Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Utarbeidelse av Keratin hydrolyse fra kylling fjær og dens anvendelse i kosmetikk

Published: November 27, 2017 doi: 10.3791/56254
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Department of Polymer Engineering, Faculty of Technology, Tomas Bata University in Zlín, 2Department of Fat, Tenside and Cosmetics Technology, Faculty of Technology, Tomas Bata University in Zlín

Summary

Målet med protokollen er å forberede keratin hydrolyse av kylling fjær av alkaliske-enzymatisk hydrolyse og å teste om legge keratin hydrolyse i en kosmetikk salve base forbedrer huden barriere funksjonen (høyne hydrering og reduseres transepidermal vanntap). Tester er utført på menn og kvinner frivillige.

Abstract

Keratin hydrolyserte (KHs) er etablert standard komponenter i hår kosmetikk. Forstå den fuktighetsgivende effekten av KH er fordelaktig for hudpleie kosmetikk. Målene for protokollen er: (1) å behandle kylling fjær i KH ved alkaliske-enzymatisk hydrolyse og rense det av dialyse, og (2) for å teste om tilføyer KH i en salve base (SR) øker fuktighet i huden og forbedrer huden barriere funksjon av avtagende transepidermal vanntap (TEWL). Under alkaliske-enzymatisk hydrolyse er fjær først ruges ved høyere temperatur i et alkalisk miljø og milde tilfeller hydrolyzed med proteolytisk enzym. Løsning av KH er dialyzed, vakuum tørket og malt til et fint pulver. Kosmetisk formuleringer bestående av olje i vann emulsjon (O/W) med 2, er 4 og 6 vekt % av KH (basert på vekten av OB) forberedt. Testing fuktighetsgivende egenskaper for KH utføres på 10 menn og 10 kvinner i tidsintervaller av 1, 2, 3, 4, 24 og 48 h. testet formuleringer er spredt på degreased volar underarmen nettsteder. Huden hydrering av stratum corneum (SC) vurderes ved å måle kapasitans av huden, som er en av de mest verdensomspennende brukt og enkle metodene. TEWL er basert på å måle mengden av vann transportert per en definert område og tid fra huden. Begge metodene er fullstendig ikke-invasiv. KH gir en utmerket occlusive; avhengig av tillegg av KH i OB bringer det om en 30% reduksjon i TEWL etter påføring. KH også fungerer som en humectant, som det binder seg vann fra de lavere lag av overhuden til SC; optimal KH tillegg i OB oppstår opp til 19% økning i hydration i menn og 22% økning i kvinner.

Introduction

Slakterier, næringsmiddelindustrien og soling industrien produserer årlig enorme mengder solid keratin biprodukter-ull, fjær, bust, hovene, klør, horn og lignende. Ifølge nyeste statistiske data er live totalvekt kyllinger, kalkuner, ender og andre slaktet fjørfe i USA 62,5 milliarder pounds per år1; i EU er det ca 28.7 milliarder pounds per år. Vurderer fjær at opptil 8,5% av totale fjørfe vekten, produserer USA alene årlig ca 5.3 billion pounds av avfall fjær2.

Keratin er et protein viser høy kjemisk motstand fordi det er sterkt krysskoblet med disulfidbroer som gjør behandlingen vanskelig. Få løselig produkter krever cleaving cross-links og muligens utføre hydrolyse av bundet3. Spalting av disulfidbroer kan gå gjennom en reaksjon på thiol anion etter følgende mønster4,5:

Sen- + -SbSc-↔-Sb- + – SenSc-

Med svært høy pH nivå vises hydrolyse av disulfidbroer også, i henhold til det mønster6

-SS- , OH- →-S- ++ -SOH

Under mild forhold (pH ca 8) sted selv sulfitolysis finner etter følgende mønster:

-SS- + HSO3- →-SH + -SSO3-

Den mest økonomiske måten å nedverdigende keratin er mikrobiell sammenbrudd, som er preget av mild reaksjonen forhold under behandling og høy sammenbrudd effektivitet (ca 90%)7,8. Keratinases er produsert av noen bakterier isolert fra jord og keratin avfall9. Mikrobiell keratinases hydrolyze stive og sterkt krysskoblet keratin strukturer10 og den resulterende KH forberedt er rik på fettløselige proteiner, uten tap av essensielle aminosyrer i det11.

For å inkludere et protein i kosmetiske produkter (f.eks, emulsjoner, kremer og geler), sikre kravene at slike proteiner er løselig i vann, gitt systemene er gjennomsiktig, og den ny samlingen av peptider unngås grunn hydrofobe interaksjoner. Derfor er en vanlig praksis å bruke hydrolyserte av proteiner, som hydrolyzed kollagen og elastin keratin. Når du legger til hydrolyserte i kosmetisk emulsjoner, treffes tiltak for å sikre at hydrolysatet først oppløses i vann. I noen tilfeller er det ønskelig at protein (eller hydrolysatet) er oppløselig i alkohol eller andre organiske løsemidler12.

KH er vanligvis omtalt i shampoos, conditioners, lotions og nutritive serum for håret, samt mascaras, neglelakk og øye make-up agenter. KH effektene erklært vanligvis inkluderer danner en beskyttende film, glatte ut håret eller struktur, økt plastisitet og utseendet på behandlet dannelsen, regulere konsistensen av produkter, og oppmuntre dannelsen av skum13 , 14. det har også vist at KH reduserer overflatespenning, derav tilskudd i kosmetikk kan lette reduksjon i mengden emulgator legges til stabilisere kremer. KH begrense virkningene av irritasjon utløst av rengjøringsmidler (tensider) til hud, øyne og hår, dermed redusere eventuelle mulige bivirkninger av rengjøringsmidler på vev (f.eks, dehydrering av huden, hardhet og redusert barriere funksjon huden). Høy bufring evnen til hydrolyserte er også utnyttes til å stabilisere pH i kosmetikk; peptider kortere lengde har en større bufring effekt15,16. Selv om KHs har blitt etablert som standard komponenter i håret og spiker kosmetikk samt utnyttet i produkter for hudpleie, studier på den fuktighetsgivende effekten av KH ikke vises i samtidens litteratur.

