Summary
Het doel van het protocol is te bereiden keratine hydrolysaat van kippenveren door alkalische-enzymatische hydrolyse en om te testen of het toevoegen van keratine hydrolysaat in een cosmetica zalf basis verbetert de barrièrefunctie van de huid (verhooging hydratatie en afnemen van transepidermal waterverlies). Tests zijn uitgevoerd op mannen en vrouw vrijwilligers.
Abstract
Keratine hydrolysaten (KHs) zijn gevestigde standaardonderdelen in haar cosmetica. Inzicht in de hydraterende effecten van KH is gunstig voor huidverzorging cosmetica. De doelstellingen van het protocol zijn: (1) voor het verwerken van kippenveren in KH door alkalische-enzymatische hydrolyse en het zuiveren door dialyse, en (2) om te testen of toevoegen van KH in een zalf base (OB) verhoogt de hydratatie van de huid en verbetert de barrièrefunctie van de huid door het afnemen het verlies van de water van de transepidermal (TEWL). Tijdens de alkalische-enzymatische hydrolyse worden veren eerst geïncubeerd bij een hogere temperatuur in een alkalisch omgeving en vervolgens onder milde voorwaarden, gehydrolyseerd met Proteolytische enzymen. De oplossing van KH is dialyzed, vacuüm gedroogd en gemalen tot een fijn poeder. Cosmetische formuleringen bestaande uit van olie in water emulsie (O/W) met 2, worden 4 en 6% van het gewicht van de KH (gebaseerd op het gewicht van de OB) bereid. De vochtinbrengende eigenschappen van KH testen wordt uitgevoerd op de 10 mannen en 10 vrouwen op tijdsintervallen van 1, 2, 3, 4, 24 en 48 h. getest formuleringen zijn verspreid op ontvette volar onderarm sites. De hydratatie van de huid van de hoornlaag (SC) wordt beoordeeld door het meten van de capaciteit van de huid, die tot de wereldwijd meest gebruikte en eenvoudige methoden behoort. TEWL is gebaseerd op de meting van de hoeveelheid water vervoerd per een afgebakende gebied en de periode van de huid. Beide methoden zijn volledig niet-invasieve. KH zorgt voor een uitstekende occlusieve; afhankelijk van de toevoeging van KH in OB brengt het over 30% reductie in TEWL na toepassing. KH functioneert ook als een bevochtiger, zoals het water uit de onderste lagen van de opperhuid aan de SC bindt; bij de optimale KH toevoeging in de OB, omhoog tot 19% stijging van hydratatie bij mannen en 22% stijging van de vrouwen treedt op.
Introduction
Slachthuizen, de voedingsindustrie en de industrie looien produceren jaarlijks enorme hoeveelheden van solide keratine bijproducten-wol, veren, borstels, hoeven, klauwen, hoorns, en dergelijke. Volgens de meest recente statistische gegevens is het totale levend gewicht van kippen, kalkoenen, eenden en andere geslacht pluimvee in de VS 62,5 miljard pond per jaar1; het is in de EU ongeveer 28,7 miljard pond per jaar. Gezien het feit dat veren tot 8,5% van het gewicht van de totale pluimvee maken, produceert de Verenigde Staten alleen al jaarlijks ca. 5,3 miljard pond van afval veren2.
Keratine is een proteïne tentoonstellen van hoge chemische weerstand, omdat het sterk kruislings gekoppelde met disulfide bruggen die de verwerking ervan te bemoeilijken. Verkrijgen van oplosbare producten vereist het splijten van kruisverbindingen en eventueel uitvoering van hydrolyse van de peptide bindingen3. Splitsing van de disulfide bruggen kan gaan door een reactie van thiol anion volgens het volgende patroon4,5:
Seen- + -SbSc– ↔ – Sb- + -SeenSc-
Met een zeer hoge pH-waarde verschijnt hydrolyse van de disulfide bruggen ook, overeenkomstig de patroon6
-SS- + OH- → – S- + -SOH
Onder lichte omstandigheden (pH ca. 8) plaatsvindt zelfs sulfitolysis volgens het volgende patroon:
-SS- + HSO3- → – SH + SSO-3-
De meest economische manier vernederende keratine is microbiële afbraak, dat wordt gekenmerkt door milde omstandigheden tijdens verwerking en hoge verdeling efficiëntie (ca. 90%)7,8. Keratinases worden geproduceerd door sommige bacteriën geïsoleerd van bodem- en keratine afval9. Microbiële keratinases hydrolyseren stijf en sterk kruislings gekoppelde keratine structuren10 en de daaruit voortvloeiende KH bereid is rijk aan oplosbare eiwitten, geen verlies bij essentiële aminozuren aangetroffen in het11.
Nemen een proteïne in cosmetische preparaten (bijvoorbeeld, emulsies, lotions en gelen), de eisen door te zorgen dat dergelijke eiwitten oplosbaar in water zijn, de bepaalde systemen transparant zijn en dat opnieuw aggregatie van de peptiden wordt vermeden worden hydrofobe interacties. Daarom is een gangbare praktijk toe te passen van hydrolysaten van eiwitten, zoals gehydrolyseerd collageen, elastine en keratine. Bij het toevoegen van hydrolysaten in cosmetische emulsies, worden stappen genomen om ervoor te zorgen dat het hydrolysaat eerst wordt opgelost in water. In sommige gevallen is het wenselijk dat het eiwit (of het hydrolysaat) oplosbaarin alcohol of andere organische oplosmiddelen12is.
KH wordt normaal gesproken gekenmerkt in shampoos, conditioners en lotions voedend serums voor haar, evenals mascaras, nagellak en oog make-up agenten. De gevolgen van de KH gedeclareerd meestal omvatten vormen een beschermende film, het haar glad of structuur, verhoogde plasticiteit en het uiterlijk van de behandelde vorming, regulering van de consistentie van producten en het bevorderen van de vorming van schuim13 nagel , 14. het heeft ook aangetoond dat KH vermindert de oppervlaktespanning, vandaar suppletie in cosmetica verlaging van emulgator toegevoegd aan het stabiliseren van crèmes kan vergemakkelijken. KH beperken de gevolgen van geactiveerd door reinigingsmiddelen (oppervlakteactieve stoffen) irritatie aan de huid, ogen en haar, waardoor de potentiële bijwerkingen van reinigingsmiddelen op weefsel (bijv., uitdroging van de huid, hardheid en verminderde barrièrefunctie van de huid). Het hoge bufferend vermogen van hydrolysaten wordt ook benut om te stabiliseren de pH van cosmetica; peptiden van kortere lengte hebben een grotere buffer effect15,16. Hoewel KHs vestigen als standaard componenten in haar en nagel cosmetica, evenals het wordt gebruikt in producten voor huidverzorging, studies over de hydraterende effecten van KH verschijnen niet in de hedendaagse literatuur.
