Denne protokollen beskriver i detalj generering av fotavtrykk-fri indusert pluripotent stamceller (iPSCs) fra menneskelig bukspyttkjertelen celler i arkmateren uten betingelser, etterfulgt av redigering med CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins og karakterisering av endret encellede kloner.
Embryonale og indusert pluripotent stamceller kan selv-fornye og skille ut flere celletyper i kroppen. Pluripotent cellene er dermed ettertraktet for forskning i regenerativ medisin og er nå i kliniske studier for øyesykdommer, diabetes, hjertesykdommer og andre sykdommer. Potensial til å skille ut spesialiserte celletyper kombinert med den siste utviklingen i genomet redigering teknologier inkludert CRISPR/Cas systemet har gitt av flere muligheter for skreddersøm genomet av iPSC for blandet kjøring inkludert sykdom modellering, genterapi, og biasing veier av differensiering, for å nevne noen. Blant de tilgjengelige redigering teknologiene, CRISPR/Cas9 fra Streptococcus pyogenes har dukket opp som et verktøy for valg for områdespesifikke redigering av eukaryote genomet. CRISPRs er lett tilgjengelig, billig og svært effektiv i ingeniørfag målrettet redigeringer. Systemet krever en Cas9 nuclease og en guide-sekvens (20-mer) gjelder for genomisk målet tilstøtende en 3-nukleotid “NGG” protospacer-tilstøtende-motiv (PAM) for målretting Cas9 til ønsket genomisk locus, sammen med en universell Cas9 binding tracer RNA ( “kalt sammen enkelt støttelinje RNA eller sgRNA). Her presenterer vi et trinnvist protokoll for effektiv generasjon av mater-uavhengig og fotavtrykk-fri iPSC og beskriver metoder for genomet redigering av iPSC bruker Cas9 ribonucleoprotein (RNP) komplekser. Genomet redigering protokollen er effektivt og kan være lett multiplekset av pre-complexing sgRNAs for flere mål med Cas9 protein og samtidig levere inn i cellene. Til slutt, beskriver vi en forenklet tilnærming for identifikasjon og karakterisering av iPSCs med ønskede endringer. Samlet forventes disponerte strategier å effektivisere generasjon og redigering av iPSC for mange programmer.
Omprogrammering av menneskelig somatiske celler pluripotent tilstanden av overuttrykte omprogrammering faktorer har revolusjonert stamcelleforskning programmer sykdom modellering og regenerativ medisin narkotika utvikling. Flere ikke-viral reprogramming metoder er tilgjengelige for levering av reprogramming faktorer og generere iPSCs, men prosessen er arbeidskraft intensiv og ikke veldig effektivt1. Metodene viral, er men effektiv, forbundet med virus integrering og tumorigenicity2,3,4. I dette manuskriptet rapporterer vi bruk av cytoplasmatiske Sendai virus for levere omprogrammering faktorer og etablere fotavtrykk-fri iPSC linjer som mangler integrering av en viral vektor sekvenser i deres genomer5. Sendai virus er en RNA-virus som er utvannet av cellen cytoplasma ~ 10 passeringer etter smitte og produserer omprogrammering faktorer i overflod, fører til rask og effektiv omprogrammering6,7. De etablerte iPSCs kan så lett bli overført til mater-fri medium for å unngå bruk av mus embryonale fibroblaster (MEFs) som mater celler8.
I publikasjonen, i tillegg til disposisjon Sendai viruset mediert reprogramming, beskriver vi også en forbedret protokoll for redigering iPSCs, som har potensial til å levere ubegrenset menneskelige celler med genetiske endringer for forskning. Vi har brukt CRISPR/Cas9-teknologi for ombygging av iPSCs, som nå brukes for en rekke applikasjoner inkludert knock-ins og fortrenging, store genomisk slettinger, gruppert biblioteket screening for gen funnet, genteknologi av mange modell organismer og gene terapi9,10,11. Denne teknikken innebærer dannelsen av komplekser av Streptococcus pyogenes-avledet Cas9 nuclease og 20-mer guide RNAs oppnå målet anerkjennelse via base-sammenkobling genomisk målet sekvens ved 3 nucleotide protospacer tilstøtende motiv (PAM) rekkefølge. Cas9 nuclease induserer en dobbel strandet pause ~ 3 nukleotider fra webområdet PAM, som er senere reparerte hovedsakelig av ikke-homologe enden med (NHEJ) veien fører til innsettinger eller slettinger i åpent lesing rammen, og dermed funksjonelle knockout gener12.