Alkalisk-enzymatisk teknologi er utviklet for å behandle keratin biprodukter i KH og aktiv testing pågår om virkningene av en rekke kosmetisk tilsetningsstoffer17,18,19,20 , 21 , 22. fordelen med totrinns alkaliske-enzymatisk hydrolyse bruker mikrobiell proteaser for kylling fjær oppnår høy effektivitet under mild reaksjonen forhold og kvaliteten på KH er svært høy i motsetning til hydrolyse i sterke syrer eller alkalier. I den første fasen, er fjær ruges ved høyere temperatur i et alkalisk miljø, som delvis forstyrrer keratin strukturen og svulmer fjær; etter justere pH, er fjær hydrolyzed med et proteolytisk enzym under mild forhold i den andre fasen. Dialyzed KH har et høyt innhold av proteiner.

Metoden beskrevet her er behandling fjørfe fjær i en KH gjennom alkaliske-enzymatisk hydrolyse og teste effekten av fuktgivende egenskaper av KH på O/W kosmetisk emulsjon. De fuktighetsgivende egenskapene er undersøkt av instrumentale ikke-invasiv metoder i vivo. Hyppigste metoder for måling av huden fuktighet og barriere funksjon av SC inkluderer måle elektrisk eiendom av huden (konduktans eller kapasitans). Metoder for å undersøke SC hydration inkluderer nær infrarød multispectral forestille metoden (NIM), kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi, optical coherence tomografi eller forbigående termisk overføring23. Barriere funksjon av SC korrelerer til TEWL av SC og den måles ventilert kammer metoden, uventilerte kammeret metoden og åpne kammeret metoden24.

Egenskaper for modell formuleringer fastsettes ved hjelp av Multi sonde kortet MPA 5 med tre typer sonder. Den første one, corneometer CM 825, tiltak huden fuktighet ved å vurdere endringer i elektrisk kapasitet på hudens overflate; måle kondensatoren viser endringer i kapasitans av huden overflate i corneometric enheter. Corneometer gir bare en relativ vurdering av hud hydration25. For TEWL brukes andre sonden, tewameter TM 300, for å måle tetthet gradient av fordampning (i en åpen kammer maskinen basert på Ficks diffusjon lov) fra huden indirekte av to par av sensorer (temperatur og relativ fuktighet) angir mengden av vann per en definert område og tid (g/m2h). Denne metoden kan oppdage selv den minste forstyrrelsen huden barriere funksjonen26. Hudens pH er en indikator barriere og anti-mikrobielle funksjon av SC27. Surheten av huden mantelen ble målt ved en (tredje) hud PH 905 proben er koblet MPA 5 stasjonen. Denne spesialdesignet sonde består av en flat-topped glass elektrode for full hudkontakt, koblet til et analogt voltmeter. Systemet måler mulige endringer på grunn av aktiviteten til hydrogen kasjoner rundt svært tynne lag av halvfaste skjemaer målt på toppen av sonden. Endringene i spenning vises som pH28.

Vi presenterer eksperimenter delt i tre: (1) forberedelse av KH kylling fjær av totrinns alkaliske-enzymatisk hydrolyse og rensing sin av dialyse (fjerning salter og lav-molekylær brøker), (2) utarbeidelse av kosmetiske formuleringer som inneholder 2, 4 og 6% KH, og (3) Testing egenskapene til KH ved å måle hud hydration, TEWL, og huden pH. Tester ble utført på 10 kvinner med gjennomsnittlig alder på 27.2 år og 10 menn med middelalder 26.2 år. Metoden for å velge frivillige og testing selv ble utført i samsvar med internasjonale etiske prinsipper av bio-medisinske forskning utnytte mennesker29; alle personer ga sitt samtykke før inkludering i studien. Før testing startet, frivillige ble bedt om å fylle ut et spørreskjema på deres helsetilstand. De frivillige forpliktet til å unngå å bruke kosmetiske produkter til test nettsteder og omkringliggende områder under 24 h før og under testperioden; Videre var de bare tillatt kort kvelden vasker med rennende vann.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Frivillige ble rekruttert blant ansatte og studenter ved vårt universitet. Metoden for valg ble gjennomført i henhold til "internasjonale, etiske retningslinjer for biomedisinsk forskning involvering forsøkspersoner. Rådet for internasjonale organisasjoner i medisinske fag, Genève (2002)." KH er en vanlig kosmetisk ingrediens brukt i hårpleie produkter (sjampo, balsam, etc.) og dermed godkjenning fra institusjonelle gjennomgang styret er ikke nødvendig.

