Summary
بروتوكول يصف بالتفصيل جيل خال من البصمة المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (إيبسكس) من خلايا البنكرياس البشرية في ظروف خالية من علبة التغذية بالورق، تبع هذا التحرير باستخدام ريبونوكليوبروتينس كريسبر/Cas9 وتوصيف لتعديل استنساخ الخلايا المفردة.
Abstract
يمكن أن الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثه pluripotent الذاتي تجديد وتفرق في أنواع خلايا متعددة من الجسم. Pluripotent الخلايا وبالتالي هي مطمعا للبحوث في مجال الطب التجديدي، وحاليا في التجارب السريرية لأمراض العيون، والسكري، وأمراض القلب، والاضطرابات الأخرى. يمكن أن تفرق في أنواع الخلايا المتخصصة مقترنا بالتقدم الأخير في الجينوم تحرير التكنولوجيات بما في ذلك نظام كريسبر/Cas قد أتاحت فرصاً إضافية للخياطة الجينوم من اللجنة التوجيهية للتطبيقات المتنوعة بما في ذلك مرض النمذجة، والعلاج الجيني، ويتحامل مسارات التمايز، سبيل المثال لا الحصر. من بين التكنولوجيات المتاحة التحرير، برز كريسبر/Cas9 من العقدية المقيّحة كأداة للاختيار للتحرير الخاصة بالموقع لجينوم حقيقية النواة. كريسبرس يتم الوصول إليها بسهولة وغير مكلفة، وذات كفاءة عالية في هندسة عمليات التحرير المستهدفة. ويتطلب النظام نوكلياسي Cas9 ودليل تسلسل (20-مير) محددة الهدف الجينوم المتاخم 3-النوكليوتيدات "نج" بروتوسباسير-مجاورة-فكرة (بام) لاستهداف Cas9 إلى موضع الجينوم المرجوة، جنبا إلى جنب مع الراسم ملزمة Cas9 عالمي (الحمض النووي الريبي معا تسمى الحمض النووي الريبي دليل واحد أو سجرنا). نقدم هنا خطوة بخطوة بروتوكول لكفاءة توليد اللجنة التوجيهية وحدة تغذية مستقلة وخالية من البصمة ووصف منهجيات للجينوم التحرير للجنة التوجيهية باستخدام مجمعات ribonucleoprotein (رنب) Cas9. جينوم تحرير بروتوكول فعال ويمكن أن يكون متعدد بسهولة من قبل-إلى سجرناس لهدف واحد أو أكثر مع البروتين Cas9 وفي نفس الوقت تقديم في الخلايا. وأخيراً، يصف لنا اتباع نهج مبسطة لتحديد وتوصيف إيبسكس مع التعديلات المطلوبة. أخذت معا، الاستراتيجيات المحددة التي من المتوقع أن تبسيط إنشاء وتحرير للجنة التوجيهية لتطبيقات متعددة.
Introduction
إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية للدولة pluripotent ب overexpression من إعادة برمجة العوامل قد أحدث ثورة في أبحاث الخلايا الجذعية مع تطبيقات في النمذجة المرض والطب التجديدي، وتطوير العقاقير. تتوفر عدة طرق إعادة برمجة غير الفيروسية لإنجاز إعادة برمجة العوامل وتوليد إيبسكس، ولكن هذه العملية هو العمل المكثف وغير فعالة جداً1. أساليب الفيروسية، على الرغم من كفاءة، ترتبط بمشاكل اندماج الفيروس وتوموريجينيسيتي2،،من34. في هذه المخطوطة، نحن تقرير استخدام هيولى سينداي الفيروس لإيصال إعادة برمجة العوامل وإنشاء خطوط خالية من البصمة اللجنة التوجيهية التي تفتقر إلى التكامل من أي تسلسل النواقل الفيروسية في جينومات على5. سينداي الفيروسات هو فيروس الحمض النووي الريبي التي هي تضعف خارج الخلية السيتوبلازم ~ 10 مقاطع بعد الإصابة وتنتج عوامل إعادة برمجة في وفرة، مما يؤدي إلى سرعة وكفاءة إعادة برمجة6،7. يمكن ثم انتقلت إيبسكس المنشأة إلى متوسط خالية من التغذية لتجنب استخدام الماوس الخلايا الليفية الجنينية (ميفس) كتغذية الخلايا8سهولة.
في هذا المنشور، بالإضافة إلى تحديد الفيروس سينداي بوساطة إعادة برمجة، يصف لنا أيضا بروتوكولا محسنة لتحرير إيبسكس، الذي لديه القدرة على إمداد الخلايا البشرية غير محدود مع التعديلات الوراثية المطلوبة للبحث. وقد استخدمنا التكنولوجيا كريسبر/Cas9 لتعديل إيبسكس، الذي يستخدم الآن لمجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك ضرب الإضافية والضربة القاضية، والحذف الجينوم واسعة النطاق، مكتبة المجمعة الفحص لاكتشاف الجينات، الهندسة الوراثية العديد من الكائنات الحية النموذجية، والجينات العلاج9،،من1011. هذا الأسلوب ينطوي على تشكيل مجمعات العقدية المقيّحة-المتأتية Cas9 nuclease و 20-مير دليل الكشف أن تحقيق الاعتراف المستهدفة عن طريق قاعدة الاقتران مع تسلسل الجينوم الهدف المجاورة المتاخمة النوكليوتيدات بروتوسباسير 3 ' تسلسل عزر (بام). نوكلياسي Cas9 يدفع النيوكليوتيدات كسر الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة ~ 3 من الموقع بام، الذي تم إصلاحه بعد ذلك غالباً بنهاية غير المتجانسة الانضمام إلى مسار (نهيج) مما يؤدي إلى عمليات الإدراج أو الحذف في إطار القراءة المفتوحة، والوظيفية مما خروج المغلوب من الجينات12.
لدينا بروتوكول تحسين يتضمن التفاصيل للثقافة البشرية خلايا البنكرياس، برمجة على ميتوتيكالي إبطال الماوس الخلايا الليفية الجنينية (ميفس) لتحقيق كفاءة أعلى لإعادة برمجة، التكيف اللاحقة إلى ثقافة خالية من علبة التغذية بالورق في ماتريجيل، وصف إيبسكس المنشأة، تسترشد كريسبر تصميم الحمض النووي الريبي والتحضير، وإيصالها إلى إيبسكس كمجمعات رنب وحيد الخلية الفرز لتوليد خطوط الاستنساخ من المحرر إيبسكس وسهلة الفحص وتحديد عمليات التحرير، ووصف استنساخ خلية مفردة. الحذف الجينوم تم إنشاؤها بكفاءة في هذه الدراسة بالأخذ بالبروتين Cas9 وهما كريسبر سجرنا رنب مجمعات للحث على فواصل الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة (دسبس) والجزء الحذف التدخل. يستغل هذا الأسلوب استخدام دليلين لتوليد عمليات الحذف في إطار القراءة المفتوحة، وكفاءة عالية نهيج مما أدى إلى انخفاض عدد استنساخ هذا ضرورة أن تتسم، ومن السهل فرز أولى من الحيوانات المستنسخة بشعري الآلي وحدة التفريد، محلل يفتت. قريبا ستصبح هذه الجينوم فعالة تحرير طرق لتوليد نماذج الأمراض البشرية القائمة على الخلايا الجذعية نهج موحد والروتينية في أي مختبر الخلايا الجذعية. وأخيراً، تحرير الجينوم الدقيقة سيجعل من الممكن تذهب إلى أبعد من الخلايا الجذعية مرض النمذجة ومحتملة يمكن أن تساعد في تحفيز العلاجات المستندة إلى الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-"بروتوكول إعادة برمجة"
- جيل من اللجنة التوجيهية البشرية من خلايا البنكرياس البشرية الأولية
- معطف 6-فضلا عن لوحة مع 1.5 ملغ/مل من الكولاجين الباردة والسماح لجل في 37 درجة مئوية حاء – 1
- لوحة مرور أوائل البشرية خلايا البنكرياس الابتدائي في المتوسط الثالث بريجروو (~ 1-1.5 × 10 5 خلايا) على الكولاجين مغلفة بلوحة 6-جيدا في اليوم-2 لتحقيق حوالي 2.5 × 10 5 خلايا أو على الأقل 60% كونفلوينسي الواحدة وكذلك في اليوم تنبيغ (يوم 0). الدراسة الأولى، لوحة آبار على الأقل 2-3 للحصول على بئر واحدة مع كونفلوينسي المطلوب في اليوم 0. استخدام بئر واحدة على الأقل كعنصر تحكم لعد الخلايا.