Våre forbedret protokollen inneholder detaljene for kultur av menneskelige bukspyttkjertelen celler, deres omprogrammering på mitotically inaktivert mus embryonale fibroblaster (MEFs) for å oppnå høyere effektivitet med reprogramming, etterfølgende tilpasning til mater-fri kultur på Matrigel, karakterisering av etablerte iPSCs, guidet CRISPR RNA design og forberedelse, leveres til iPSCs som RNP komplekser, enkeltcelle sortering for å generere klonal linjer med redigerte iPSCs, enkel screening og identifikasjon av redigeringer og karakterisering av enkelt celle kloner. Genomic slettinger genereres effektivt i denne studien av innføringen av Cas9 protein og to CRISPR sgRNA RNP komplekser å indusere dobbel strandet bryter (DSBs) og sletting av de mellomliggende segment. Denne metoden kapitaliserer på bruk av to guider for å generere slettinger i åpent lesing rammen, høy effektivitet av NHEJ fører til lavt antall kloner som måtte være preget og lett foreløpige screening av kloner av av automatiserte kapillær geleelektroforese enhet, fragment analyzer. Disse effektiv genomet redigering metoder for å generere modeller for menneskelig stilk cellen-basert sykdom vil snart bli en standard og rutine tilnærming i noen stamcelleforskningen laboratorium. Endelig presis genomet redigering gjør det mulig å gå utover stamcelleforskningen sykdom modellering og potensielt kunne hjelpe katalysere cellen-basert behandling.
Omprogrammering av menneskelig somatiske celler til iPSCs har gitt en viktig vitamininnsprøytning til grunnleggende biologi forskning, personlig medisin, sykdom modellering, narkotika utvikling og regenerativ medisin16. Mange nåværende og brukte metoder for menneskelig iPSC generasjon krever bruk av virus med risikoen for integrering i vert genomet eller episomal vektorer med lav omprogrammering effektivitet. Her presenterer vi en effektiv metode for å generere mater-gratis iPSCs fra menneskel…
The authors have nothing to disclose.
Arbeid i laboratoriet ble støttet av postdoktorstipend tilskudd til Dr. Anjali Nandal og utforskende grant fra Maryland Stem Cell Research Fund til BT (TEDCO).
Sendai viral vectors – CytoTune-iPS 2.0 Kit | Invitrogen | A16517 | Thaw on ice; S No: 1 |
Trypsin EDTA | Gibco Life Tech | 25300-054 | 0.05%, 100 ml; S No: 2 |
Rock inhibitor (Y-27632) | Milipore | SCM075 | Use 10 μM; S No: 3 |
DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | S No: 4 |
Serum replacement (KSR) | Gibco | 10828028 | S No: 5 |
DMEM | Invitrogen | 11960069 | 1X; S No: 6 |
Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30071.03 | Aliquot; S No: 7 |
L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid | Thermo Scientific | 35050061 | 1/100; S No: 8 |
Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | 1/100; S No: 9 |
2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 55 mM, 1/1,000; S No: 10 |
Hausser Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | S No: 11 |
0.1% Gelatin Solution | STEMCELL Technologies | 7903 | Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12 |
SSEA-4 antibody | Santacruz | sc-21704 | 1/100; S No: 13 |
TRA-1-81 antibody | Cell Signaling | 4745S | 1/200; S No: 14 |
OCT4 antibody | Santa Cruz | sc-5279 | 1/1,000; S No: 15 |
Collagen I, Rat Tail | Life Technologies | A10483-01 | Keep cold; S No: 16 |
Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) | Invitrogen | A21202/A10042 | 1/2,000; S No: 17 |