1. prosessen kylling fjær i KH

  1. Samle kylling fjær fra en fjørfe gård.
  2. Vask ut alle uløselig urenheter og blod rester fra kylling fjær med en tilstrekkelig overskudd av ferskvann kjører (kald). Sted fjærene på en flat tallerken og tørre over natten på 50 ° C.
    Merk: Protokollen kan pauses her.
  3. Slipe 50 g tørket fjær i en klippe mill (passer for myk til middels hard prøven materialer og fibrøse materialer) til en siste finhet av 1.0 mm. Alternativt, siste finhet av slipt fjær kan være høyere, men ikke mer enn 3.0 mm.
    Merk: Protokollen kan pauses her.
  4. Avfette fjær
    Merk: Den mest effektive og økonomiske metoden for avfetting fjørfe fjær bruker en kommersiell lipolytic enzym.
    1. I rustfritt stål blande 27-L kjele container med temperaturkontroll, fjær med vann forvarmet til 40 ± 2 ° C i en vekt forhold 1:75. Legge til en lipolytic enzym (aktivitet 100 KLU/g) i en dose på 1,5-2.0% (relatert til veie-in tørr fjær) og forsiktig rør innholdet med en overhead rørestang i 5 min.
    2. Justere blanding pH til 9.0 ± 0,2, verdien som tilsvarer lipolytic enzymet maksimal aktiviteten ved å legge til 1% NaOH eller 1% H3PO4 løsning. Rør blandingen for 5 min med en overhead rørestang, og deretter sjekke og re-justere pH-nivået bruker et laboratorium benk pH/mV meter.
    3. Forsiktig rør blandingen med en overhead rørestang 24 h på 40 ± 0,5 ° C. Alternativt ruge blandingen på 40 ± 0,5 ° C, og under første 6 h med inkubering rør innholdet på 1t intervaller.
    4. Filtrere blandingen gjennom en fin sil (100 µm størrelse) og vask degreased fjær med en strøm av ferskvann kjører (kald). Tørr fjær på en flat tallerken ved 50 ° C i en tørking kammer over natten.
      Merk: Protokollen kan pauses her.
  5. Utføre den første fasen av kylling fjær hydrolyse. Bland fjær med 0,3% KOH vann løsning i et vekt forholdet 1:50 og forsiktig rør med en overhead rørestang på 60 ± 0,5 ° C i 24 timer. PH i blanding reduseres fra ca. 12,5 ved starten av inkubasjon til ca 11.0 på slutten av inkubasjon. Når den første fasen av hydrolyse, justere pH i blanding til nivå tilsvarer maksimalt aktiviteten av proteolytisk enzym med 10% H3PO4 (i dette tilfellet til et nivå av 9.0 ± 0,2) ved å legge til 1% NaOH.
  6. Utføre den andre fasen av kylling fjær hydrolyse. Legg til blandingen, proteolytiske enzymet i en dose 5.0% (relatert til tørr spørsmål om antall fjær veide-i begynnelsen av den første fasen av hydrolyse). Forsiktig rør med en overhead rørestang på 60 ± 0,5 ° C 8 h og varm blandingen (i samme rustfritt stål 27-L kjele container) til et kokepunkt (100 ° C) og kok i 10 min å deaktivere enzymet.
  7. Skille løsning av KH (forberedt i trinn 1.6) fra fra ikke levningen av filtrere det gjennom lav tetthet filter papir på Buchner trakt med liten vakuum-trykk alternativt bruke en sentrifuge.
    Merk: Protokollen kan pauses her i flere dager hvis en løsning av KH lagres på 5 ± 1 ° C.
  8. Dialyze KH bruker 12 K MWCO membran fjerne små peptider og salter i plast bøtte (26 cm diameter x 26 cm høyde). Hell 400 mL KH løsningen i dialyse rør og dialyze det mot 4 L destillert vann 80 h ved romtemperatur; endre destillert vann etter 18, 36 og 60 h.
  9. Kastet en dialyzed løsning av KH på en anti-lim-plate (f.eks, silikon) på en andel av 500 mL til 1000 cm2 plate området, vakuum tørr den på en tynn film på 40 ± 0,5 ° C i natten, male for å danne et fint pulver og holde den i et lukket fartøy i en desiccator.
    Merk: Protokollen kan pauses her i flere måneder hvis KH pulveret lagres på et tørt sted.

2. Forbered kosmetisk formuleringer med KH

Merk: OB brukes til testing var en kommersiell hydrofile O/W krem base og består av aqua, parafin, parafin væske, cetearyl alkohol, Laureth 4, natriumhydroksid, karbomer, methylparaben og propylparaben.

  1. Forberede formuleringer som inneholder 2, 4 og 6% KH (i samsvar med base vekten av salven). Veie mengden KH pulver i en polyetylen fartøy (7 cm diameter x 10 cm høyde) og legge til OB til et beløp som sikrer totalvekt formulering er lik 50 g; se oppskrift i tabell 1.
Kosmetisk formulering Vekten av salve base [g] Vekten av keratin hydrolyse [g] Totalvekt [g]
Salve base 50 0 50
Salve base + 2% KH 49 1
Salve base + 4% KH 48 2
Salve base + 6% KH 47 3

Tabell 1: Vekt-i mengder av salve base og keratin hydrolyse å forberede kosmetisk formuleringer.

  1. Homogenize blandingen med en 3-bladed laboratorium blender for 10 min 134.16 x g og bland med en mekanisk overhead rørestang. Opprettholde de forberedt formuleringene på 5 ± 1 ° C og varme dem ved romtemperatur for 2t før bruk.
    Merk: Homogenisere blanding av OB med KH kan gjøres med en ikke-digitale rørestang også. På en ikke-digitale rørestang er det vekter med den omtrentlige hastigheten (i rpm) også. Mild omrøring fungerer best for dette trinnet.
    Merk: Protokollen kan pauses her i opp til 5 måneder hvis formuleringene lagres på 5 ± 1 ° C.

3. test egenskaper KH måle hud Hydration, TEWL og pH

Merk: Utfør alle målinger i en klimatiserte rom på 23 ± 2 ° C og relativ luftfuktighet på 56 ± 3%.