Alkaline-enzymatische technologie is ontwikkeld voor de verwerking van bijproducten van de keratine in KH en actieve testen is in het proces over de gevolgen van een aantal cosmetische additieven17,18,19,20 , 21 , 22. het voordeel van twee fasen alkalische-enzymatische hydrolyse met behulp van microbiële proteasen voor kippenveren behaalt hoge efficiëntie onder milde omstandigheden en de kwaliteit van de KH is zeer hoog in tegenstelling tot hydrolyse werkzaam in sterke zuren of logen. In de eerste fase, worden veren geïncubeerd bij een hogere temperatuur in een alkalisch omgeving, die gedeeltelijk verstoort de keratine structuur en zwelt de veren; na het aanpassen van de pH, zijn de veren gehydrolyseerd met een Proteolytische enzymen milde omstandigheden in de tweede fase. De dialyzed KH bezit een hoog gehalte aan eiwitten.
De toepassing van de hier beschreven methode zijn verwerking van pluimvee veren tot een KH door middel van alkalische-enzymatische hydrolyse en testen van het effect van hydraterende eigenschappen van KH toegepast op O/W cosmetische emulsie. De vochtinbrengende eigenschappen worden door instrumentale niet-invasieve methoden in vivoonderzocht. De meest voorkomende methoden voor het meten van de huid hydratatie en barrière functie voor SC omvat meting van de elektrische eigenschappen van de huid (geleidbaarheid of capaciteit). Verschillende methoden voor het onderzoeken van SC hydratatie omvatten in de buurt van infrarood multispectrale verbeelden methode (NIM), nucleaire magnetische resonantie spectroscopie, optische coherentie tomografie of voorbijgaande thermische overdracht23. Functie als barrière voor SC correleert aan de TEWL van SC en het wordt gemeten door de geventileerde kamer methode, de methode van de unventilated kamer en open kamer methode24.
Eigenschappen van de formuleringen van het model worden bepaald met behulp van de Multi Probe adapter MPA 5 met drie soorten sondes. De eerste one, corneometer CM 825, maatregelen hydratatie van de huid door de beoordeling van wijzigingen in de elektrische capaciteit van het huidoppervlak; de meting condensator geeft de wijzigingen in de capaciteit van het huidoppervlak in corneometric eenheden. De corneometer geeft alleen een relatieve beoordeling van huid hydratatie25. Voor TEWL, wordt de tweede sonde, tewameter TM 300, gebruikt voor het meten van de gradiënt van de dichtheid van water verdamping (in een open kamer instrument op basis van de wet van Fick van diffusie) uit de huid niet indirect door de twee paren van sensoren (temperatuur en relatieve vochtigheid) vermelding van de hoeveelheid water per een afgebakende gebied en de periode van tijd (g/m2/h) worden vervoerd. Deze methode kan detecteren zelfs de geringste verstoring van de functie26van de barrière van de huid. De pH van de huid is een indicator van barrière en anti-microbiële functie van de SC-27. De zuurgraad van de huid mantel werd gemeten door een (derde) huid PH 905 sonde verbonden met de MPA 5-station. Deze speciaal ontworpen sonde bestaat uit een vlak-bedekte glaselektrode voor volledige huidcontact, verbonden met een voltmeter. Het systeem meet potentiële veranderingen als gevolg van de activiteit van waterstof kationen rond de zeer dunne laag van semi-vaste vorm aan de bovenkant van de sonde wordt gemeten. De veranderingen in spanning worden weergegeven als pH28.
Presenteren we experimenten verdeeld in drie secties: (1) voorbereiding van KH van kip veren door tweetraps alkalische-enzymatische hydrolyse en de zuivering door dialyse (verwijderen van zouten en laag-moleculaire breuken), (2) de bereiding van cosmetische formuleringen met 2, 4 en 6% KH en (3) de eigenschappen van KH testen door het meten van de huid van de hydratatie, TEWL, en pH van de huid. Testen werd uitgevoerd op 10 vrouwen met de gemiddelde leeftijd van 27.2 jaar en op 10 mannen met de gemiddelde leeftijd van 26.2 jaar. De methode van de selectie van de vrijwilligers en de testen zelf werden uitgevoerd overeenkomstig internationale ethische beginselen van biomedisch onderzoek met gebruikmaking van menselijke proefpersonen29; alle personen gaf hun geïnformeerde toestemming voor opname in de studie. Vóór de proef begonnen, werden de vrijwilligers gevraagd een vragenlijst op hun gezondheidsstatus in te vullen. De vrijwilligers inzetten om te voorkomen dat de toepassing van een cosmetisch product voor testlocaties en omliggende regio's, tijdens de 24 uur voorafgaand aan en tijdens de testperiode; Bovendien mochten ze alleen korte avond wast met stromend water.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vrijwilligers werden geworven onder de medewerkers en studenten van onze universiteit. De methode van de selectie werd uitgevoerd volgens "internationale ethische richtsnoeren voor biomedische onderzoek betrekken Human Subjects. Raad voor internationale organisaties van medische wetenschappen, Genève (2002)." KH is een gemeenschappelijk cosmetisch ingrediënt gebruikt in haarverzorging producten (shampoo's, conditioners, enz.) en vandaar de goedkeuring van de institutionele review board is niet vereist.
1. proces kippenveren in KH
- Kippenveren ophalen op een pluimveeboerderij.