- في يوم تنبيغ (يوم 0)، الحارة 1 مل متوسطة الثالثة بريجروو في حمام مائي لكل بئر يكون ترانسدوسيد. حصاد الخلايا من عنصر تحكم واحد في 1 مل 10% FBS المتوسطة باستخدام 1 مل التربسين/يدتا لمدة 5 دقائق أو حتى فصل الخلايا لأداء حساب خلية. لجعل 10% FBS المتوسطة، إضافة دميم، 10% FBS، 1% ل الجلوتامين، 1% "بيروفات صوديوم" و 1% الأحماض الأمينية غير الأساسية-
- العد والتحقق من صلاحية الخلايا باستخدام العداد الخلية وحساب حجم كل الفيروسات اللازمة لبلوغ هذا الهدف استناداً إلى عيار عدد والفيروس في الخلية. استخدام تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من كوس = 5، حركة hc = 5 و hKlf4 = 3 لخلايا البنكرياس.
- الدفء في مجموعة واحدة من سينداي ناقلات الأنابيب في التخزين-80 درجة مئوية على الجليد وإضافة المحسوبة أحجام كل من سينداي ثلاث ناقلات الأنابيب بعناية إلى 1 مل من بريجروو الثالث المتوسط، استعد مسبقاً إلى 37 درجة ماصة جيم برفق لخلط الحل. بئر واحدة في لوحة 6-جيدا بما فيه الكفاية ترانسدوسينج مع سينداي النواقل الفيروسية لتوليد خلايا أعيدت برمجتها.
- نضح المتوسطة الثالث بريجروو من الخلايا، وإضافة خليط الفيروس إعادة برمجة ببطء إلى الآبار التي تحتوي على الخلايا. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية مع جو هوميديفيد من 5% CO 2-
- بعناية تجاهل خليط الفيروس في الخلايا واستبدالها جديدة بريجروو الثالث المتوسط في اليوم التالي، 24 ساعة بعد توصيل. الثقافة الخلايا لمد 5 وتغيير في المتوسط كل يوم بديل.
- في يوم 5، إعداد ميفس 0.1% الجيلاتين المغلفة قبل 10 سم ثقافة الأطباق (1.3 × 10 6 خلايا/الطبق). تنمو MEFs في قوارير T175 حتى يوم 4 وثم في اليوم 5، تعرض الخلايا إلى راد 6,000 من مصدر إشعاع γ قبل البذر الخلايا 13 أو استخدام مصدر MEF التجارية-
- في يوم 6، استخدم 1 مل من محلول مفرزة خلية لمدة 10 دقائق لفصل الخلايا ترانسدوسيد ولوحة كل منهم على الأطباق MEF في بريجروو الثالث المتوسط مع مثبط روك (5 مم من الأوراق المالية، والنهائي 10 ميكرون) واحتضان بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية مع أتموسفي هوميديفيد إعادة 5% CO 2- تغيير
- بريجروو الثالث المتوسط إلى متوسط هيس في اليوم التالي. لجعل 500 مل متوسطة هيس، إضافة دميم/و-12، 20% (v/v) خروج المغلوب المصل الاستبدال (قصر)، 5 نانوغرام/مل بفجف؛ الجلوتامين l 1 مم؛ الأحماض الأمينية غير الأساسية 100 ميكرومتر و 100 ميكرومتر 2-mercaptoethanol. تغيير الوسط بلطف كل يوم الآن.
- مراقبة لوحات بانتظام لظهور كتل الخلية أو المستعمرات الإرشادية للخلايا أعيدت برمجتها. وتشكل الخلايا المحولة المجاميع الاستنساخ مع مورفولوجيا حصاة كبيرة ونواة كبيرة ونوكليولي. مارك المحتملة ' اللجنة التوجيهية ' المستعمرات والتحقق منها بشكل منتظم للنمو-
- بعد توصيل أربعة أسابيع تقريبا كما المستعمرات مستعدون للانتقاء أو نقل، وإعداد لوحات MEF 24-جيدا بطلاء 1.3 × 10 6 خلايا/الجيلاتين اللوحة مغلفة مسبقاً كما كان من قبل لنقل المستعمرات واحد.
- إعداد مصفوفة غشاء (مثلاً، ماتريجيل) التي اليقوتينج أنها تستند إلى عامل التخفيف على شهادة التحليل. إضافة قاسمة واحد إلى 25 مل من دميم/و-12 إلى معطف جيدا 6 أربعة ألواح (1 مل/جيد) واحتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) على الأقل 1 ساعة قبل الاستخدام. اختيار المستعمرات 12-24 يدوياً باستخدام تلميح ماصة معقمة لنضح منها ونقل على لوحات MEF في 500 ميليلتر من المتوسطة هيس. نضح
- وسائل الإعلام في البئر لعرقلة بلطف أو التفكك في المستعمرات. اختيار المستعمرات 24-48 على مصفوفة غشاء معدني مغلف لوحات 24-جيدا أيضا. لوحات الأغشية المغلفة، واستخدام mTeSR1 (تستكمل مع 10 ميكرون روك المانع) ح 24 وتغيير كل يوم. ضمن 6-10 د للانتقاء المستعمرات، أنهم على استعداد لنقلها إلى لوحات غشاء 24-جيدا و/أو 12-بئر جديدة للتوسع في الاستنساخ.
- إذا لزم الأمر، فصل المستعمرات في ميفس باستخدام كولاجيناز 1 ملغ/مل لمدة 20 دقيقة، يغسل مرتين مع هيس/mTeSR1 ونقل إلى غشاء المغلفة لوحات 12 أو 24 جيدا. إذا كان هناك ما يكفي مستعمرات قوية تنمو على الغشاء مصفوفة من الخطوة 1.1.12، تجميد المستعمرات في ميفس باستخدام اللجنة التوجيهية تجميد وسائل الإعلام وفقا للشركة المصنعة ' المبادئ التوجيهية s-
- فصل المستعمرات قوية مطلي على الغشاء في خطوة 1.1.12 استخدام 500 ميليلتر من ديسباسي لمدة 20 دقيقة ولوحة مرة أخرى على غشاء مصفوفة مغلفة بلوحات 12-جيدا. كشط يدوياً إيقاف أي خلايا متمايزة أو تلويث MEF تغذية الخلايا لإثراء لاستنساخ pluripotent على الغشاء.