  1. Sted 5 strimler av filter papir (størrelse 2 x 4 cm) til fysiologiske løsningen (0,90% NaCl) og la dem i ca 1 min i løsningen.
  2. Bruke to strimler på innsiden av den høyre underarmen og tre undersiden av venstre underarm og fikse dem 4 h med selvklebende plaster. Dette trinnet er avfette huden og eliminere individuelle egenskaper av huden på nettstedet. Etter 4 h, fjerne strimler og demark områder med en permanent penn, se figur 1.

Figure 1
Figur 1: metode for plasseringen av testen formuleringer på underarmen til venstre og høyre øvre lemmer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Bruk 0,1 mL av de testede formuleringene på hvert sted av degreased underarmen nettsteder bruker sprøyter og spre den over hele merket overflaten. På venstre underarm, ikke bruke noe på det første stedet (det er kontrollen), bruke OB til den andre siden, og OB + 2% KH til tredje. Bruke OB + 4% KH og OB + 6% KH til den høyre armen.
  2. Mål hver prøve på hvert område og hvert intervall (1, 2, 3, 4, 24 og 48 h) og ta 5 målinger med hud hydration meter proben for hud hydration, 15 målinger med TEWL meter sonden for hud TEWL og 1 lesing med huden pH meter sonden for hudens pH. Ikke la frivillige bruke kosmetiske produkter til test nettsteder og omegn i testperioden; de tillates kort kvelden vasker med rennende vann.
    Merk: Protokollen kan pauses her.
  3. Behandle de resulterende opplesninger av grunnleggende numeriske egenskaper for beskrivende statistikk, bruke regneark. 5 hydration målingene til hvert utvalg og ignorere den laveste og høyeste målinger og beregne bare 3 avlesningene for aritmetisk middelverdi og standardavvik. 15 TEWL målingene til hvert utvalg og ignorere de første 5 og beregne bare 10 målinger for aritmetisk middelverdi og standardavvik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

KH utarbeidet etter prosedyren presenteres her (se figur 2) er gul i fargen, lett løselig i vann med høy proteininnhold (uorganiske faste stoffer representerer < 2.0%), pH i 1,0% løsning av KH er 5.3, og oppfyller kravene for kosmetisk førsteklasses hydrolyserte. Avkastningen av KH fra 50 g råvarer er ca 30%. Molekylvekt fordelingen av KH ble bestemt av SDS-side og vises i Figur 3.

Figure 2
Figur 2: representativt bilde av keratin hydrolyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: SDS side av keratin hydrolyse og protein standarder. Lane 1: ultra-lav molekylvekt markørene (3,5-26,6 kDa). Kjørefelt 2, 3 og 4: keratin hydrolyserte i 3 bunker. 120 µg KH re suspendert i 20 µL lasting buffer ble lastet inn i hver brønn. Lane 5: rekke molekylvekt markør (6.5-200 kDa)

Hydrering og TEWL verdier ble avgrenset i ulike frivillige, og dermed kan ikke sammenlignes med hverandre. Derfor uttrykkes verdiene som endring i prosent sammenlignet med OB på webområdet behandlet med formuleringene, sistnevnte inneholder 2, 4 og 6% tillegg av KH mellomrom for måling av 1, 2, 3, 4, 24 og 48 timer. PH-verdier for hud uttrykkes som det aritmetiske gjennomsnittet for registrerte verdiene av hudens pH for alle frivillige. Resultatene for endring i hydration og TEWL i prosent, i forhold til OB, og pH nivåer av huden er gitt i tabell 2 for 10 menn og tabell 3 for 10 kvinne frivillige.

Menn
Tid 1 h 2 h 3t 4 h 24 h 48 timer
Hydrering (% endre vs Oitment base) ± SD
Salve base + 2% KH + 16 ± 15 + 14 ±16 + 12 ±9 + 19 ±14 + 11 ±18 + 15 ±9
Salve base + 4% KH + 6 ±19 + 1 ±18 + 5 ±10 + 7 ±16 + 11 ±9 + 14 ± 15
Salve base + 6% KH -3 ±25 -4 ±14 -7 ±18 -4 ±17 + 11 ±14 -17 ±14
TEWL (% endre vs Oitment base) ± SD
Salve base + 2% KH -20 ± 15 -20 ±22 -11 ±21 -20 ±21 -23 ±20 -21±17
Salve base + 4% KH -28 ±12 -29 ±20 -28 ±20 -28 ±24 -47 ±20 -36 ±20
Salve base + 6% KH -36 ±16 -41 ±21 -31 ±17 -36 ±17 -53 ±20 -54 ±17
pH
Kontroll 4.7 ±0.5 5.1 ±0.4 4,9 ±0.4 5.1 ±0.3 4.6 ±0.5 4.8 ±0.7
Salve base 4.8 ±0.5 5.1 ±0.3 4,9 ±0.3 5.0 ±0.4 4.6 ±0.4 5.0 ±0.6
Salve base + 2% KH 5.0 ±0.6 4.8 ±0.4 4,9 ±0.5 4,9 ±0.5 4.7 ±0.3 5.0 ±0.6
Salve base + 4% KH 4.8 ±0.5 4,9 ±0.3 4.8 ±0.4 4.8 ±0.3 4.7 ±0.5 4.8 ±0.5
Salve base + 6% KH 4.7 ±0.5 5.0 ±0.2 4,9 ±0.4 4.8 ±0.4 4.8 ±0.6 5.0 ±0.6

Tabell 2: Resultater for endring i hydration, TEWL og pH i huden av 10 menn frivillige på måling intervaller på 1, 2, 3, 4, 24 og 48 timer.