- Eventuele onoplosbare onzuiverheden en bloed overblijfselen uit de kippenveren met een voldoende overmaat van verse uitgevoerd (koud) water wassen. Plaats van de veren op een vlakke plaat en droog 's nachts bij 50 ° C.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. - Slijpen van 50 g gedroogde veren in een snijden molen (geschikt voor zacht om medium-hard monster materialen en vezelstoffen) in een uiteindelijke fijnheid van 1,0 mm. als alternatief, de definitieve fijnheid van het gemalen veren kan worden hoger, maar niet meer dan 3,0 mm.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. -
Ontvetten van veren
Opmerking: De meest efficiënte en economische methode voor het ontvetten van pluimvee veer is het gebruik van een commerciële Lipolytische enzymen.- Meng in een roestvrij staal 27-L ketel container met temperatuurregeling, de veren met water voorverwarmd tot 40 ± 2 ° C in een gewicht-verhouding 1:75. Toevoegen van een Lipolytische enzymen (activiteit 100 KLU/g) in een dosis van 1,5-2,0% (gerelateerd aan woog-in droge veren) en zachtjes roer de inhoud met een Bovenroerder gedurende 5 minuten.
- Breng de pH van het mengsel tot 9,0 ± 0,2, de waarde die overeenkomt met de maximale activiteit van de lipolytische enzymen door toevoeging van 1% NaOH of 1% H3PO4 -oplossing. Roer het mengsel gedurende 5 minuten met een Bovenroerder, vervolgens controleren en opnieuw aanpassen het pH-niveau met behulp van een laboratorium Bank pH/mV meter.
- Zachtjes roer het mengsel met een Bovenroerder gedurende 24 uur op 40 ± 0,5 ° C. Als alternatief, Incubeer het mengsel op 40 ± 0,5 ° C, en gedurende de eerste 6 uur incubatie roer de inhoud 1 h tussenpozen.
- Filtreer het mengsel door een fijne zeef (100 µm grootte) en wassen van de ontvette veren met een stroom van verse uitgevoerd (koud) water. De veren op een vlakke plaat bij 50 ° C in een droogrek kamer 's nachts droog.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
- Het uitvoeren van de eerste fase van de kip veer hydrolyse. Meng de veren met 0,3% KOH water-oplossing in een gewicht-verhouding 1:50 en zachtjes roeren met een Bovenroerder bij 60 ± 0,5 ° C gedurende 24 uur. De pH van het mengsel af van ca. 12,5 aan het begin van de incubatie tot ca. 11.0 aan het eind van de incubatie. Na het afronden van de eerste fase van de hydrolyse, breng de pH van het mengsel tot het niveau dat overeenkomt met de maximale activiteit van de Proteolytische enzymen met 10% H3PO4 (in dit geval, tot een niveau van 9,0 ± 0,2) door toevoeging van 1% NaOH.
- Het uitvoeren van de tweede fase van kip veer hydrolyse. Voeg aan het mengsel, de Proteolytische enzymen in een dosis van 5,0% (gerelateerd aan droge stof van hoeveelheid veren woog in het begin van de eerste fase van de hydrolyse). Zachtjes roeren met een Bovenroerder bij 60 ± 0,5 ° C gedurende 8 uur dan Verwarm het mengsel (in dezelfde roestvrij staal 27-L ketel container) naar een kookpunt (100 ° C) en kook gedurende 10 minuten naar de inactivering van het enzym.
- De oplossing van KH (bereid in stap 1.6) te scheiden van de onopgeloste restant door filteren door middel van low-density filtreerpapier op een Buchner trechter met lichte vacuüm-druk; ook gebruiken een centrifuge.
Opmerking: Het protocol kan worden onderbroken hier voor enkele dagen als een oplossing van KH is opgeslagen bij 5 ± 1 ° C. - Dialyze de KH met behulp van de 12 K MWCO membraan om kleine peptiden en zouten te verwijderen in de kunststof emmer (26 cm diameter x 26 cm hoogte). Giet 400 mL van de oplossing van de KH in dialyse leidingen en het dialyze tegen 4 L gedestilleerd water gedurende 80 uur bij kamertemperatuur; het gedestilleerd water veranderen na 18, 36 en 60 h.
- Zet een dialyzed oplossing van KH op een plaat van de anti-lijm (b.v., silicone) een verhouding van 500 mL, 1000 cm2 plaat gebied, vacuüm droog op een dunne film op 40 ± 0,5 ° C voor 's nachts, vermalen tot een fijn poeder, en houd het in een gesloten vat in een exsiccator.
Opmerking: Het protocol kan worden gepauzeerd hier maandenlang als de KH-poeder is opgeslagen op een droge plaats.
2. voorbereiding van de cosmetische formuleringen met KH
Opmerking: De OB gebruikt voor het testen was een commerciële hydrofiele O/W crème basis en aqua, of paraffine, vloeibare paraffine, cetearyl alcohol, Laureth 4, natriumhydroxide, carbomer, methylparaben, propylparaben bestaat.
- Bereiden van formuleringen met 2, 4 en 6% KH (overeenkomstig de basis gewicht van de zalf). Weeg de hoeveelheid KH poeder in een polyethyleen vaartuig (7 cm diameter x 10 cm hoogte) en voeg de OB op een bedrag dat zorgt voor het totale gewicht van de formulering is gelijk aan 50 g; Zie recept in tabel 1.
| Cosmetische formulering | Gewicht van zalf base [g] | Gewicht van keratine hydrolysaat [g] | Totale gewicht [g] | |||||
| Zalf basis | 50 | 0 | 50 | |||||
| Zalf base + 2% KH | 49 | 1 | ||||||
| Zalf basis + 4% KH | 48 | 2 | ||||||
| Zalf basis + 6% KH | 47 | 3 | ||||||
Tabel 1: Gewicht-in hoeveelheid zalf base en keratine hydrolysaat te bereiden cosmetische formuleringen.
- Meng het mengsel met een blender 3-blads laboratorium gedurende 10 minuten bij 134.16 x g en meng met behulp van een mechanische Bovenroerder. De voorbereide formuleringen bij 5 ± 1 ° C te handhaven en warm ze op kamertemperatuur voor 2 h voorafgaand aan gebruik.
Opmerking: Homogenisatie van het mengsel van OB met KH kan worden gedaan met een niet-digitale roerder ook. Op een niet-digitale roerder zijn er ook schalen met de geschatte snelheid (rpm). Zachte roeren werkt het beste voor deze stap.