- توسيع المستنسخين بعد د 6-8 بتزايد في غشاء معدني مغلف بلوحات بالناي بحل ديسباسي قبل وتصفيح المجاميع خلية صغيرة على الغشاء الطازجة المغلفة جيدا 6 أو 12 لوحة. تغيير mTeSR1 المتوسطة يوميا. تميز المستنسخين أعيدت برمجتها قبل الفوسفاتيز القلوية تلطيخ، immunostaining بلوريبوتينسي علامات (OCT3/4 ونانوج)، نظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل علامات pluripotent السطحية وفحوصات التمايز. تنمو والثقافة المستنسخين على ألواح المغلفة بغشاء لجميع الاختبارات بما في ذلك تحرير كريسبر كما هو موضح أعلاه إلا إذا حل طلاء أخرى مذكورة بالتحديد-
- إيبسكس "توصيف الإنسان"
- "الفوسفاتيز القلوية" تلطيخ
ملاحظة: يتم استخدام مجموعة تجارية هنا. انظر الجدول المواد.- لوحة إيبسكس البشرية المفترضة في لوحة 24-جيدا والثقافة عن د 4-5 مع تغيير وسائط يوميا.
- بدء تشغيل البروتوكول المصبوغة ونضح المتوسطة الثقافة وتغسل الخلايا مع 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني مع 0.05% 20 توين (ببست)-
- إضافة 0.5 مل من محلول الإصلاح في هذه المجموعة على الخلايا واحتضان في RT لدقيقة أسبيراتي الحل من 2 إلى 5 ويغسل الخلايا الثابتة مع ببست. لا تسمح الآبار الجافة.
- إضافة 0.5 مل من AP الطازجة "الركازة حل" كل بئر بخلط حل ألف وباء وجيم إينكوباتي الخلايا في الظلام (ملفوفة بإحباط أو في حاوية الظلام) في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى من 5 إلى 15
ملاحظة: عن كثب رصد تغيير اللون والتوقف عن رد فعل عندما يتحول اللون مشرق لتجنب تلطيخ غير محددة. - وقف رد فعل يسفط الحل الركازة AP وغسل الآبار مرتين مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1 س.
- مراقبة المستعمرات تحت المجهر، والتقاط الصور في 4 X أو 10 X التكبير باستخدام مجهر الحقل مشرق أي مع كاميرا.
- إيمونوستاينينج
- لوحة إيبسكس البشرية في لوحة 24-جيدا والثقافة عن د 4-5 مع تغيير وسائط يوميا.
- يغسل خلايا مرة واحدة بإيجاز مع برنامج تلفزيوني والإصلاح لمدة 20 دقيقة مع بارافورمالدهيد 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني.
- أغسل ثلاث مرات عن 10 دقيقة (3 x، 10 دقيقة) مع برنامج تلفزيوني في الرايت
- ساتوراتي غير محددة المواقع مع 10% عادي الماعز أو حمار المصل (NS، اعتماداً جسم الحيوان الثانوية أثير في) في برنامج تلفزيوني لمدة 40 دقيقة في الرايت فقط داخل الخلايا [ابيتوبس]، تشمل 0.3% TX-100 في برنامج تلفزيوني (تكساس/برنامج تلفزيوني) بيرميبيليزي-
- أغسل 3 x 5 دقيقة مع برنامج تلفزيوني في الرايت
- تمييع الأضداد OCT4، نانج، TUJ1، NKX2-5 و SOX17 في حل جديد من 5% NS في برنامج تلفزيوني واحتضانها ح 2 في الرايت أو بين عشية وضحاها في 4 ° C.
- أغسل x 3 لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني في الرايت
- تمييع أليكسا الثانوية المناسبة فلور 488 أو الأجسام المضادة 568 في 5% NS/برنامج تلفزيوني واحتضان خلايا ح 1 في الرايت
- أغسل x 3 لمدة 5 دقائق في الرايت
- احتضان مع DAPI في برنامج تلفزيوني عن 10 دقيقة ويغسل x 2 لمدة 5 دقائق في الرايت استخدام مجهر فلوري لالتقاط الصور-
- Fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)
- إيبسكس البشرية لوحة في لوحة 6-جيدا والثقافة حتى المستعمرات تصبح روافد 80% (على الأقل 10 5 خلايا/sample) مع تغير متوسط mTeSR1 اليومية.
- اليوم من التجربة، عزل الخلايا وننأى بتعليق خلية واحدة فقط كما هو موضح أعلاه في البروتوكول. أغسل بمتوسط 10% FBS.
- لعلامات السطحية، ريسوسبيند في 0.5-1 مل 10% FBS المتوسطة والحفاظ على مدت
- لعلامات داخل الخلايا، ريسوسبيند في 1 مل 4% PFA/برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يغسل مع 10% FBS المتوسطة. ريسوسبيند في 0.1% TX/برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد. أغسل مرة أخرى بنسبة 10% FBS المتوسطة. ريسوسبيند 0.5-1 مل 10% FBS المتوسطة والحفاظ على مدت
- إضافة 50 ميليلتر من تعليق خلية إلى 50 ميليلتر من 10% FBS المتوسطة التي تحتوي على أوصى بمقدار من هيئة تنظيم الاتصالات-1-60، وهيئة تنظيم الاتصالات-1-81 أو الأجسام المضادة سا-4 واحتضان لمدة 30 دقيقة إلى حاء – 1
- يغسل مرتين مع 10% FBS.
- ريسوسبيند في 100 ميليلتر من 10% FBS المتوسطة التي تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية الفلورسنت واحتضانها ل 30 دقيقة أغسل مرتين مع 10% FBS وريسوسبيند في المجلد المناسب من 10% FBS. الخلايا الحية يمكن أن تكون متباينة من الخلايا الميتة بصبغ يوديد propidium تضاف في < 1 ميكروغرام/مل لتقدير الخلية المبرمج أثناء العملية-
- التمايز ثلاثي النسب
- البذور هما لوحات 6-جيدا مع 1.5--2 × 10 6 إيبسكس/بئر في المتوسطة mTeSR1 مع 10 ميكرون روك المانع.
- تسمح للخلايا للنمو لمد 2-3 مع صحيفة mTeSR1 تغير متوسط حتى هي 80-90 في المائة من الآبار المتلاقية.