DPBS | Hyclone | SH30028LS | 1X; S No: 18 |
100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | S No: 20 |
96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | S No: 21 |
6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | S No: 22 |
Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | S No: 23 |
Picking hood | NuAire | NU-301 | S No: 24 |
15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | S No: 25 |
50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 | S No: 26 |
Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | S No: 28 |
β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | S No: 29 |
Prigrow III medium | ABM | TM003 | S No: 31 |
Countess™ Cell Counter | Invitrogen | C10227 | S No: 32 |
Faxitron X-ray system | Faxitron | CellRad | S No: 33 |
Accutase | Innovative cell Technologies | AT-104 | S No: 34 |
Collagenase | Life Technologies | 17104019 | 1mg/ml stock; S No: 35 |
Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | S No: 36 |
hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37 |
bFGF | R & D | 233-FB | Stock 10 ug/ml; S No: 38 |
Paraformaldehyde | EMS | 15710 | 4% stock in PBS; S No: 39 |
TRA-1-60 | Santa Cruz | sc-21705 | 1/100; S No: 40 |
NANOG | ReproCELL | RCAB0004P-F | 1/100; S No: 41 |
Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | S No: 42 |
Alkaline Phosphatase kit | Stemgent | 00-0055 | S No: 43 |
Cas9 protein | PNA Bio | CP01-50 | Thaw and aliquot; S No: 44 |
Goat or donkey serum | Sigma | D9663/G9023 | S No: 45 |
Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | S No: 46 |
DAPI | Thermo Scientific | D1306 | S No: 47 |
Tris | Sigma | 9285-100ML | S No: 48 |
NaCL | Sigma | S7653-250G | S No: 49 |
EDTA | Sigma | BP2482-500 | S No: 50 |
T4 DNA ligase | NEB | M0202T | S No: 51 |
Mega Shortscript T7 kit | Thermo Scientific | AM1354 | S No: 52 |
Mega Clear kit | Thermo Scientific | AM1908 | S No: 53 |
SMC4 | BD Biosciences | 354357 | S No: 54 |
Fibronectin | STEMCELL Technologies | 7159 | S No: 55 |
CloneJET cloning kit | Thermo Scientific | K1232 | S No: 56 |
Fragment analyzerTM | Advanced Analytical | S No: 57 | |
mTeSR1 medium kit | STEMCELL Technologies | 5850 | Warm to room temperature; S No: 58 |
Freezing medium mFreSR™ | STEMCELL Technologies | 5855 | S No: 59 |
Freezing medium CryoStor® | STEMCELL Technologies | 7930 | S No: 60 |
MEFs | Globalstem | GSC-6301G | S No: 61 |
L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | S No: 62 |
Human pancreatic cells | ABM | T0159 | S No: 63 |
STEMdiff™ Neural Induction Medium | Stemcell Technologies | 5835 | S No: 64 |
RPMI | Thermofisher | 11875-093 | S No: 65 |
2% B27-insulin | Thermofisher | A1895601 | S No: 66 |
CHIR99021 | Stemcell Technologies | 72052 | S No: 67 |
IWP4 | Stemcell Technologies | 72552 | S No: 68 |
2% B27 | Thermofisher | 17504044 | S No: 69 |
MCDB 131 | Life Technologies | 10372019 | S No: 70 |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8761-100ML | S No: 71 |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | S No: 72 |
BSA | Proliant | 68700 | S No: 73 |
GDF8 | Pepro-Tech | 120-00 | S No: 74 |
TUJ1 antibody | EMD Milipore | AB9354 | S No: 75 |
NKX2-5 antibody | Santa Cruz | Sc-14033 | S No: 76 |
SOX17 antibody | R & D systems | AF1924 | S No: 77 |
Propidium iodide | Thermo Scientific | P3566 | S No: 78 |
Amaxa 4D-nucleofector™ | Lonza | AAF-1002 | S No: 79 |
FACSAria II (cell sorter) | BD biosciences | SORP UV | S No: 80 |