Opmerking: Het protocol kan worden onderbroken hier maximaal 5 maanden als de formuleringen zijn opgeslagen bij 5 ± 1 ° C.
3. test de eigenschappen van KH door meten huid hydratatie, TEWL en pH
Opmerking: Voer alle metingen in een geconditioneerde ruimte bij 23 ± 2 ° C en de relatieve vochtigheid van 56 ± 3%.
- Plaats 5 strips van filtreerpapier (formaat 2 x 4 cm) in de fysiologische oplossing (0.90% NaCl) en laat ze gedurende ongeveer 1 min. in de oplossing.
- Twee stroken van toepassing op de binnenzijde van de rechter onderarm, en drie aan de binnenzijde van het linker onderarm en corrigeren voor 4 h met zelfklevende pleisters. Deze stap is het ontvet de huid en het elimineren van de individuele kenmerken van de huid op de site. Na 4 uur, verwijder de strips en de gebieden met een permanente pen demark, Zie Figuur 1.
Figuur 1: methode voor de locatie van de formuleringen van de test op de onderarm van de linker- en rechter boven ledematen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Toepassing van 0,1 mL van de geteste formuleringen op elke plek van de ontvette onderarm sites met behulp van spuiten en verspreid over het gehele gemarkeerde oppervlak. Op de linker onderarm, niet om het even wat van toepassing op de eerste site (het is het besturingselement), toepassing van de OB naar de tweede plaats, en de OB + 2% KH aan de derde. Toepassing van de OB + 4% KH en OB + 6% KH naar de rechterarm.
- Meten van elk monster op elke site en elk interval (1, 2, 3, 4, 24 en 48 uur) en neem 5 lezingen met meter sonde van de hydratatie van de huid voor hydratatie van de huid, 15 lezingen met de TEWL meter sonde voor de huid TEWL en 1 lezen met meter sonde van de pH van de huid voor de pH van de huid. Laat geen vrijwilligers toe te passen van een cosmetisch product op de testlocaties en omliggende gebieden tijdens de testperiode; zij mogen korte avond wast met stromend water.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. - Het verwerken van de resulterende lezingen door numerieke basiskenmerken van de beschrijvende statistiek, met behulp van spreadsheet-software. De 5 hydratatie lezingen voor elk monster gemeten, negeren de laagste en de hoogste lezingen en slechts 3 lezingen voor het rekenkundig gemiddelde en de standaarddeviatie te berekenen. Negeren van de eerste 5 van de 15 TEWL lezingen voor elk monster gemeten, en slechts 10 lezingen voor rekenkundig gemiddelde en de standaarddeviatie te berekenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De KH bereid volgens procedure hier gepresenteerd (Zie Figuur 2) is geel van kleur, gemakkelijk oplosbaar in water met een hoog gehalte aan proteïne (anorganische vaste stoffen vertegenwoordigen < 2,0%); de pH van de oplossing van 1,0% van KH 5.3 is en voldoet aan de eisen voor cosmetische-grade hydrolysaten. De opbrengst van KH van 50 g grondstof is ca. 30%. De molecuulgewichtsverdeling van KH werd bepaald door SDS-PAGE en is afgebeeld in Figuur 3.
Figuur 2: representatief beeld van keratine hydrolysaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: SDS-pagina van keratine hydrolysaat en eiwit normen. Lane 1: Ultra-lage moleculaire gewicht bereikmarkering (3.5-26,6 kDa). Rijstroken 2, 3 en 4: keratine hydrolysaten bereid in 3 partijen. 120 µg KH opnieuw geschorst in 20 µL laden buffer is geladen in elk putje. Lane 5: brede waaier molecuulgewicht marker (6.5-200 kDa)
De hydratatie en TEWL waarden werden afgebakend in verschillende vrijwilligers, en dus niet kunnen worden vergeleken met elkaar. Dus, de waarden worden uitgedrukt als de verandering in procenten ten opzichte van de OB op de site met de formuleringen, de laatste met 2, 4 en 6% toevoegingen van KH intervallen voor het meten van 1, 2, 3, 4, 24 en 48 uur behandeld. De pH-waarden voor de huid worden uitgedrukt als het rekenkundig gemiddelde van de opgenomen waarden van pH van de huid voor alle vrijwilligers. De resultaten voor wijziging van hydratatie en TEWL in procenten, ten opzichte van de OB, en voor pH niveaus van de huid zijn gegeven in tabel 2 voor 10 man en in tabel 3 voor 10 vrijwilligers van de vrouw.
| Mannen | ||||||
| Tijd | 1 h | 2 h | 3 h | 4 h | 24 h | 48 h |
| Hydratatie (veranderings-% vs. Oitment base) ± SD | ||||||
| Zalf base + 2% KH | + 16 ±15 | + 14 ±16 | + 12 ±9 | + 19 ±14 | + 11 ±18 | + 15 ±9 |
| Zalf basis + 4% KH | + 6 ±19 | + 1 ±18 | + 5 ±10 | + 7 ±16 | + 11 ±9 | + 14 ±15 |
| Zalf basis + 6% KH | -3 ±25 | -4 ±14 | -7 ±18 | -4 ±17 | + 11 ±14 | -17 ±14 |
| TEWL (veranderings-% vs. Oitment base) ± SD | ||||||
| Zalf base + 2% KH | -20 ±15 | -20 ±22 | -11 ±21 | -20 ±21 | -23 ±20 | -21±17 |
| Zalf basis + 4% KH | -28 ±12 | -29 ±20 | -28 ±20 | -28 ±24 | -47 ±20 | -36 ±20 |
| Zalf basis + 6% KH | -36 ±16 | -41 ±21 | -31 ±17 | -36 ±17 | -53 ±20 | -54 ±17 |
| pH | ||||||
| Controle | 4.7 ±0, 5 | 5.1 ±0.4 | 4.9 ±0.4 | 5.1 ±0.3 | 4.6 ±0, 5 | 4.8 ±0.7 |
| Zalf basis | 4.8 ±0, 5 | 5.1 ±0.3 | 4.9 ±0.3 | 5.0 ±0.4 | 4.6 ±0.4 | 5.0 ±0.6 |
| Zalf base + 2% KH | 5.0 ±0.6 | 4.8 ±0.4 | 4.9 ±0, 5 | 4.9 ±0, 5 | 4.7 ±0.3 | 5.0 ±0.6 |
| Zalf basis + 4% KH | 4.8 ±0, 5 | 4.9 ±0.3 | 4.8 ±0.4 | 4.8 ±0.3 | 4.7 ±0, 5 | 4.8 ±0, 5 |
| Zalf basis + 6% KH | 4.7 ±0, 5 | 5.0 ±0.2 | 4.9 ±0.4 | 4.8 ±0.4 | 4.8 ±0.6 | 5.0 ±0.6 |
Tabel 2: Resultaten voor veranderen in hydratatie, TEWL en pH van de huid van 10 man vrijwilligers op de tijdstippen van de meting van 1, 2, 3, 4, 24 en 48u.