- لتحريض الأديم الظاهر، أضف التعريفي العصبية المتوسطة (نيم) وفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s في الآبار 2-3 لوحات 6-جيدا- تغيير
- في المتوسط إلى ربمي التي تحتوي على الملحق 2% B27 ناقص الأنسولين و 12 ميكرومتر CHIR99021 لتحريض mesoderm في الآبار 2-3 لوحات 14. إضافة ربمي فقط التي تحتوي على الملحق 2% B27 ناقص الأنسولين ميكرومتر حاء 24 المقبلة على إضافة 5 IWP4 إلى المتوسطة ربمي مع 2% B27 الملحق ناقص الأنسولين عن 24 ساعة القادمة. بعد 72 ساعة، استبدال الوسائط مع ربمي التي تحتوي على الملحق 2% B27 يؤدي إلى توليد ضرب كارديوميوسيتيس في 2-3 د
- لتحريض الأنسجة، تغيير وسيلة في آبار ألواح 6-جيدا إلى 131 مكدب تكملة مع بيكربونات الصوديوم 1.5 غرام/لتر، 1 x جلوتاماكس، الجلوكوز 10 ملم، 0.5% جيش صرب البوسنة، 100 نانوغرام/مل GDF8، و 5µM من CHIR99021 ل h. 24 الثقافة في المتوسط نفسه دون CHIR99021 لمد 2-3 15-
- يتبع البروتوكول إيمونوستينينج من الخطوة 2 لكل الأنساب ثلاثة، وتحقق للتعبير عن علامات ذات الصلة-
- "الفوسفاتيز القلوية" تلطيخ
2. اللجنة التوجيهية "تحرير الإنسان" الجينوم استخدام كريسبر-Cas9
- البروتين إعداد Cas9 وسجرنا
- Cas9 الكوة البروتين في أنابيب ميكروسينتريفوجي في ظروف معقمة وتخزينها في مختبرين بتجميد هذه الأنابيب في-80 درجة مئوية.
- تصميم اثنين استهداف دليل الكشف كل الجينات استناداً إلى البرنامج من معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا (http://www.genome-engineering.org/crispr/) أو أي كريسبر الأخرى دليل تصميم ويبتول. استهداف إكسون الأولى أو الثانية من الجينات (استناداً إلى الإطار القراءة المفتوحة) لتوليد بالضربة القاضية. اختر اثنين وأدلة حتى بعد أن قطعوا قريبة من بعضها البعض (~ 30-100 bp بعيداً) ونحن يمكن أن تصور بسهولة الحذف باستخدام نفس المجموعة من فحص كبسولة تفجير. اختر خطوط إرشاد من إنتاج البرمجيات على أساس نقاط جودة أعلى وأدنى عدد من مواقع خارج الهدف. تصميم فحص كبسولة تفجير باستخدام البرنامج التمهيدي الانفجار (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). الفحص الأولى للتدريب ينبغي أن يكون على الأقل 100 قطع bp بعيداً عن Cas9 المواقع ويفضل أن يكون حجم المنتج بكر بين 400-700 شركة بريتيش بتروليوم للتضخيم أسهل بواسطة PCR. تصميم
- اليغو سجرنا تكميلية بين السلطات الوطنية المعينة (19-22 النيوكليوتيدات في الطول تبعاً للتسلسل دليل) مع Bsa1 قطع الموقع في نهاية كل. يمكن توليفها تجارياً اليغو السلطات الوطنية المعينة وتعتيق بشكل مزدوج-حبلا الحمض النووي. للصلب، إضافة 1 ميليلتر من كل 100 ميكرومتر أدلة، 25 ميليلتر من الصلب المخزن المؤقت (10 ملم تريس، pH7.5-8.0، 50 مم كلوريد الصوديوم، 1 مم يدتا) و 23 ميليلتر من الماء. احتضان في ثيرموسيكلير المبرمجة إلى 95 درجة مئوية 2 دقيقة وثم التبريد تدريجيا إلى 25 درجة مئوية أكثر من 45 دقيقة في بداية
- يهضم استنساخ 2 ميليلتر من الشظايا الناتجة في إنزيم تقييد Bsa1 1 ميليلتر المروج T7 داخلية pCR2.1 مكافحة ناقلات مع موقع ربط Cas9 استخدام الحمض النووي T4 ليجاسى وفقا للشركة المصنعة ' بروتوكول s-
- تسلسل أجزاء الحمض النووي المستنسخة، وعندما يتم تأسيس الإخلاص، في المختبر نسخ الحيوانات المستنسخة باستخدام مجموعة أدوات T7 لتوليد الكشف دليل واحد. تنقية سجرناس مع مجموعة تجارية والوتي في المياه خالية من رناسي. تحقق من أن تركيز الحمض النووي الريبي.
- تعداء هيبسكس
- الثقافة هيبسكس في المتوسط mTeSR1 كما هو موضح أعلاه حتى الخلايا روافد 40-50 ٪.
- ساعتين قبل نوكليوفيكتيون، استبدال المتوسطة مع 2 مل متوسطة mTeSR1 بريوارميد التي تحتوي على 10 ميكرومتر روك المانع.
- ساعة واحدة في وقت لاحق، إعداد الآبار الوجهة للخلايا نوكليوفيكتيد بغشاء يسفط، أعدت الصيغة الواردة أعلاه، من لوحة 12-جيدا واستبدال مع بريوارميد 1 مل من المتوسطة mTeSR1 مع 10 ميكرون روك المانع. تبقى في 37 درجة مئوية للاحتضان. الملحق
- تحضير نوكليوفيكشن الرئيسية ميكس (مقياس مناسب اعتماداً العينات) لكل عينة بإضافة ميليلتر 16.4 الخلية الابتدائية P3؛ ميليلتر 3.6 من الملحق 1 من مجموعة نوكليوفيكتور; 0.5 ميكروغرام من البروتين Cas9 و 0.5 ميكروغرام لكل سجرنا في 22 ميليلتر في حجم رد الفعل. ناقل بروتينات فلورية خضراء بماكس كما كان نوكليوفيكتيد حسب الشركة المصنعة ' توصيات s في الخلايا تقريبا تقدير كفاءة اللجنة التوجيهية تعداء.
- يغسل كل جيدا مع 2 مل من "الرايت برنامج تلفزيوني" بعد يسفط المتوسطة التي تحتوي على مثبطات روك من آبار اللجنة التوجيهية. ثم نضح برنامج تلفزيوني، وإضافة 1 مل من محلول مفرزة الخلية، واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية للحد الأدنى 10 ريسوسبيند الخلايا في 3 مل متوسطة mTeSR1
- ولطف "الماصة؛" صعودا وهبوطاً لتوليد تعليق خلية واحدة. نقل فصل الخلايا للطرد مركزي 15 مل أنبوب يحتوي على 5 مل mTeSR1 المتوسطة- حساب عدد الخلايا مع خلية مكافحة
- وحساب الحجم الإجمالي المطلوب ل 0.5 × 10 6 خلايا/تعداء. وضع الكمية المطلوبة من الخلايا في الأنبوب الطرد المركزي 15 مل والطرد المركزي في 200 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت ونضح المادة طافية.
- ريسوسبيند كل وحدة من 0.5 × 10 6 خلايا في 22 ميليلتر من مزيج الرئيسي تعداء إعدادها في الخطوة 4. بسرعة نقل الخلايا إلى الدائرة المركزية من بئر واحدة قطاع نوكليوكوفيتي. وضع قطاع غزة إلى خلايا نوكليوفيكت وجهاز نوكليوفيكتور استخدام برنامج CB150-
- بعد نوكليوفيكتيون، بسرعة إضافة ميليلتر 80 من متوسطة mTESR1 بريوارميد التي تحتوي على 10 ميكرومتر روك مثبط لكل بئر من الخلايا نوكليوفيكتيد. المزيج بلطف من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
- برفق بنقل الخلايا من القطاع إلى الآبار للوحة 12-جيدا قبل المغلفة غشاء المحتوية على mTeSR1 المتوسطة مع مثبط روك إعدادها في الخطوة 3-
- د بعد 1، تغيير إلى متوسط mTeSR1 جديدة دون المانع روك. حصاد الخلايا د 2-3 بعد نوكليوفيكتيون لفرز الخلايا المفردة.