Kvinner
Tid 1 h 2 h 3t 4 h 24 h 48 timer
Hydrering (% endre vs Oitment base) ± SD
Salve base + 2% KH + 22 ±7 + 15 ±6 + 15 ±8 + 12 ±9 + 14 ±14 + 18 ±9
Salve base + 4% KH 0 ±4 -6 ±5 -2 ±5 + 1 ±7 + 10 ±13 + 15 ±10
Salve base + 6% KH -12 ±5 -14 ± 2 -9 ±7 -5 ±9 + 8 ±12 + 10 ±9
TEWL (% endre vs Oitment base) ± SD
Salve base + 2% KH -32 ±1.6 -16 ±3.0 -12 ±1.3 -20 ±0.9 -35 ±1.9 -38 ±1.6
Salve base + 4% KH -41 ±1.1 -37 ±2.7 -24 ±0.8 -34 ±0.9 -44 ±1.5 -38 ±1.9
Salve base + 6% KH -50 ±1.4 -39 ±2.2 -29 ±0.7 -39 ±0.9 -16 ±2.4 -33 ±2.1
pH
Kontroll 5.0 ±0.7 5.3 ±0.3 4,9 ±0.7 5.0 ±0.5 5.0 ±0.8 4.7 ±0.7
Salve base 5.2 ±0.6 5.3 ±0.3 5.2 ±0.7 5.0 ±0.4 5.1 ±0.8 4.8 ±0.7
Salve base + 2% KH 5.4 ±0.7 5.1 ±0.4 4,9 ±0.4 5.1 ±0.7 4,9 ±0.7 5.0 ±1.0
Salve base + 4% KH 5.2 ±0.7 5.1 ±0.3 5.0 ±0.4 4,9 ±0.4 5.1 ±0.6 5.1 ±0.2
Salve base + 6% KH 5.2 ±07 5.2 ±0.2 5.0 ±0.4 5.0 ±0.3 5.4 ±0.6 5.2 ±0.4

Tabell 3: Resultater for endring i hydration, TEWL og pH i huden av 10 kvinner frivillige på måling intervaller på 1, 2, 3, 4, 24 og 48 timer.

Hydrering av SC for menn frivillige:

I korte intervaller for måling (1-4 h), den høyeste økningen i hydration av huden (12-19%) ble registrert for formuleringer supplere OB med 2% av KH; tillegg på 4% KH viste en mindre økning (1-7%) i hydration. Derimot KH på 6% gjenspeiles negativt på verdier for SC hydrering (en reduksjon på 3-7%). Etter 24 timer for måling, ble en økning på 11% i SC hydration oppdaget for alle tillegg av KH til OB testet. Den samme trenden fortsatte selv etter 48 timer, etterfulgt av en svak økning i hydration som forble: en 15% økning for KH på 2%, en økning på 14% til 4% tillegg av KH og slipp av 17% for KH på 6%.

Hydrering av SC for kvinner frivillige:

Det er som supplere OB med 2% KH forårsaker en omtrentlig 22% økning i SC hydration, i forhold til OB alene, så tidlig som 1t måling; en 4% tillegg av KH til OB påvirker, faktisk ikke fuktighet; mens derimot legge 6% KH til OB gjenspeiles i en omtrentlig 12% nedgang i hydration, sammenlignet med ren OB-lignende tendenser er sett etter 2, 3 og 4 h måling, på hvilke hydration øker med 12-15% for tilskudd med 2% KH; for større filer av KH, hydrering enten ressursenheter eller avtar. Etter 24 timer for måling, var hydrering registrert som høyere enn for OB for alle testet KH tillegg; størst økning (14%) i hydration oppstod for tillegg av 2% KH, mens laveste økningen (8%) ble sett for tilskudd på 6% av KH. Lignende resultater oppnås etter 48 timer med målenhet, der større fuktighet enn for ren OB ble registrert for alle prøver med tillegg av KH; den største økningen (18%) i hydration oppstod på 2% KH tillegget, laveste økningen (10%) var kjent for KH tilskudd på 6%.

TEWL for menn frivillige:

Resultatene av TEWL gjør det klart at formuleringer supplert med KH avta TEWL, når påføres huden, med ren OB En økt mengde KH hatt en positiv effekt på lavere verdier av TEWL. Etter 1 time etter bruk av formuleringer, TEWL ble registrert som 20% lavere enn for ren OB, gjelder en formulering med 2% KH; mens KH på 4% droppet 28% i TEWL; mens KH på 6% resultert i en dramatisk 36% nedgang i TEWL. Faktisk ble redusert TEWL verdiene også observert på 2, 3 og 4 h måleenhet for formuleringer supplert med KH. Etter 24 og 48 h, var TEWL også betydelig senket på områder behandlet med KH formuleringer. Etter 24 timer var TEWL observert på huden 23% lavere for OB 2% tillegg KH enn på nettstedet for ren OB; KH på 4% falt med ca 47% TEWL, mens KH på 6% utløste TEWL å falle med 53%. Lignende trender er tydelig selv etter 48 h: TEWL for hud behandlet med OB som inneholder 2% KH var 21% lavere enn på nettstedet for ren OB; KH på 4% viste en TEWL på 36% lavere; og KH på 6% forårsaket en nedgang på 54%.