| Vrouwen | ||||||
| Tijd | 1 h | 2 h | 0 K | 4 h | 24 h | 48 h |
| Hydratatie (veranderings-% vs. Oitment base) ± SD | ||||||
| Zalf base + 2% KH | + 22 ±7 | + 15 ±6 | + 15 ±8 | + 12 ±9 | + 14 ±14 | + 18 ±9 |
| Zalf basis + 4% KH | 0 ±4 | -6 ±5 | -2 ±5 | + 1 ±7 | + 10 ±13 | + 15 ±10 |
| Zalf basis + 6% KH | -12 ±5 | -14 ±2 | -9 ±7 | -5 ±9 | + 8 ±12 | + 10 ±9 |
| TEWL (veranderings-% vs. Oitment base) ± SD | ||||||
| Zalf base + 2% KH | -32 ±1.6 | -16 ±3.0 | -12 ±1.3 | -20 ±0.9 | -35 ±1.9 | -38 ±1.6 |
| Zalf basis + 4% KH | -41 ±1.1 | -37 ±2.7 | -24 ±0.8 | -34 ±0.9 | -44 ±1.5 | -38 ±1.9 |
| Zalf basis + 6% KH | -50 ±1.4 | -39 ±2.2 | -29 ±0.7 | -39 ±0.9 | -16 ±2.4 | -33 ±2.1 |
| pH | ||||||
| Controle | 5.0 ±0.7 | 5.3 ±0.3 | 4.9 ±0.7 | 5.0 ±0, 5 | 5.0 ±0.8 | 4.7 ±0.7 |
| Zalf basis | 5.2 ±0.6 | 5.3 ±0.3 | 5.2 ±0.7 | 5.0 ±0.4 | 5.1 ±0.8 | 4.8 ±0.7 |
| Zalf base + 2% KH | 5.4 ±0.7 | 5.1 ±0.4 | 4.9 ±0.4 | 5.1 ±0.7 | 4.9 ±0.7 | 5.0 ±1.0 |
| Zalf basis + 4% KH | 5.2 ±0.7 | 5.1 ±0.3 | 5.0 ±0.4 | 4.9 ±0.4 | 5.1 ±0.6 | 5.1 ±0.2 |
| Zalf basis + 6% KH | 5.2 ±07 | 5.2 ±0.2 | 5.0 ±0.4 | 5.0 ±0.3 | 5.4 ±0.6 | 5.2 ±0.4 |
Tabel 3: Resultaten voor veranderen in hydratatie, TEWL en pH van de huid van de 10 vrouwen vrijwilligers op de tijdstippen van de meting van 1, 2, 3, 4, 24 en 48u.
Hydratatie voor SC voor mannen vrijwilligers:
Korte tussenpozen meting (1-4 h), de hoogste stijgingen van de hydratatie van de huid (12-19%) werden opgenomen voor formuleringen ter aanvulling van de OB met 2% van de KH; de toevoeging van 4% KH toonde een kleinere stijging (1-7%) hydratatie. Omgekeerd weerspiegeld de KH op 6% negatief over waarden voor SC hydratatie (een daling van 3-7%). Na 24u maateenheid, was een stijging van 11% in hydratatie SC onderscheidde voor alle toevoegingen van KH aan de OB getest. Dezelfde trend bleef zelfs na 48 uur, na met een lichte stijging van de hydratatie die nog steeds gebleven: een verhoging van 15% voor KH op 2%, een stijging van 14% voor de 4% toevoeging van KH en de daling van 17% voor KH op 6%.
Hydratatie voor SC voor vrouwen vrijwilligers:
Het is waarneembaar dat ter aanvulling van de OB met 2% KH een geschatte 22 veroorzaakt % toename van SC hydratatie, ten opzichte van OB alleen, reeds in 1 h van de meting; een 4% toevoeging van KH naar de OB, in feite geen invloed heeft op hydratatie; terwijl, omgekeerd, het toevoegen van 6% KH op de website van OB wordt weerspiegeld in een geschatte daling van 12% in hydratatie, zoals vergeleken met pure OB. vergelijkbaar tendensen worden gezien na 2, 3 en 4 uur voor de meting, bij die hydratatie toeneemt met 12-15% voor suppletie met 2% KH; voor grotere toevoegingen van KH, de hydratatie gelijk blijft of vermindert. Na 24u voor meting, werd de hydratatie opgenomen als hoger dan voor de OB voor alle de geteste KH toevoegingen; de grootste toename (14%) hydratatie plaatsvond voor de toevoeging van 2% KH, terwijl de verhoging van de laagste (8%) werd gezien voor suppletie op 6% van KH. Vergelijkbare resultaten worden bereikt na 48u maateenheid, waarin meer hydratatie dan voor zuiver OB werd opgenomen voor alle monsters met toevoegingen van KH; de grootste stijging (18%) hydratatie heeft plaatsgevonden voor de toevoeging van de KH 2%, terwijl de verhoging van de laagste (10%) werd opgemerkt voor KH suppletie op 6%.