- عزلة وحيدة الخلية المستهدفة هيبسكس
- يوم واحد قبل الفرز، إعداد لوحات MEF 96-جيدا قبل البذر 2 × 10 6 خلايا/الجيلاتين-المغلفة صفيحة في المتوسط 10% FBS. 70-80 في المائة من الحيوانات المستنسخة البقاء على قيد الحياة بعد نوكليوفيكتيون، ويمكن إعداد لوحات MEF 2-3 لكل تجربة التحرير-
- في الحضانة بين عشية وضحاها، في أعقاب تغيير المتوسط إلى المتوسط هيس (كما تم وصفه سابقا) وتستكمل مع 100 نانوغرام/مل بفجف، 1 x SMC4 (مثبطات إضافة إلى وسائل الإعلام لتعزيز استمرارية خلية مفردة)، و 5 ملغ/مل فيبرونيكتين لتعزيز التصاق.
- استبدال المتوسطة في هيبسكس في لوحة 12-جيدا من mTeSR1 إلى mTeSR1 المتوسطة وتستكمل مع 1 x SMC4 على الأقل 2 ح قبل فرز خلية مفردة.
- نضح المتوسطة من هيبسكس وغسل الخلايا بلطف مع برنامج تلفزيوني. إضافة 500 ميليلتر من الخلية المفرزة الحل في كل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بعد يسفط في برنامج تلفزيوني. إنشاء تعليق خلية واحدة بإضافة 1 مل mTeSR1 (أونسوبليمينتيد) لكل بئر وبيبيتينج صعودا وهبوطاً بلطف عدة مرات.
- وضع تعليق خلية في أنبوب مخروطي 15 مل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 x ز في المادة طافية الرايت أسبيراتي وريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل mTeSR1.
- فرز الخلايا الموجودة في الخلايا المفردة باستخدام أرز خلية مع فوهة 100 ملم تحت ظروف معقمة مع خلية واحدة في البئر الفردية من لوحات 96-جيدا إعدادها في الخطوة 1-
- تشكيل مستعمرة ينبغي أن يكون واضحا؛ استبدال أربعة أيام بعد الفرز، في هذه المرحلة المتوسطة الثقافة مع هيسك المتوسطة وتستكمل مع 1 x SMC4.
- ثمانية أيام بعد الفرز، يستبدل المتوسطة المتوسطة هيس والثقافة ل 2 د
- فصل المستعمرات استخدام كولاجيناز 1 ملغ/مل لمدة 20 دقيقة ونقلها إلى 24-جيدا غشاء معدني مغلف لوحات في mTeSR1 مع مثبط لموسيقى الروك. واسمحوا استنساخ خلية واحدة تنمو واستخراج عينات من الحمض النووي الجينوم بعد تكرار أو توسيعها. استخدام جينات محددة كبسولة تفجير لتضخيم الهدف الحمض النووي من PCR. مزيج
- استخدام جزء محلل طقم للفحص الأولى بكر الهدف تضخيم منطقة الجينوم لجميع النسخ بتشغيلها من خلال جل/الصبغة حسب الشركة المصنعة ' تعليمات s. تقدير حجم الشظايا الناتجة في البرنامج بروسيزي بمقارنته مع سلم المناسبة، التي يتم تشغيلها باستخدام العينات. التسلسل المتوقع ' تحرير ' استنساخ وتحليل تسلسل البيانات للتأكد من التحرير أو الحذف.
- للتفريق بين استنساخ مونواليليك وبياليليك، تضخيم تسلسل تم تحريرها مع بكر واستنساخ في ناقلات pJET1.2. إرسال مالا يقل عن 8-10 الحيوانات المستنسخة للتسلسل وتدقيق التسلسل لتأكيد التحرير في أحد أو كلا الآليلات.
- بمجرد استنساخ اللجنة التوجيهية بنجاح المستهدفة قد تم تحديدها من خلال التنميط، فحص للتأكد من أن لديهم لا فقدت بلوريبوتينسي أو المكتسبة شذوذ الكروموسومات خلال العملية-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذا المنشور، وقد تابعنا بروتوكول بسيطة ولكنها فعالة للجيل من اللجنة التوجيهية من خلايا البنكرياس البشرية باستخدام التكامل أو ناقلات خالية من بصمة الفيروس سينداي. ويظهر الشكل 1A تمثيل تخطيطي هذا البروتوكول إعادة برمجة. وتم شراء خلايا البنكرياس البشرية تجارياً، مثقف في المتوسط الثالث بريجروو وترانسدوسيد مع الفيروس سينداي كما هو موضح أعلاه. المغزل ترانسدوسيد على شكل خلايا البنكرياس لم تظهر أي تغييرات مورفولوجية ~ 5 أيام بعد توصيل الفيروسات سينداي اليوم 0، ولكن ثم تصبح تقريب مع نواة أكبر ونوكليولي. وشوهدت بعض المستعمرات مبكرة بعد توصيل بعد أسبوع ولكن أنهم اعتقلوا ليس، كما هو الحال في تجربتنا، هذه المستعمرات ننأى بسرعة، وهي عادة 'الخلايا أعيدت برمجتها جزئيا المبكر' التي لا تنشئ المستعمرات قوية. توصيل بعد 10-15 يوما تقريبا، المستعمرات مشرق الصغيرة شوهدت وتم انتقاؤها بعد النمو (الشكل 1B، أعلى اليمين). المستعمرات البشرية اللجنة التوجيهية الاتفاق، معبأة بأحكام مع حواف واضحة (يعتبر 'أعيدت برمجتها تماما الخلايا') (الشكل 1B، يوم 23 السفلي الأوسط) و 'خلايا أعيدت برمجتها جزئيا' فضفاضة مع وجود ثغرات في المستعمرة (الشكل 1B، يوم 23 أسفل اليمين). المستعمرات خلية البنكرياس أعيدت برمجتها كانت تنمو في يوم 18 (الشكل 1B، أسفل اليسار) وكانت كبيرة بما فيه الكفاية لانتقاء يدوياً قبل يوم 23 (الشكل 1B، الوسط السفلي). كانت مطلي المستعمرات على ألواح المغلفة بغشاء بعد الانتقاء للحصول على تغذية خالية اللجنة التوجيهية قبل يوم 30-40 (يسارالشكل 2A، ). بعض من هذه المستعمرات خالية من تغذية 'قوية' تم توسيع وتتميز للتعبير عن الفوسفاتيز القلوية، بلوريبوتينسي وعلامات السطح في ظروف خالية من علبة التغذية بالورق. جميع المستنسخون اختبارها كانت إيجابية بالنسبة الفوسفاتيز القلوية كما أنهم حولوا أحمر بعد الفحص (حقالشكل 2A، ). كما لوحظت علامات بلوريبوتينسي OCT4، نانوج، SSEA4، وهيئة تنظيم الاتصالات-1-60 وهيئة تنظيم الاتصالات-1-81 عاليا يعبر عنه في جميع النسخ إيمونوستاينينج أو تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية (الشكل 2B و الشكل 3 ألف).
