique, avec plus de cellules localisées à la dorsale (« D »)-postérieur quadrant (« P ») par rapport à l’antérieure (« A ») et ventrales quadrants (« V »). En outre, foxd3 -cellules positives migrent adjacent et à travers la fissure oculaire. Images ont été obtenues toutes les 20 minutes pendant le laps de temps et cousues ensemble pour créer la vidéo 2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Représentant deconvolved et max-projeté des images de Time-lapse imagerie multiphotonique un Tg(foxd3:GFP) embryon de poisson zèbre de 30 à 60 hpf. Foxd3 -cellules positives est entrés dans la chambre antérieure de le œil (cercle en pointillés indique bords périphériques de le œil, cercle en pointillé indique lentille) entre l’ectoderme de surface et la cupule optique, avec plus de cellules localisées à la dorsale (« d »)-postérieur quadrant (« p ») par rapport à la partie antérieure (« a ») quadrants ventrale (« v ») et. En outre, foxd3 -cellules positif migrent adjacent et à travers la fissure oculaire (pointe de flèche blanche indique migration crête neurale, ligne pointillée rouge délimite fissure oculaire). À 60 hpf, foxd3-cellules positives complètement encerclé la lentille (flèches fermées), indiquant la fermeture de la fissure. En outre, à 60 hpf, foxd3 était également exprimée en photorécepteurs (pointe de flèche ouverte), qui n’a pas été associée à l’expression de ce facteur de transcription dans des cellules de la crête neurale. Images ont été obtenues toutes les 20 minutes pendant le laps de temps et cousues ensemble pour créer la vidéo 3. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1. Vidéo Time-lapse d’une Tg (sox10:EGFP) embryon de poisson zèbre de 12 à 30 hpf. L’astérisque dénote le œil. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 2. Vidéo Time-lapse d’une Tg (foxd3:GFP) embryon de poisson zèbre de 24 à 48 hpf. L’astérisque dénote la lentille. L’astérisque dénote la fissure oculaire. d, dorsale ; v, ventral ; p, postérieur ; a, antérieur. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo de 3. Vidéo Time-lapse d’une Tg (foxd3:GFP) embryon de poisson zèbre de 30 à 60 hpf. L’astérisque dénote la lentille. La flèche indique la fissure oculaire. d, dorsale ; v, ventral ; p, postérieur ; a, antérieur. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Les Time-lapse imagerie multiphotonique permet le suivi in vivo des populations de cellules migratrices et transitoire. Cette technique puissante permet d’étudier les processus embryonnaires en temps réel, et dans la présente étude, les résultats de cette méthode a amélioré les connaissances actuelles de la migration des cellules neurales de crête et le développement. Les études d’imagerie Time-lapse antérieures utilisent généralement laser confocal, microscopie à balayage. 29 , 30 , 31 , 32 nous présentons ici l’utilisation d’une technique de multi-photon, qui présente de nombreux avantages sur la microscopie confocale traditionnel. La base de la microscopie multiphotonique, c’est que les deux photons de longueurs d’onde infrarouges servent à exciter le fluorophore. En conséquence, il est moins diffusion et donc une diminution de fond, qui permet une pénétration plus profonde des tissus, la réalisation d’imagerie profondeurs supérieures à 1 mm dans les tissus biologiques avec une détection plus efficace que la microscopie confocale. Ces propriétés également diminuent la phototoxicité, qui est une considération importante avec l’acquisition d’images répétées et fréquentes. 25 , 26 , 27 de ces propriétés, microscopie biphotonique peut image préparations ensemble d’organes et tissus dans des modèles de petits animaux, (par exemple des souris, des embryons de poisson-zèbre à 12 hpf - comme dans le cas de la présente étude). De plus, ces petits modèles animaux activer l’utilisation de protéines fluorescentes génétiquement codés, qui peuvent être localisées dans les tissus d’intérêt. Ainsi, l’utilisation de la microscopie multiphotonique peut améliorer considérablement d’acquisition d’images pour Time-lapse expériences.
Il y a plusieurs étapes dans ce protocole, qui dépendent du type de système laser et détection multiphotonique, étant utilisé. La plupart des problèmes avec ce protocole se posent avec les paramètres laser et acquisition d’images basées sur le système de détection utilisé. Une connaissance pratique du système individuel et l’accès au support technique sont essentiels. En outre, l’expérience antérieure avec laser confocal, microscopie à balayage est utile pour le dépannage. En outre, le système initial mis en place peut être beaucoup de temps. Cependant, une fois que le système mis en place est terminé, seulement de petits ajustements sont habituellement requis lorsque vous utilisez les mêmes lignées transgéniques.
Dans la présente étude, des embryons de poisson-zèbre entre 12 et 60 hpf ont été utilisés pour ces expériences. Au cours de cette tranche d’âge, les embryons sont petites, facilement embarqué dans l’agarose et facilement anesthésiés avec tricaïne. Cependant, les embryons peuvent devenir croissance et un retard de développement selon la durée de l’expérience. Par conséquent, veiller à faire en sorte que l’embryon est convenablement mis en scène à la fin de l’expérience.
Les Time-lapse imagerie multiphotonique donne une visualisation haute résolution, en trois dimensions, en temps réel de la migration cellulaire, qui non seulement améliore la capacité d’étudier in vivo l’embryogenèse de poisson-zèbre, mais peut également être appliquée à de nombreux autres systèmes. Bien que le protocole indiqué se concentre sur la migration des cellules neurales de crête poisson-zèbre, cette technique peut facilement être adaptée à d’autres fins d’imagerie.
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Disclosures
Ce travail a été soutenu financièrement par le biais de subventions accordées par le National Eye Institute du National Institutes of Health (K08EY022912-01) et Vision Research Core (P30 EY007003).
Acknowledgments
Les auteurs remercient Thomas Schilling pour gifting gentiment le poisson Tg (sox10:eGFP) et Mary Halloran pour gentiment gifting le poisson(foxd3:GFP) de Tg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope - FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
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