TEWL for kvinner frivillige:

Det er tydelig at alle overvåkede tillegg av KH til OB skal gjenspeiles i redusert TEWL, som sett i menn frivillige. Etter 1 time fra programmet, ble en betydelig reduksjon i TEWL registrert for OB prøver som inneholder alle tillegg av KH; om en 32% reduksjon i TEWL ble sett for 2% tillegg av KH, rundt en 41% nedgang i 4% KH, og selv en 50% nedgang i TEWL for 6% tilskudd av KH. Etter 2, 3 og 4 h måling intervaller, fremdeles liknende, dvs.er det en nedgang i TEWL med slike tidsintervaller; minst fall i TEWL oppstår 2% KH, mens den største er sett på 6% KH. Etter 2 h, TEWL minsker med 16% av KH på 2%, 37% for KH på 4% og 39% for KH på 6%. På 3 h, TEWL reduserer ytterligere med 12% for KH på 2%, med 24% for KH på 4%, og 29% for KH på 6%. På 4 h, TEWL videre reduseres med 20% 2% KH, 34% til 4% KH og 39% 6% KH. Etter 24 timer, minst reduksjonen i TEWL (16%) oppstod for 6% tillegg av KH, mens den største (44%) ble sett for 4% tilskudd av KH; KH på 2% ble observert for å forårsake en 35% reduksjon i TEWL. På 48 h, fortsatt resultatene lignende og relativt balansert, med minst nedgangen i TEWL (33%) for 6% tillegg av KH, den største (38%) 4% KH og 2% KH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fordelen alkaliske-enzymatisk hydrolyse er at det kan endres etter fremtidige anvendelser av KH. For eksempel i hårpleie kosmetikk programmer der en lett brunlig farge produktet ikke er et hinder, kan en høyere temperatur i hydrolyse brukes fører til en høyere avkastning av KH. I tillegg til lengre behandlingstid under begge trinn av teknologiske prosedyren påvirker betydelig dataregistreringsfeil effektivitet-avkastning av KH stiger til 85%.

Resultatene for hydration måling gjør det tydelig at under overvåkede intervall måling (1-48 h), tillegg av 2% KH til OB er optimal siden det fører en 11-19% økning i SC hydration for menn frivillige og en 12-22% økning for kvinne frivillige. KH som besitter en bred distribusjon av molekylvekt. Vi foreslår at en del av lav-molekylvekt brøker (MW < 20 kDa) trenger overhuden følgende program på huden. Forhøyet hydration av huden etter at en formulering med KH forklarte gjennom KH bindende vannet fra lavere overhuden lag strukturen i SC, fører til dannelsen av H-broer mellom KH molekyler og vann. Denne virkningsmekanismen er også omfavnet av noen forfattere30. Den fuktighetsgivende effekten av KH sammenlignes med konvensjonelle kremer (f.eks, glyserol, urea og hyaluronsyre) som ble testet i emulsjon og gel formuleringer22.

TEWL mål markere at Imens observert måleenhet (1-48 h) for menn frivillige, alle formuleringer med KH kosttilskudd forårsaket TEWL avslå etter påføring. 2% tillegg av KH til OB forårsaket en reduksjon i TEWL på 11-23%, sammenlignet med ren OB Når OB ble supplert med 4% KH, TEWL falt med 28-47%; mens for KH på 6% redusert det med så mye som 31-54%. For kvinne frivillige, supplere OB med 4% KH representerer det beste alternativet, som det var en 24-44% reduksjon i SC TEWL. Den betydelig lavere TEWL for formuleringer supplert med KH kan forklares av prosessen med høyere-molekylvekt fraksjoner av KH danner en beskyttende film en gang på epidermis, og dermed hindre tap av epidermal vann. Faktisk svært positive effekten av KH på TEWL sammenlignes eller overskrider med, for sammenligning verdiene i TEWL registrert for kosmetiske gels eller emulsjoner supplert med 5-10% glyserol og 1-5% av sericin. Tilsvarende når du sammenligner KH med konvensjonelle mineraloljer, redusert KH TEWL ved ca 25-30%31. I tillegg er barriereegenskaper av KH bedre enn, for eksempel for urea og hyaluronsyre22.

pH av huden overflate:

For referanse, pH 3,5 til 4.3 er en syrlig hudoverflaten, pH 4.4 til 5,5 er nøytrale i denne forbindelse, og pH 5.6 til 6,5 representerer en grunnleggende huden overflate32. Vi fant at ingen vesentlige endringer ble observert i pH i hudoverflaten etter at alle de testede formuleringene (OB + 2, 4 og 6% KH); pH i 4.6 til 5.0 (menn frivillige) og 4,9 til 5,4 (kvinne frivillige) tilsvarer en normal hud overflate. Langsiktige analyse (mer enn 2 dager) ble ikke utført.

Endringer og feilsøking:

Behandling av kylling fjær i KH er veldig enkelt, og går under lufttrykk og mild temperatur. Prosessen kan være gunstig forvandlet fra et laboratorium skala til en pilotanlegg skala og industriell skala. I del 2 av protokollen der KH er homogenisert med den (O/W) emulsjonen base, er noen endringer mulig. I industrielle praksis, O/W og W/O emulsjoner er forberedt ved å blande vann (W) fase (vann + kosmetiske ingredienser løselig i vann) og olje (O) fase (olje + kosmetiske ingredienser løselig i olje). KH er løselig i vann, så det er gunstig å blande det direkte i vann fasen av systemet.

Begrensninger av teknikken:

Lokalisering av hver spot for måling hydrering og TEWL og hamret press måles med hud hydration meter som er dyrt.