TEWL voor mannen vrijwilligers:
De resultaten van de TEWL maken het duidelijk dat formuleringen aangevuld met KH verminderen TEWL, wanneer toegepast op de huid, in vergelijking met de zuivere OB. Een verhoogde hoeveelheid KH die een positief effect op de lagere waarden van de TEWL wordt uitgeoefend. Na 1 uur na het toepassen van de formuleringen, TEWL werd opgenomen als 20% lager dan voor de zuivere OB, met betrekking tot een formulering met 2% KH; terwijl de KH op 4% gedaald 28% in TEWL; Overwegende dat de KH op 6% in een dramatische 36 resulteerde % afname van TEWL. Inderdaad, de verminderde TEWL-waarden werden ook waargenomen bij 2, 3 en 4 h maateenheid voor formuleringen aangevuld met KH. Na 24 en 48 uur, werd de TEWL zelfs aanzienlijk verlaagd op sites die zijn behandeld met de KH formuleringen. Na 24 h was TEWL waargenomen op de huid 23% lager voor de OB met 2% toevoeging van KH dan op de site voor zuivere OB; KH 4% daalde met ongeveer 47% TEWL, terwijl de KH op 6% geactiveerd TEWL te vallen met 53%. Een soortgelijke trend blijkt zelfs na 48 h: de TEWL voor de huid behandeld met OB met 2% KH was 21% lager dan op de site voor zuivere OB; de KH op 4% toonde een TEWL op 36% lager; en de KH op 6% gebracht over een daling van 54%.
TEWL voor vrouwen vrijwilligers:
Het is duidelijk dat alle gecontroleerde toevoegingen van KH op website OB wordt uitgedrukt in verminderde TEWL, zoals te zien in de mannen-vrijwilligers. Na 1 uur van toepassing, werd een significante afname van de TEWL opgenomen voor OB monsters met alle toevoegingen van KH; over een 32% reductie in TEWL werd gezien voor de toevoeging van de 2% van KH, rond een verlaging van 41 procent voor 4% KH, en zelfs een 50% daling van de TEWL voor 6% suppletie van KH. Na 2, 3 en 4 h van meting intervallen, soortgelijke situatie blijft, dat wil zeggenis er een afname van de TEWL op deze tijdstippen; de kleinste daling van TEWL vindt plaats voor 2% KH, terwijl de grootste wordt gezien voor 6% KH. Na 2 uur de TEWL daalt met 16% voor KH op 2%, 37% voor KH op 4% en 39% voor KH op 6%. In 3 h, vermindert TEWL verder met 12% voor KH op 2%, 24% voor KH op 4% en 29% voor KH op 6%. 4 uur, TEWL verder vermindert met 20% voor 2% KH, 34% voor 4% KH, en 39% voor 6% KH. Na 24 h, de minste vermindering van TEWL (16%) is opgetreden voor de 6% toevoeging van KH, terwijl de grootste (44%) werd gezien voor 4% suppletie van KH; de KH op 2% werd vastgesteld tot een verlaging van 35 procent in TEWL. In 48 h, blijven de resultaten vergelijkbaar en relatief evenwichtig, met de minste afname van de TEWL (33%) voor de 6% toevoeging van KH, de grootste (38%) voor 4% KH en 2% KH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het voordeel van alkalische-enzymatische hydrolyse is dat het kan worden gewijzigd volgens de toekomstige toepassingen van KH. Bijvoorbeeld, in haarverzorging cosmetica toepassingen waar een licht bruine kleur van een product niet een obstakel is, kan een hogere temperatuur in de hydrolyse worden toegepast wat leidt tot een hoger rendement van KH. Bovendien de langere verwerkingstijd tijdens beide fasen van de technologische procedure aanzienlijk invloed op het algehele proces efficiëntie – rendement van KH stijgt tot 85%.
De bevindingen voor hydratatie meting maken het duidelijk dat, tijdens de gecontroleerde interval van meting 1-48 h, de toevoeging van 2% KH op website OB optimale omdat het veroorzaakt een stijging van 11-19% in hydratatie van de SC voor mannen vrijwilligers, en een stijging van 12-22% voor vrijwilligers van de vrouw. De KH die is toegevoegd bezit een brede distributie van moleculair gewicht. Wij stellen voor dat een deel van de laag-moleculair-gewicht breuken (MW < 20 kDa) dringt door in de epidermis na toepassing aan de huid. Betere hydratatie van de huid na het zetten van een formulering die aangevuld met KH is toegelicht door middel van de KH bindende water uit de onderste lagen van de opperhuid aan de structuur van de SC, leidt tot de vorming van H-bruggen tussen KH moleculen en water. Dit werkingsmechanisme wordt ook door sommige auteurs30omarmd. De hydraterende werking van KH is vergelijkbaar met conventionele moisturizers (b.v., glycerol, ureum en hyaluronzuur) die werden getest in emulsie en gel formuleringen22.
TEWL metingen wijzen dat tijdens de waargenomen tijd van de meting (1-48 h) voor mannen vrijwilligers, alle de formuleringen met KH suppletie TEWL veroorzaakt dalen na toepassing. De 2% toevoeging van KH op de website van OB veroorzaakt een vermindering in TEWL 11-23%, ten opzichte van pure OB. Wanneer de OB werd aangevuld met 4% KH, TEWL daalde met 28-47%; terwijl voor KH op 6% verminderd het door maar liefst 31-54%. Voor de vrijwilligers van de vrouw, haar aan te vullen de OB met 4% KH vertegenwoordigt de beste optie, aangezien er een 24-44% afname van de SC TEWL. De aanzienlijk lagere TEWL voor formuleringen aangevuld met KH kan worden verklaard door het proces van hogere-moleculair-gewicht breuken van KH vormen een beschermende film eenmaal toegepast op de epidermis, waardoor het verlies van epidermale water. In feite, het positieve effect van KH op TEWL vergelijkbaar of zelfs groter is dan, ter vergelijking, waarden van TEWL opgenomen voor cosmetische gels of emulsies aangevuld met 5-10% glycerol en 1-5% van de sericin. Ook bij het vergelijken van KH met conventionele minerale oliën, verminderd KH TEWL door ongeveer 25-30%31. Bovendien zijn de barrière eigenschappen van KH beter dan, bijvoorbeeld, die voor ureum en hyaluronzuur22.
pH van het huidoppervlak:
Ter referentie, pH 3,5 tot 4,3 is een zure huidoppervlak pH 4.4 tot 5,5 is in dit opzicht neutrale en pH 5.6 naar 6.5 vertegenwoordigt een fundamentele huid oppervlakte32. Wij vonden dat geen significante veranderingen in de pH van het huidoppervlak werden waargenomen na de invoering op alle van de geteste formuleringen (OB + 2, 4 en 6% KH); de pH van 4.6 tot 5.0 (mannen vrijwilligers) en 4,9 tot 5.4 (vrouw vrijwilligers) komt overeen met een oppervlak van de normale huid. De langerlopende analyse (meer dan 2 dagen) werd niet bereikt.
Wijzigingen en probleemoplossing:
Verwerking van kippenveren in KH is zeer eenvoudig, en wordt uitgevoerd onder atmosferische druk en bij milde temperatuur. Het proces kan gunstig worden getransformeerd van een laboratoriumschaal tot een proeffabriek schaal en een industriële schaal. In paragraaf 2 van het protocol waar de KH is gehomogeniseerd met de base (O/W) emulsie, zijn enkele wijzigingen mogelijk. In de industriële praktijk, O/W en zonder emulsies zijn bereid door het mengen van water (W) fase (water + cosmetische ingrediënten in water oplosbaar) en olie (O) fase (olie + cosmetische ingrediënten in olie oplosbare). KH is oplosbaar in water, dus het is gunstig voor de mix het rechtstreeks in de waterfase van het systeem.
Beperkingen van de techniek:
Lokalisatie van elke vlek voor meten hydratatie en TEWL en geciseleerde druk worden gemeten met meter van de hydratatie van de huid die is duur.
Kritische stappen in het protocol zijn meestal in sectie 3. De gezondheid staat, individuele verschillen, rokers/niet-rokers, geslacht, leeftijd verschillen, menstruatie en mentale conditie kunnen meten hydratatie van de huid en TEWL beïnvloeden. Voor representatieve resultaten te verkrijgen, gelden dezelfde persoon geteste formuleringen onderarmen en maatregel hydratatie en TEWL waarden. Het is essentieel voor het uitvoeren van alle metingen in een geconditioneerde ruimte met een stabiele temperatuur en relatieve vochtigheid. In het geval van het meten van waarden met intervallen van 24 en 48 h, is acclimatisatie van de vrijwilligers in een geconditioneerde ruimte voor ten minste 30 minuten vóór de meting noodzakelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Zulks stuk watertje schriftelijk met steun van het project IGA/FT/2017/007 van Tomas Bata Universiteit in Zlin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material or chemicals | |||
| LIPEX 100T | Novozymes | LJP30020 | Lipex - enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 100 KLU/g |
| Savinase Ultra 16L | Novozymes | PXN40001 | Savinase - enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 16 KNPU-S/g |
| Potassium hydroxide, KOH | Sigma-Aldrich | 302510289 | Potassium hydroxide, KOH, 97,0 %, Mr 56,11 |
| Phosphoric acid solution, H3PO4 | Sigma-Aldrich | W290017 | Phosphoric acid solution, H3PO4, 85 wt. % concentration in water, Mr 98,00 |
| Sodium chloride physiological solution | Sigma-Aldrich | 52455 | Tablets of BioUltra NaCl physiological solution; 1 tablet in 1000 mL of water yields 0.9 % NaCl |
| Sodium hydroxide, NaOH | Penta s.r.o. | 40216 | Sodium hydroxide, NaOH, 97,0 %, Mr 40,00 |
| AmiFarm (Cremor base-A) | Fagron | 608425 | Hydrophilic oil in water (O/W) cream base; the composition: aqua, paraffin, paraffin liquid, cetearyl alkohol, Laureth 4, sodium hydroxide, carbomer, methylparaben, propylparaben. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| IKA EUROSTAR POWER control-visc stirrers | IKA-labortechnik | Z404020 | Digital laboratory stirrer, for tasks up to the high viscosity range, 230V, 1/cs |
| IKA Propeller stirrer, 3-bladed | IKA-labortechnik | R 1381 | Propeller stirrer, 3-bladed, stirrer Ø: 45 mm, shaft Ø: 8 mm, shaft length: 350 mm |
| Dialysis tubing closures | Sigma-Aldrich | Z371017-10EA | Dialysis tubing closures, red, size 110 mm |
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma-Aldrich | D9402-100FT | Dialysis tubing cellulose membrane, average flat width 76 mm (3.0 in.) |
| DOMO Pot with stailess, LCD | DOMO Elektronic | DO42325PC | Preserving boiler stainless steel, 2000 W, 27-L container (diameter 37 cm, height 30 cm), temperature control 30-100 ° C, operation LCD display |
| Hettich zentrifugen Universal 32 | Gemini bv | 2770 GS1R | Mid bench centrifuge, speed 18000 rpm |
| LT 3 shaking device | Fischer Scientific | 6470.0002 | Orbital shaking device |
| KERN 440-47N | Kern | 440-47N | Laboratory balance |
| KERN 770 | Kern | 770 -N | Laboratory analytical balance |
| VENTICELL 222 - Komfort | BMT, MMM Group | C 131749 | Drying oven, temperature control 30-100 ° C, air circulation control |
| Vacucell 55 - EVO | BMT, MMM Group | B 050328 | Vacuum drying oven, temperature control 30-100 ° C |
| PULVERISETTE 19 | Fritsch | 19.1030.00 | Universal cutting mill, rotor with V-cutting edges and fixed knives |
| Multi Probe Adapter System MPA 5 | Courage & Kazaka Electronic | 10225237 | MPA 5 Station - equipment for measurement hydratation, TEWL and pH |
| Skin pH-meter PH 905 probe | Courage & Kazaka Electronic | Probe to specifically measure the pH on the skin surface or the scalp | |
| Corneometer CM 825 probe | Courage & Kazaka Electronic | Probe to determine the hydration level of the skin surface (Stratum corneum). | |
| Tewameter TM 300 | Courage & Kazaka Electronic | Probe for the assessment of the transepidermal water loss (TEWL) | |
| Heidolph RZR 2020 | Heidolph | 13-225-007-03-1 | Overhead stirrer, mechanical speed setting and stepless transmission; speed range 40-2000 rpm |
| Heidolph mechanical stirrer BR 10 | Heidolph | Z336688-1EA | Blade impeller crossed stirrer |
| Fagor FS 12 | Fagor | BTT-138 | Laboratory refrigerator with freezer space |
| WTW bench pH/mV meter | WTW | Z313165 | High-performance bench pH and pH/conductivity meters for routine and high precision laboratory measurements in research or quality control laboratories |
| Container | RPC Superfos | 13-L plastic bucket, diameter 26 cm, height 26 cm | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Microsoft Office 2010 | Microsoft | ||
| C+K software | Courage and Khazaka Electronic GmbH | MPA 5 station operating software |
References
- United States Department of Agriculture - National Agricultural Statistics Services. Poultry Slaughter, 2016 Summary. , (2016).