تبين هذه النتائج أن المستعمرات البشرية اللجنة التوجيهية المتولدة من خلايا البنكرياس وأعرب عن علامات بلوريبوتينسي في ظروف خالية من علبة التغذية بالورق. بلوريبوتينسي قيمت أيضا قبل التمايز الموجهة من اللجنة التوجيهية البشرية إلى الطبقات الجرثومية الثلاث: الأديم الظاهر و mesoderm والأنسجة. حقاً متباينة الحيوانات المستنسخة في غشاء الخلايا العصبية الإيجابية TUJ1 (الأديم الظاهر)، NKX2-5-إيجابية الضرب كارديوميوسيتيس (mesoderm) و SOX17 نقص المناعة اندوديرمال الخلايا (الشكل 3B).
بعد توصيف دقيق، تم اختيار الخطوط التوجيهية 3-قوية وخالية من تغذية الاستنساخ للجينوم تحرير الدراسات. دليلين مع بساي مواقع قطع في نهايات صممت لكل الجينات قطع قريبة من بعضها البعض (أي ن أقل من 100 ~ bp). ويبين الشكل 4التخطيطي للبروتوكول. هذه الاستراتيجية الحذف تستخدم للجينات المستهدفة يسمح لنا بسهولة حذف جزء من إكسون الأولى أو الثانية من الجينات. هذه الاستراتيجية كانت فعالة جداً ونحن يمكن أن عزل الحيوانات المستنسخة المحرر في كل محاولة. قد تم استنساخ هذه الأدلة إلى ناقل بساي هضمها و في المختبر نسخها كما هو موضح أعلاه. ونحن نوكليوفيكتيد أدلة (الكشف) والبروتين Cas9 كمجمعات رنب للتحرير السريع والفعال. ونحن أيضا فرز الخلايا كخلايا مفردة على ميفس كما استعادة الخلايا أعلى بالمقارنة مع فرز منفردة على لوحات المغلفة بغشاء الخلايا. الحمض النووي قد تم عزلة من جميع الحيوانات المستنسخة، والجزء المستهدف تم تضخيمه عن طريق PCR وحلها على محلل جزء على الشاشة للتغيرات في أحجام الأجزاء المستهدفة بالمقارنة مع عناصر التحكم. تمت مقارنة حجم الشظايا إلى سلم تشغيل مع العينات للكشف عن 'تحرير' استنساخ (أسفلالشكل 4، ). وهذا سهلة الفحص من الحيوانات المستنسخة كما أننا يمكن أن تذهب من خلال > استنساخ 90 في لوحة واحدة، والنتائج التي تم الحصول عليها بالدقة ± 3 بي بي. ثم كانت متسلسلة المستنسخين المحدد لتأكيد استنساخ البرية من نوع والمتحولة. وقد استنساخ Wildtype لا حذف أو إضافة قواعد حين استنساخ تحور أما بالإضافة أو الحذف في التسلسل مقارنة wildtype. المستنسخين لائحة الحذف أو الإضافة في تسلسل كانت متجهة pJET1.2 الموسعة والمستنسخة في تحديد استنساخ مونواليليك وبياليليك بتسلسل مستعمرات على الأقل 8-10 للاستنساخ. استنساخ مونواليليك قد أسس حذف أو إضافة في اليل واحد والآخر كان غير معدلة وعلى غرار اليل wildtype. وقد استنساخ بياليليك الحذف في كلا الآليلات. تقريبا تم فحص ثلاث مائة استنساخ جميع الجينات المستهدفة، التي حددت مونواليليك حوالي 9 حذف النسخ واستنساخ الحذف بياليليك 3 في كل حالة على حدة. هذا يقابل تقريبا إلى انخفاض 3-fold في التردد لجيل من الحيوانات المستنسخة بياليليك مقارنة باستنساخ مونواليليك. تعكس عدم التجانس داخل أمبليكونس الحذف إصلاح نج ناقصة وغير متسقة. وأخيراً أكد التعبير عن الجينات باستخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا المستهدفة وأداء RT-PCR.
رقم 1: إعادة برمجة الخلايا البشرية البنكرياس إلى خلايا خالية من تغذية pluripotent (اللجنة التوجيهية). يظهر البروتوكول (A) A التخطيطي للجيل من اللجنة التوجيهية من خلايا البنكرياس البشرية. خلايا البنكرياس نمت على لوحات المغلفة بالكولاجين وثم نقل إلى ميفس بعد توصيل مع ناقلات الأمراض البشرية سينداي الفيروس. ثم تنقل إلى غشاء هيسك المؤهلين المستعمرات برمجتها تماما وتتميز. (ب) Morphological التغييرات بعد توصيل الفيروسات سينداي. قبل توصيل، تظهر خلايا البنكرياس نموذجي يشبه شوكي مورفولوجيا (أعلى اليسار، يوم 0). تظهر المستعمرات الصغيرة، مشددة على MEFs يوم 12، تشبه مستعمرات الخلايا البشرية pluripotent. عادة المستعمرات اللجنة التوجيهية البشرية الكامل أعيدت برمجتها لها حدود واضحة جداً، ويمكن أن يتم انتقاؤها من قبل يوم 23-30. مستعمرة معزولة في يوم 23 يظهر في أسفل اليمين. تم القبض على جميع الصور في التكبير X 100 (10 X الهدف و 10 X العدسة). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: وصف للجنة التوجيهية البشرية. (A) A المرحلة النموذجية تباين الصورة من مستعمرة اللجنة التوجيهية بعد الانتقاء والثقافة في ظروف خالية من علبة التغذية بالورق (40 X 4 X الهدف و 10 X العدسة؛ واليسار) بعد إعادة برمجة فيروس سينداي لخلايا البنكرياس. الفوسفاتيز القلوية الملون مستعمرة اللجنة التوجيهية الأحمر على الحق. لتلطيخ الفوسفاتيز القلوية، المستعمرات اللجنة التوجيهية كانت ثابتة والملون الأحمر بعد إضافة الركازة الحل من الطقم. تم القبض على الصور في 40 س. (ب) إيمونوستاينينج لعلامات بلوريبوتينسي نانوج، و OCT3/4 في إيبسكس المستمدة من خلية البنكرياس خالية من التغذية البشرية. تم استخدام DAPI لوصمة عار نواة الأزرق كعنصر تحكم. وقد اتخذت جميع الصور في التكبير X 100. شريط المقياس = 100 ميكرومتر في جميع الصور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: توصيف بلوريبوتينسي والتمايز المحتمل للجنة التوجيهية- (أ) نظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل علامات السطح SSEA4، وهيئة تنظيم الاتصالات-1-60، وهيئة تنظيم الاتصالات-1-81 في إيبسكس خالية من علبة التغذية بالورق. الخلايا تنفصل إلى تعليق خلية مفردة والملون للسطح علامات سا-4 وهيئة تنظيم الاتصالات-1-60 وهيئة تنظيم الاتصالات-1-81. ذروة الأرجواني يحتوي على خلايا السلبية (التحكم بجسم) اللجنة التوجيهية واللجنة التوجيهية البنكرياس يمكن أن تكون visualised كذروة الخضراء. (ب) تصوير إيممونوفلوريسسينت الجينات مبرز الطبقة الجرثومية. التعبير عن علامات TUJ1 الأديم الظاهر (الأخضر)، ميسوديرم NKX2-5 (أحمر) والأنسجة SOX17 (أحمر) في الخلايا بعد التمايز الموجهة من اللجنة التوجيهية البنكرياس. المقابلة السيطرة النووية وصمة DAPI الأزرق. وقد اتخذت جميع الصور في التكبير X 100. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تخطيطية استراتيجية الحذف كريسبر/Cas9- كان زوج سجرنا واحد مصممة (ملحوظة الأحمر) مع بساي مواقع قطع في النهاية (كما هو موضح F و R) يفضل أن يكون استهداف إكسون الأولى، تعتيق، المستنسخة في بساي يهضم تعديل مكافحة ناقلات (pCR2.1، بساي موقع أبرز غراي)، متسلسلة وترجمتها في المختبر . ويبين تسلسل تحتها خط متجه الجزء حذف بعد الهضم بساي. تتم الإشارة إلى موقف فحص كبسولة تفجير باللون الأزرق. Cas9 ودليل الكشف تم نوكليوفيكتيد في اللجنة التوجيهية خالية من علبة التغذية بالورق كمجمع للحذف الجينوم. ثم وحيد الخلية فرز على لوحات MEF 96، حسنا، مثقف، نقلت للغشاء وتوسع وفرزهم حسب محلل بلغة كانت إيبسكس. لتشغيل العينات على المحلل، استخرجت السلطات الوطنية المعينة Cas9 الجينوم واستنساخ دليل ترانسفيكتيد على الغشاء وتمريرها من خلال مزيج هلام/صبغ في محلل لتحديد لاستنساخ 'تحرير' المحتملة (الوسط السفلي). يتم وضع علامة علامات سلم ذات الصلة، WT واستنساخ المحرر المحتملة. وأكد التعبير عن الجين استخراج الحمض النووي الريبي وتحليلها مع ف-PCR. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية إلى إيبسكس قدم دفعة كبيرة في ميادين البيولوجيا البحوث الأساسية والنمذجة المرض، وتطوير العقاقير والطب يشخص الطب التجديدي16. العديد من الأساليب الحالية والمستخدمة على نطاق واسع من جيل اللجنة التوجيهية البشرية تتطلب استخدام الفيروس مع مخاطر الاندماج في جينوم مضيف أو ناقلات ابيسومال مع انخفاض إعادة برمجة الكفاءة. نقدم هنا، طريقة فعالة لتوليد إيبسكس تغذية خالية من خلايا البنكرياس البشرية مع الفيروسات سينداي، الأمر الذي يؤدي إلى 'البصمة الحرة' وإعادة برمجة فعالة. إيبسكس البشرية الناتجة خالية من المتسلسلات الفيروسية، والحفاظ على بلوريبوتينسي، وتجنب استخدام عوامل خارجية غير معروف. جيل إيبسكس في ظروف خالية من التغذية قد انخفاض كفاءة إعادة برمجة، حتى نتمكن من إعادة برمجة خلايا البنكرياس الأساسية في تغذية الخلايا وثم نقل المستعمرات إلى غشاء خالية من علبة التغذية بالورق للتوسع، والثقافة وتوصيف. ويوفر الدمج بين هذه التقنيات مستقرة وموثوق بها وأكثر كفاءة اللجنة التوجيهية البرمجة.
ونحن أيضا إنشاء إيبسكس من البشرية الليفية والخلايا الأولية الأخرى مع هذا الأسلوب، مما يوحي بأن الفيروس سينداي يمكن استخدامها لإعادة برمجة مجموعة متنوعة واسعة من الخلايا. اعتبارات هامة: حاجة إلى كونفلوينسي الأمثل للخلايا الأولية لإعادة برمجتها ككثيرة جداً أو قليلة جداً من الخلايا آثار إعادة برمجة الكفاءة؛ ممر سابق من الخلايا الأولية عندما يتم تقسيم الخلايا لا تزال على النحو الأمثل؛ معايرة حذراً من الفيروسية متجهات أن النتائج في الحد الأدنى الخلية المبرمج وكفاءة عالية مما يؤدي إلى سهولة التقاط المستعمرات قوية؛ التحقق من الخسارة في سينداي ناقلات التعبير التحوير ببكر في الفقرات 10-15 لضمان إيبسكس 'البصمة الحرة'؛ وظروف معقمة صارمة للثقافة للجنة التوجيهية في الغشاء.
استخدمنا طريقة ملائمة وفعالة لتعديل الجينوم كريسبر لتحرير الجينوم اللجنة التوجيهية. هذا الأسلوب يجمع بين البروتين Cas9 وسجرنا، ومجمعات رنب على الاعتراف وتنشق في تسلسل الحمض النووي التكميلية. يمكن تكييفها بسهولة لاستهداف تسلسل الجينوم بمجرد تغيير الدليل bp 20 الجيش الملكي النيبالي. لدينا أسلوب يوفر بروتوكولا سهلة لكفاءة واستنساخه بتحرير إيبسكس البشرية كما كثيفة العمالة أكثر، من الصعب على ترانسدوسي، ومكلفة للحفاظ على من الخلايا الأخرى. نقوم بتصميم أدلة المتاخمة لها ولكن غير متداخلة اثنين على الأقل لكل الجينات المستهدفة حيث أنه يمكن استخدام مجموعة واحدة من فحص كبسولة تفجير لفحص المستنسخين المحرر. وبالإضافة إلى ذلك، ينشئ استخدام دليلين ~ 30-100 شركة بريتيش بتروليوم عن بعضها حذف كبيرة، التي يمكن تصور بسهولة أثناء الفحص الأولية ويضمن نضوب البروتين. يمكن اختبار هذه الأدلة في الخلايا HEK-293 في بادئ الأمر لتقدير الكفاءة قبل البدء التحليل في اللجنة التوجيهية. بالإضافة إلى ذلك، من المهم وضع بارامترات تعداء الروتينية من الكواشف إلى اللجنة التوجيهية. استخدام بلازميد بماكسجفب، كفاءات تعداء > 80% والكفاءة يستهدف تعطيل الجينات من 3-10% في إيبسكس وتتحقق بصورة روتينية. التسليم المباشر من مجمعات رنب Cas9 داخل الخلايا في لدينا بروتوكول يوفر العمل السريع ودوران سريع ويحافظ على معدلات عالية من تعديل المستهدفة. لدينا نهج توظف وحيد الخلية الفرز بعد نوكليوفيكشن من أدلة والبروتين Cas9، التغلب على عقبة كبيرة لاستهداف الجين في مختلطة السكان اللجنة التوجيهية وضمان كلوناليتي للخلايا. هذا النهج الشامل 'رواية' واضحة وسهلة لمتعدد، ويستغرق بضعة أسابيع فقط ولا يتطلب أي اختيار المضادات الحيوية. ونحن لم يلاحظ أي خسارة في الكفاءة بشكل تسلسلي إدخال الحذف قبل كريسبرس خط الخلية أو إيبسكس، على الرغم من أن تناذر تحليل الاحتياجات القيام بها في مثل هذه الحالات لضمان الاستقرار المجيني. يجب أيضا التحقق من النسخ للتعبير عن علامات بلوريبوتينسي. وعلى الرغم من عدم تركيز من هذا المنشور، هذا البروتوكول يمكن أن يختارهم للحث على التحوير الوراثي الدقيق بها بما في ذلك إصلاح القالب في كوكتيل17،تعداء18.
وأخيراً، استناداً إلى خبرتنا، اعتبارات هامة للجنة التوجيهية تحرير البروتوكول: التصميم العقلاني من أدلة لتقليل أو تجنب تماما قبالة الطفرات المستهدفة وبخاصة في منطقة "البذور" أو بالقرب من عزر بام يتم تعديلها؛ تحسين كفاءة نوكليوفيكتيون في إيبسكس لضمان تسليم رنبس؛ التحقق من جودة الأدلة المعدة؛ المعايرة الدليل وتركيزات البروتين Cas9 والتحقق من صحة فحوصات نشاطهم بالانقسام والبيوكيميائية في المختبر أو على النحو المبين في هذه المادة في سيلسوتش البشرية ك HEK الخلايا التي أسهل للثقافة وترانسفيكت؛ استخدم من أوائل إيبسكس المرور التي في مرحلة سجل النمو والوصول إلى كونفلوينسي ~ 50 ٪؛ المعالجة الدقيقة للخلايا مع المتوسطة لطيف التغييرات بعد فرز خلية واحدة فقط لضمان البقاء على قيد الحياة للخلايا.
ونحن نعتقد أن البروتوكول المبين أعلاه تحدد بالتفصيل الكافي سوف تزويد القراء بخارطة طريق لتوليد وتحرير اللجنة التوجيهية بطريقة استنساخه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
بريتيش تيليكوم أحد أعضاء المؤسسين لتجديد شركة العلوم البيولوجية
Acknowledgments
وأيده عمل في المختبر منح زمالات ما بعد الدكتوراه للدكتورة انجالي ناندال، ومنحة الاستكشافية من "صندوق أبحاث الخلايا الجذعية ميريلاند" إلى "بريتيش تيليكوم" (تيدكو).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sendai viral vectors - CytoTune-iPS 2.0 Kit | Invitrogen | A16517 | Thaw on ice; S No: 1 |
| Trypsin EDTA | Gibco Life Tech | 25300-054 | 0.05%, 100 ml; S No: 2 |
| Rock inhibitor (Y-27632) | Milipore | SCM075 | Use 10 μM; S No: 3 |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | S No: 4 |
| Serum replacement (KSR) | Gibco | 10828028 | S No: 5 |
| DMEM | Invitrogen | 11960069 | 1X; S No: 6 |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30071.03 | Aliquot; S No: 7 |
| L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid | Thermo Scientific | 35050061 | 1/100; S No: 8 |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | 1/100; S No: 9 |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 55 mM, 1/1,000; S No: 10 |
| Hausser Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | S No: 11 |
| 0.1% Gelatin Solution | STEMCELL Technologies | 7903 | Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12 |
| SSEA-4 antibody | Santacruz | sc-21704 | 1/100; S No: 13 |
| TRA-1-81 antibody | Cell Signaling | 4745S | 1/200; S No: 14 |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | sc-5279 | 1/1,000; S No: 15 |
| Collagen I, Rat Tail | Life Technologies | A10483-01 | Keep cold; S No: 16 |
| Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) | Invitrogen | A21202/A10042 | 1/2,000; S No: 17 |
| DPBS | Hyclone | SH30028LS | 1X; S No: 18 |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | S No: 20 |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | S No: 21 |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | S No: 22 |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | S No: 23 |
| Picking hood | NuAire | NU-301 | S No: 24 |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | S No: 25 |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 | S No: 26 |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | S No: 28 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | S No: 29 |
| Prigrow III medium | ABM | TM003 | S No: 31 |
| Countess™ Cell Counter | Invitrogen | C10227 | S No: 32 |
| Faxitron X-ray system | Faxitron | CellRad | S No: 33 |
| Accutase | Innovative cell Technologies | AT-104 | S No: 34 |
| Collagenase | Life Technologies | 17104019 | 1mg/ml stock; S No: 35 |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | S No: 36 |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37 |
| bFGF | R & D | 233-FB | Stock 10 ug/ml; S No: 38 |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | 4% stock in PBS; S No: 39 |
| TRA-1-60 | Santa Cruz | sc-21705 | 1/100; S No: 40 |
| NANOG | ReproCELL | RCAB0004P-F | 1/100; S No: 41 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | S No: 42 |
| Alkaline Phosphatase kit | Stemgent | 00-0055 | S No: 43 |
| Cas9 protein | PNA Bio | CP01-50 | Thaw and aliquot; S No: 44 |
| Goat or donkey serum | Sigma | D9663/G9023 | S No: 45 |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | S No: 46 |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | S No: 47 |
| Tris | Sigma | 9285-100ML | S No: 48 |
| NaCL | Sigma | S7653-250G | S No: 49 |
| EDTA | Sigma | BP2482-500 | S No: 50 |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202T | S No: 51 |
| Mega Shortscript T7 kit | Thermo Scientific | AM1354 | S No: 52 |
| Mega Clear kit | Thermo Scientific | AM1908 | S No: 53 |
| SMC4 | BD Biosciences | 354357 | S No: 54 |
| Fibronectin | STEMCELL Technologies | 7159 | S No: 55 |
| CloneJET cloning kit | Thermo Scientific | K1232 | S No: 56 |
| Fragment analyzerTM | Advanced Analytical | S No: 57 | |
| mTeSR1 medium kit | STEMCELL Technologies | 5850 | Warm to room temperature; S No: 58 |
| Freezing medium mFreSR™ | STEMCELL Technologies | 5855 | S No: 59 |
| Freezing medium CryoStor® | STEMCELL Technologies | 7930 | S No: 60 |
| MEFs | Globalstem | GSC-6301G | S No: 61 |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | S No: 62 |
| Human pancreatic cells | ABM | T0159 | S No: 63 |
| STEMdiff™ Neural Induction Medium | Stemcell Technologies | 5835 | S No: 64 |
| RPMI | Thermofisher | 11875-093 | S No: 65 |
| 2% B27-insulin | Thermofisher | A1895601 | S No: 66 |
| CHIR99021 | Stemcell Technologies | 72052 | S No: 67 |
| IWP4 | Stemcell Technologies | 72552 | S No: 68 |
| 2% B27 | Thermofisher | 17504044 | S No: 69 |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372019 | S No: 70 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8761-100ML | S No: 71 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | S No: 72 |
| BSA | Proliant | 68700 | S No: 73 |
| GDF8 | Pepro-Tech | 120-00 | S No: 74 |
| TUJ1 antibody | EMD Milipore | AB9354 | S No: 75 |
| NKX2-5 antibody | Santa Cruz | Sc-14033 | S No: 76 |
| SOX17 antibody | R & D systems | AF1924 | S No: 77 |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | P3566 | S No: 78 |
| Amaxa 4D-nucleofector™ | Lonza | AAF-1002 | S No: 79 |
| FACSAria II (cell sorter) | BD biosciences | SORP UV | S No: 80 |
References
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem cells. 27, 543-549 (2009).
- Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612 (2012).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).
- Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci. Rep. 4, 3594 (2014).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 169, 559 (2017).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168, 20-36 (2017).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).
- McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).
- Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. BioTechniques. 59, (2015).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. J Biotech. 241, 136-146 (2017).