Avgjørende skritt i protokollen er hovedsakelig i avsnitt 3. Den helse, individuelle forskjeller, røykere/ikke-røykere, kjønn, alder forskjeller, menstruasjon og mental tilstand kan påvirke måling hud hydration og TEWL. Anskaffe representant resultater, skal samme person gjelde testet formuleringer underarmene, måle hydrering og TEWL verdier. Det er viktig å utføre alle målinger i aircondition rom med en stabil temperatur og relativ luftfuktighet. Ved å måle verdier i intervaller på 24 og 48 h, er Akklimatisering av frivillige i en klimatiserte rom i minst 30 min før måling nødvendig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Denne artikkelen ble skrevet med prosjektets IGA/FT/2017/007 av Tomas Bata University i Zlin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material or chemicals
LIPEX 100T Novozymes LJP30020 Lipex - enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 100 KLU/g
Savinase Ultra 16L Novozymes PXN40001 Savinase - enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 16 KNPU-S/g
Potassium hydroxide, KOH Sigma-Aldrich 302510289 Potassium hydroxide, KOH, 97,0 %, Mr 56,11
Phosphoric acid solution, H3PO4 Sigma-Aldrich W290017 Phosphoric acid solution, H3PO4, 85 wt. % concentration in water, Mr 98,00
Sodium chloride physiological solution Sigma-Aldrich 52455 Tablets of BioUltra NaCl physiological solution; 1 tablet in 1000 mL of water yields 0.9 % NaCl
Sodium hydroxide, NaOH Penta s.r.o. 40216 Sodium hydroxide, NaOH, 97,0 %, Mr 40,00
AmiFarm (Cremor base-A) Fagron 608425 Hydrophilic oil in water (O/W) cream base; the composition: aqua, paraffin, paraffin liquid, cetearyl alkohol, Laureth 4, sodium hydroxide, carbomer, methylparaben, propylparaben.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
IKA EUROSTAR POWER control-visc stirrers IKA-labortechnik Z404020 Digital laboratory stirrer, for tasks up to the high viscosity range, 230V, 1/cs
IKA Propeller stirrer, 3-bladed IKA-labortechnik R 1381 Propeller stirrer, 3-bladed, stirrer Ø: 45 mm, shaft Ø: 8 mm, shaft length: 350 mm
Dialysis tubing closures Sigma-Aldrich Z371017-10EA Dialysis tubing closures, red, size 110 mm
Dialysis tubing cellulose membrane Sigma-Aldrich D9402-100FT Dialysis tubing cellulose membrane, average flat width 76 mm (3.0 in.)
DOMO Pot with stailess, LCD DOMO Elektronic DO42325PC Preserving boiler stainless steel, 2000 W, 27-L container (diameter 37 cm, height 30 cm), temperature control 30-100 ° C, operation LCD display
Hettich zentrifugen Universal 32 Gemini bv 2770 GS1R Mid bench centrifuge, speed 18000 rpm
LT 3 shaking device Fischer Scientific 6470.0002 Orbital shaking device
KERN 440-47N Kern 440-47N Laboratory balance
KERN 770 Kern 770 -N Laboratory analytical balance
VENTICELL 222 - Komfort BMT, MMM Group C 131749 Drying oven, temperature control 30-100 ° C, air circulation control
Vacucell 55 - EVO BMT, MMM Group B 050328 Vacuum drying oven, temperature control 30-100 ° C
PULVERISETTE 19 Fritsch 19.1030.00 Universal cutting mill, rotor with V-cutting edges and fixed knives
Multi Probe Adapter System MPA 5 Courage & Kazaka Electronic 10225237 MPA 5 Station - equipment for measurement hydratation, TEWL and pH
Skin pH-meter PH 905 probe Courage & Kazaka Electronic Probe to specifically measure the pH on the skin surface or the scalp
Corneometer CM 825 probe Courage & Kazaka Electronic Probe to determine the hydration level of the skin surface (Stratum corneum).
Tewameter TM 300 Courage & Kazaka Electronic Probe for the assessment of the transepidermal water loss (TEWL)
Heidolph RZR 2020 Heidolph 13-225-007-03-1 Overhead stirrer, mechanical speed setting and stepless transmission; speed range 40-2000 rpm
Heidolph mechanical stirrer BR 10 Heidolph Z336688-1EA Blade impeller crossed stirrer
Fagor FS 12 Fagor BTT-138 Laboratory refrigerator with freezer space
WTW bench pH/mV meter WTW Z313165 High-performance bench pH and pH/conductivity meters for routine and high precision laboratory measurements in research or quality control laboratories
Container RPC Superfos 13-L plastic bucket, diameter 26 cm, height 26 cm
Name Company Catalog Number Comments
Software
Microsoft Office 2010 Microsoft
C+K software Courage and Khazaka Electronic GmbH MPA 5 station operating software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. United States Department of Agriculture - National Agricultural Statistics Services. Poultry Slaughter, 2016 Summary. , (2016).
  2. McGovern, V. Recycling poultry feathers: more bang for the cluck. Environ.Health Perspect. 108 (8), A336-A339 (2000).
  3. Gousterova, A., et al. Degradation of keratin and collagen containing wastes by newly isolated thermoactinomycetes or by alkaline hydrolysis. Lett. Appl. Microbiol. 40 (5), 335-340 (2005).
  4. Yamauchi, K., Yamauchi, A., Kusunoki, T., Khoda, A., Konishi, Y. Preparation of stable aqueous solution of keratins, and physiochemical and biodegradational properties of films. Biomed. Mater. Res. 31 (4), 439-444 (1996).