- McGovern, V. Recycling poultry feathers: more bang for the cluck. Environ.Health Perspect. 108 (8), A336-A339 (2000).
- Gousterova, A., et al. Degradation of keratin and collagen containing wastes by newly isolated thermoactinomycetes or by alkaline hydrolysis. Lett. Appl. Microbiol. 40 (5), 335-340 (2005).
- Yamauchi, K., Yamauchi, A., Kusunoki, T., Khoda, A., Konishi, Y. Preparation of stable aqueous solution of keratins, and physiochemical and biodegradational properties of films. Biomed. Mater. Res. 31 (4), 439-444 (1996).
- Schrooyen, P. M. M., Dijkstra, P. J., Oberthur, R. C., Bantjes, A., Feijen, J. Partially carboxymethylated feather keratins. 2. Thermal and mechanical properties of films. J. Agric. Food Chem. 49 (1), 221-230 (2001).
- Mark, H. F., Gaylord, N. G., Bikales, N. M. Encyclopedia of Polymer Science Technology: vol. 8: Keratin to Modacrylic Fibers. , Wiley-Interscience. New York. (1968).
- Bertsch, A., Cello, N. A biotechnological process for treatment and recycling poultry feathers as a feed ingredient. Bioresour. Technol. 96 (15), 1703-1708 (2005).
- Grazziotin, A., Pimentel, F. A., de Jong, E. V., Brandelli, A. Nutritional improvement of feather protein by treatment with microbial keratinase. Animal Feed Sci. Technol. 126 (1-2), 135-144 (2006).
- Brandelli, A. Bacterial keratinases: useful enzymes for bioprocessing agroindustrial wastes and beyond. Food Bioprocess Technol. 1 (2), 105-116 (2008).
- Gusta, R., Ramnani, P. Microbial keratinases and their prospective applications: an overview. Appl.Microbiol. Biotechnol. 70 (1), 21-33 (2006).
- Vasileva-Tonkova, E., Gousterova, A., Neshev, G. Ecologically safe method for improved feather wastes biodegradation. International Biodeterior & Biodegradation. 63 (8), 1008-1012 (2009).
- Lodén, M. Hydrating Substance. Handbook of Cosmetic Science and Technology. Barel, A. O., Paye, M., Maibach, H. I. , Informa, Healthcare. New York. 107-119 (2009).
- Teglia, A., Secchi, G. Chapter 9: Proteins in Cosmetics. Principles of Polymer Science and Technology in Cosmetics and Personal Care. Goddard, E. D., Gruber, J. V. , Marcel Dekker. New York. (1999).
- Magdassi, S. Delivery systems in cosmetics. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Engin. Aspects. 123-124, 671-679 (1997).
- Method for producing a protein hydrolysate. U.S. Patent. Dahms, G., Jung, A. , 20140323702 (2014).
- Pons, R., Carrera, I., Erra, P., Kunieda, G., Solans, C. Novel preparation methods for highly concentrated water-in-oil emulsions. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Engin. Aspects. 91 (3), 259-266 (1994).
- Mokrejs, P., Hrncirik, J., Janacova, D., Svoboda, P. Processing of keratin waste of meat industry. Asian J. Chem. 24 (4), 1489-1494 (2012).
- Mokrejs, P., Svoboda, P., Hrncirik, J. Processing poultry feathers into keratin hydrolysate through alkaline-enzymatic hydrolysis. Waste Manage. Res. 29 (3), 260-267 (2011).
- Mokrejs, P., Krejci, O., Svoboda, P. Producing keratin hydrolysates from sheep wool. Orient. J. Chem. 27 (4), 1303-1309 (2011).
- Mokrejs, P., Krejci, O., Svoboda, P., Vasek, V. Modeling technological conditions for breakdown of waste sheep wool. Rasayan J. Chem. 4 (4), 728-735 (2011).
- Polaskova, J., Pavlackova, J., Vltavska, P., Mokrejs, P., Janis, R. Moisturizing effect of topical cosmetic products applied to dry skin. J. Cosmet. Sci. 64 (5), 329-340 (2013).
- Polaskova, J., Pavlackova, J., Egner, P. Effect of vehicle on the performance of active moisturizing substances. Skin Res. Technol. 21 (4), 403-412 (2015).
- Verdier-Sévrain, S., Bonté, F. Skin hydration: a review on its molecular mechanisms. J. Cosmet. Dermatol. 6 (2), 75-82 (2007).
- Darlenski, R., Sassning, S., Tsankov, N., Fluhr, J. W. Non-invasive in vivo methods for investigation of the skin barrier physical properties. Eur. J. Pharm. Biopharm. 72 (2), 295-303 (2009).
- Berardesca, E. EEMCO guidance for assessment of stratum corneum hydration: electrical methods. Skin Res. Technol. 3 (2), 126-132 (1997).
- Rogiers, V. EEMCO guidance for the assessment of transepidermal water loss in cosmetic sciences. Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol. 14 (2), 117-128 (2001).
- Ali, S. M., Yosipovitch, G. Skin pH: from basic science to basic skin care. Acta Derm. Venereol. 93 (3), 261-267 (2013).
- Agache, P., Humbert, P. Measuring the Skin. , Springer-Verlag. Berlin. (2004).
- Council for International Organizations of Medical Sciences. International Ethical Guidelines for Biomedical Research Involving Human Subjects. , Geneva. (2002).
- Ruland, J. K. Transdermal permeability and skin accumulation of amino acids. Int. J. Pharm. 72 (2), 149-155 (1991).
- Draelos, Z. D. Therapeutic moisturizers. Dermatol. Clin. 18 (4), 597-607 (2000).
- Courage and Khazaka Electronic GmbH, Technical Charges. Information and Operating Instructions for the Multi probe Adapter MPA and its Probe. , (2013).