  5. Schrooyen, P. M. M., Dijkstra, P. J., Oberthur, R. C., Bantjes, A., Feijen, J. Partially carboxymethylated feather keratins. 2. Thermal and mechanical properties of films. J. Agric. Food Chem. 49 (1), 221-230 (2001).
  6. Mark, H. F., Gaylord, N. G., Bikales, N. M. Encyclopedia of Polymer Science Technology: vol. 8: Keratin to Modacrylic Fibers. , Wiley-Interscience. New York. (1968).
  7. Bertsch, A., Cello, N. A biotechnological process for treatment and recycling poultry feathers as a feed ingredient. Bioresour. Technol. 96 (15), 1703-1708 (2005).
  8. Grazziotin, A., Pimentel, F. A., de Jong, E. V., Brandelli, A. Nutritional improvement of feather protein by treatment with microbial keratinase. Animal Feed Sci. Technol. 126 (1-2), 135-144 (2006).
  9. Brandelli, A. Bacterial keratinases: useful enzymes for bioprocessing agroindustrial wastes and beyond. Food Bioprocess Technol. 1 (2), 105-116 (2008).
  10. Gusta, R., Ramnani, P. Microbial keratinases and their prospective applications: an overview. Appl.Microbiol. Biotechnol. 70 (1), 21-33 (2006).
  11. Vasileva-Tonkova, E., Gousterova, A., Neshev, G. Ecologically safe method for improved feather wastes biodegradation. International Biodeterior & Biodegradation. 63 (8), 1008-1012 (2009).
  12. Lodén, M. Hydrating Substance. Handbook of Cosmetic Science and Technology. Barel, A. O., Paye, M., Maibach, H. I. , Informa, Healthcare. New York. 107-119 (2009).
  13. Teglia, A., Secchi, G. Chapter 9: Proteins in Cosmetics. Principles of Polymer Science and Technology in Cosmetics and Personal Care. Goddard, E. D., Gruber, J. V. , Marcel Dekker. New York. (1999).
  14. Magdassi, S. Delivery systems in cosmetics. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Engin. Aspects. 123-124, 671-679 (1997).
  15. Method for producing a protein hydrolysate. U.S. Patent. Dahms, G., Jung, A. , 20140323702 (2014).
  16. Pons, R., Carrera, I., Erra, P., Kunieda, G., Solans, C. Novel preparation methods for highly concentrated water-in-oil emulsions. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Engin. Aspects. 91 (3), 259-266 (1994).
  17. Mokrejs, P., Hrncirik, J., Janacova, D., Svoboda, P. Processing of keratin waste of meat industry. Asian J. Chem. 24 (4), 1489-1494 (2012).
  18. Mokrejs, P., Svoboda, P., Hrncirik, J. Processing poultry feathers into keratin hydrolysate through alkaline-enzymatic hydrolysis. Waste Manage. Res. 29 (3), 260-267 (2011).
  19. Mokrejs, P., Krejci, O., Svoboda, P. Producing keratin hydrolysates from sheep wool. Orient. J. Chem. 27 (4), 1303-1309 (2011).
  20. Mokrejs, P., Krejci, O., Svoboda, P., Vasek, V. Modeling technological conditions for breakdown of waste sheep wool. Rasayan J. Chem. 4 (4), 728-735 (2011).
  21. Polaskova, J., Pavlackova, J., Vltavska, P., Mokrejs, P., Janis, R. Moisturizing effect of topical cosmetic products applied to dry skin. J. Cosmet. Sci. 64 (5), 329-340 (2013).
  22. Polaskova, J., Pavlackova, J., Egner, P. Effect of vehicle on the performance of active moisturizing substances. Skin Res. Technol. 21 (4), 403-412 (2015).
  23. Verdier-Sévrain, S., Bonté, F. Skin hydration: a review on its molecular mechanisms. J. Cosmet. Dermatol. 6 (2), 75-82 (2007).
  24. Darlenski, R., Sassning, S., Tsankov, N., Fluhr, J. W. Non-invasive in vivo methods for investigation of the skin barrier physical properties. Eur. J. Pharm. Biopharm. 72 (2), 295-303 (2009).
  25. Berardesca, E. EEMCO guidance for assessment of stratum corneum hydration: electrical methods. Skin Res. Technol. 3 (2), 126-132 (1997).
  26. Rogiers, V. EEMCO guidance for the assessment of transepidermal water loss in cosmetic sciences. Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol. 14 (2), 117-128 (2001).
  27. Ali, S. M., Yosipovitch, G. Skin pH: from basic science to basic skin care. Acta Derm. Venereol. 93 (3), 261-267 (2013).
  28. Agache, P., Humbert, P. Measuring the Skin. , Springer-Verlag. Berlin. (2004).
  29. Council for International Organizations of Medical Sciences. International Ethical Guidelines for Biomedical Research Involving Human Subjects. , Geneva. (2002).
  30. Ruland, J. K. Transdermal permeability and skin accumulation of amino acids. Int. J. Pharm. 72 (2), 149-155 (1991).
  31. Draelos, Z. D. Therapeutic moisturizers. Dermatol. Clin. 18 (4), 597-607 (2000).
  32. Courage and Khazaka Electronic GmbH, Technical Charges. Information and Operating Instructions for the Multi probe Adapter MPA and its Probe. , (2013).

Tags

Biokjemi problemet 129 alkaliske-enzym hydrolyse kylling fjær keratin keratin hydrolyse kosmetisk formulering salve base humectant hydration transepidermal vanntap
Utarbeidelse av Keratin hydrolyse fra kylling fjær og dens anvendelse i kosmetikk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mokrejš, P., Huťťa,… More

Mokrejš, P., Huťťa, M., Pavlačková, J., Egner, P. Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics. J. Vis. Exp. (129), e56254, doi:10.3791/56254 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter