Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Microinjection CRISPR/Cas9 protein i kanalen Gråsteinbit, Ictalurus punctatus, embryo for Gene Editing

Published: January 20, 2018 doi: 10.3791/56275
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 4, 4, 5, 5, 1
1School of Fisheries, Aquaculture and Aquatic Sciences, Auburn University, 2Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine, Suez Canal University, 3Anatomy and Embryology Department, Faculty of Veterinary Medicine, Cairo University, 4Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 5Life Science Institute, University of Michigan
* These authors contributed equally

Summary

En enkel og effektiv microinjection protokoll for genet redigering i kanalen Gråsteinbit embryoer bruker CRISPR/Cas9 systemet er presentert. I denne protokollen, guide RNAs og Cas9 protein var microinjected i eggeplomme av en celle embryo. Denne protokollen er validert av banke ut to kanalen Gråsteinbit immun-relaterte gener.

Abstract

Komplett genomet av kanalen steinbit, Ictalurus punctatus, har blitt sekvensert, fører til større muligheter for å studere kanalen Gråsteinbit gen funksjon. Gene knockout har blitt brukt til å studere disse genet funksjoner i vivo. De klynget regelmessig interspaced kort palindromic gjentar/CRISPR tilknyttet protein 9 (CRISPR/Cas9) er et kraftig verktøy som brukes til å redigere genomisk DNA-sekvenser for å endre gen funksjon. Mens den tradisjonelle tilnærmingen har vært å innføre CRISPR/Cas9 mRNA i én celle embryo gjennom microinjection, kan dette være en langsom og ineffektiv prosess i steinbit. Her er en detaljert protokoll for microinjection av kanalen Gråsteinbit embryo med CRISPR/Cas9 protein beskrevet. Kort, egg og sperm var samlet og deretter kunstig befruktning utført. Befruktede egg ble overført til en Petriskål inneholder Holtfreters løsning. Injeksjon ble kalibrert og deretter lede RNAs/Cas9 rettet mot toll/interleukin 1 reseptor domenet inneholder kort molekyl (TICAM 1) gene og rhamnose bindende Lektiner (RBL) genet ble microinjected i eggeplomme av en celle embryo. Den gene knockout var vellykket indeler ble bekreftet av DNA sekvensering. Anslåtte protein sekvens endringer på grunn av disse mutasjonene inkludert frameshift og avkortet protein på grunn av tidlig stopp kodon.

Introduction

Microinjection er en vanlig laboratoriet teknikken brukes til å levere en liten mengde av et stoff som DNA, RNA, protein og andre makromolekyler i celler eller embryo gjennom glass kapillær1. Microinjection utføres med spesialutstyr installasjonen inkludert en microinjector, micromanipulator og et mikroskop2. Teknikken har blitt brukt av forskere genetisk endre mange organismer gjennom generasjon transgenics, gene fortrenging og genterapi, med sikte på å forstå dynamikken i intracellular komponentene3,4 , 5.

Kanalen Gråsteinbit (Ictalurus punctatus) er den mest populære steinbit arten innen akvakultur og fritidsfiske aktiviteter i USA. Det er et økende behov for å studere funksjonell genomforskning i kanalen Gråsteinbit sekvensering av komplett genomet av kanalen Gråsteinbit forbedrer nytten av nylige fremskritt i genomet redigering verktøy6,7. Forstå gen funksjon ville ikke bare berike forskningen som blir gjennomført steinbit, men kan også føre til mer effektiv genetisk forbedring programmer å forbedre steinbit industrien. Når kritiske gener for en gitt egenskap av interesse er identifisert, kan de brukes til å forbedre genetisk steinbit produksjon gjennom genomet redigering for å generere gunstig alleler, valg for disse alleler, undertrykke de ødeleggende alleler, overføre de gunstige alleler gjennom transgenesis, eller en kombinasjon av disse alternativene. Kombinere beste genene for ulike kommersielt nyttige egenskaper fra ulike arter i en fisk ville forbedre produktiviteten og lønnsomheten av fisk produksjon operasjoner8.

Gene knockout er en direkte metode å studere genet funksjoner i vivo. Mutasjoner på DNA nivå vil bli arvet av fremtidige generasjoner som vil lette studiet av deres effekter i ulike generasjoner. Forskjellige genomet redigeringsverktøy er utviklet inkludert sink finger nucleases (ZFNs), transkripsjon aktivator som effektor nucleases (TALENs), og gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar/CRISPR-assosiert protein 9 (CRISPR/Cas9 ) systemet9,10,11,12.

CRISPR/Cas9 systemet er et kraftig, effektive verktøy som er brukt til å redigere genomisk DNA-sekvenser inkludert gene knockout i fisk til RNA-guidede områdespesifikke DNA cleavage5,13. Systemet består av en guide (gRNA), som bestemmer målrettet rekkefølgen genomet og en DNA endonuclease enzym, Cas9. CRISPR/Cas9 systemet kan utformes til å målrette en sekvens i genomet med flere fordeler sammenlignet med ZFNs og TALENs: (1) lavere pris (2) lettere engineering (3) mer spesifikke binding av guide RNA til målet sekvensen, og reduserte off-målet mutasjoner (4) flere sekvenser kan være målrettet med forskjellige gRNA på samme tid (5) høyt mutagenese satsen i gener som ikke kunne være mutert ved TALENs, og (6) forbedret germline overføringshastigheten av mutasjoner for opptil 6-fold sammenlignet med ZFNs og TALENs14, 15,16,17,18.

Den viktigste alternative metoden for microinjection er electroporation, der elektriske impulser brukes embryoer eller celler å øke membran permeabilitet og opptaket av biologiske molekyler19,20. Flere transgene fisk ble generert ved hjelp av electroporation som medaka (Oryzias latipes), sebrafisk (Danio rerio), chinook laks (Oncorhynchus tshawytscha), kanalen Gråsteinbit, Brie (Sparus sarba), og felles karpe (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.

Electroporation har blitt brukt til å levere plasmider DNA, RNA og Cas9 protein for genet knockout. I pattedyrceller, Cas9/gRNA plasmider DNA, Cas9 mRNA/gRNA og Cas9 protein/gRNA komplekser ble levert med electroporation og de mutagenese prisene var høyest med Cas9 protein/gRNA komplekser for de fleste electroporation forhold testet27. I ascidian Ryggstrengdyr (Ciona intestinalis) var TALENs uttrykke konstruksjoner electroporated i befruktede egg å indusere knockout flere gener28. ZFNs uttrykke plasmider konstruksjoner var electroporated å slå ut luteiniserende hormon i kanalen Gråsteinbit29. Men når introdusert i cellen, plasmider konstruksjoner må transkribert til RNA og oversatt til funksjonelle proteiner før de kan målrette ønsket DNA sekvensen, som trolig forsinke tiden av mutagenese sammenlignet med microinjection av / protein. Som en fosteret utvikler, øker forsinket mutagenese mosaicism av injisert grunnleggere. I tillegg er transgene uttrykk usannsynlig å oppnå det uttrykket mulig med microinjection, senke mutagenese effektivitet.

Som et middel for å innføre genomet redigeringsverktøyene i celler, har microinjection flere fordeler fremfor electroporation. Genomet redigering molekyler kan bli pålitelig introdusert i celler eller embryo gjennom microinjection30. Mindre injeksjon materiale er nødvendig. Det er lett å bestemme beløpene materiale injisert. Høyere mutasjon priser med lav mosaicism i grunnlegger fisken kan være oppnådd som ville forbedre germline overføring av mutasjoner F1. Færre grunnlegger fisk må analyseres for å produsere første generasjon, på grunn av høyere Mutasjonshastigheten. I electroporation må mer grunnlegger fisk analyseres som øker kostnadene. Overlevelsen av kanalen Gråsteinbit microinjected embryoer er imidlertid lavere enn electroporated seg, selv om dette kan overvinnes ved å injisere mer embryo31,32. I kanalen Gråsteinbit, overlevelse av eggeplomme-microinjected embryo varierte fra 16 til 55%, avhengig av gener målrettet og dosering av gRNA/Cas9 protein32.

Vanlige microinjection av steinbit embryo er teknisk krevende og tidkrevende, men en rask og effektiv CRISPR/Cas9 protein microinjection protokoll presenteres for kanalen Gråsteinbit embryoer. Denne protokollen krever mindre tid og ekspertise siden CRISPR/Cas9 protein løsningen injiseres i eggeplomme av én celle embryo. Hundrevis av befruktet egg kan injiseres i 1 h (ca tiden nødvendig for første celledeling oppstår). For å validere protokollen, slått to sykdom mottakelighet-relaterte gener ut i kanalen Gråsteinbit, toll/interleukin 1 reseptor domenet inneholder kort molekyl (TICAM1) genet og rhamnose bindende Lektiner (RBL) genet. TICAM 1 er involvert i signalveien initiert av toll-like reseptor (TLR) 3. I kanalen Gråsteinbit var TICAM 1 dramatisk upregulated etter bakteriell utfordring med Edwardsiella ictaluri, mens det var downregulated i blå steinbit, en art motstandsdyktig til E. ictaluri33. RBL spiller en viktig rolle i tidlig infeksjon med Flavobacterium columnare, den utløsende agenten for columnaris sykdom, der akutt og solid upregulation ble spilt inn i en columnaris-følsomme kanalen Gråsteinbit belastning sammenlignet med en columnaris-resistent stamme34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dette eksperimentet ble gjennomført på fisk genetikk Research Unit, E. W. Shell Fisheries Research Center, Auburn University, AL. Alle eksperimentelle protokollene som brukes i dette eksperimentet ble godkjent av Auburn University institusjonelle Animal Care og bruk Committee (AU-IACUC) før forsøket ble startet. En liste av utstyr og forsyninger i dette eksperimentet kan finnes i tabellen materialer. Følgende er fremgangsmåten og prosedyrer for utarbeidelse og microinjection av kanalen Gråsteinbit en celle embryo som vist i figur 1.

1. gruble Stock utvalg og rogn

  1. Velg sunn kanalen Gråsteinbit stamfisken belastning eller genetisk linje av interesse. Kanalen Gråsteinbit menn og kvinner bør utvise god sekundære kjønnskarakteristika.
  2. Velg menn som har en bred muskel leder som er bredere enn resten av kroppen med velutviklet genital papilla. Mørk farge, scarring og sår fra territorielle kampene er likeledes underskriver av seksuell beredskap. Velg kvinner som har hoder som er smalere enn resten av kroppen, og har myke, håndgripelig, godt avrundet magen. For nøyaktigheten og unngå understreker fisken under første håndtering, stoppe fôring kvinner 2-3 dager før deres beredskap for å gyte.
  3. Utføre fisk håndtering raskt, men nøye. For å redusere håndtering stress, Utfør alle prosedyrer som krever håndtering kvinner mens du holder fisk i gyting poser (32 mm størrelse mesh).
  4. Like før hormon injeksjon å indusere ovulation, måle kroppsvekten av kvinner.
  5. Henge gyting poser med kvinner inne i en flyt gjennom tanken med kontinuerlig vannføring og tilstrekkelig utlufting.
  6. Tas aseptisk, laste implantar som har en 14 G nål med 85 µg/kg luteiniserende hormon slippe hormon analog (LHRHa) implantatet. Skyll injeksjonsstedet (rygg muskulatur) med 0,9% sterilt saltvann før injeksjon. Sett inn implantar i 45° vinkel og slipp implantatet. Trekke nål og hugge injeksjonsstedet med en bomullsdott gjennomvåt i 70% etanol.
  7. Legg gyting vesken holder tanken slik at fisken er helt neddykket i vann 15-20 cm under vannflaten. Tilstrekkelig utlufting (over 5 ppm oppløst oksygen) og god vannkvalitet er viktig for eggløsning høykvalitets egg.
  8. Forutsi ovulation tiden basert på temperaturen bruker grad timer (h) forholdet35. Grad-h responstid = hormon injeksjon og eggløsning (h) * vanntemperatur (° C). For eksempel for en grad-h responstid på 900-1000, er en kvinne ventet å gyte på 36-40 h fra hormon injeksjon tid på 25 ° C. Den første sjekken for egg er vanligvis gjort på ca 36 h etter hormon injeksjon og deretter på 4 h intervall.
  9. For å sjekk for eggløsning, løft gyting posen over vannflaten mens du er på utkikk etter eggene som er tilknyttet inni gyting posen. Se minst 10 egg angir denne kvinne er eggløsning og klar for hånd stripping.

2. sperm forberedelse

Merk: Sædceller kan tilberedes noen h før forventet eggløsning.

  1. Euthanize menn av en perkussive slag mot hodet uten bedøvelse, siden anestesi kan ha en negativ effekt på Spermiemotilitet.
  2. Samle prøvene i en liten veiing panne, fjerne alle vev og vaske dem med 50-mL 0,9% saltløsning å fjerne blod, om nødvendig. Godt utviklet testiklene er hvite med mange villiform anslag ( figur 2).
  3. Fastslå vekten av testiklene.
  4. For å forberede sperm løsningen egg befruktning, overføre testiklene til midten av en 100 cm2 100 µm mesh ved hjelp av pinsett. Brett i mesh med testiklene inne, knuse testiklene og filtrere sæd inn i et 50 mL samling rør. Dette kan gjøres ved å bruke press testiklene i mesh mot kanten av samlingen røret via tommelen. Bruk 0,9% saltvann vask sperm fra mesh inn i samling røret. Saltvann kan legge opptil 10 mL/g av testiklene.
  5. Bestemme konsentrasjonen av sæd, sjekk motilitet og levedyktighet.
    Merk: Konsentrasjon kan bestemmes ved å telle sædceller i et kjent utvannet volum av melke ved hjelp av en hemocytometer. Sperm tetthet kan også estimeres ved å evaluere den optiske densitet for melke bruker et spektrofotometer. I denne metoden er opptaket på 505 nm wavelength sammenlignet en kontroll diagrammet som tidligere er utarbeidet for absorpsjon av ulike konsentrasjoner av sæd36. Spermiemotilitet kan kontrolleres under mikroskop som tiden fra aktivering av sæd til opphør av sædceller bevegelse (kalt motilitet varighet)37. Levedyktigheten til sædceller kan bestemmes av flekker sperm med selektiv fargestoffer som trypan blå, som vil flekker bare ikke-levedyktige sperm celler, mens levedyktig sperm vil være unstained kvinne. Men for disse microinjection prosedyrer er dette ikke nødvendig hvis testiklene er godt utviklet.
  6. Lagre sædceller i 0,9% saltvann fra skritt 2.5 på 4 ° C og bruk innen 24 timer etter forberedelse.

3. egg innsamling og gjødsling

  1. Bruke et meget tynt lag av vegetabilske forkorte til 20 cm diameter ren tørr gyting pan.
  2. Plasser kvinnelige i bedøvende løsningen inneholder 100 ppm bufret tricaine metan sulfonate med natriumbikarbonat (pH i endelige løsning bør være 7.0) til fisken er helt bedøvet38.
    Advarsel: Tricaine metan sulfonate kan være irriterende Hvis innåndet, inntatt eller absorberes gjennom huden.
  3. Nøye, Fjern fisken fra gyting posen og dyppe den i 0,9% saltløsning vaske av bedøvende løsningen. Tørk fisken fullstendig ved hjelp av et rent håndkle, unngå fjerning av Slim laget på fisk kroppen overflaten.
  4. Bruk vegetabilsk fett på området rundt åpningen, inkludert bekken finnene, for å hindre vedlegg av egg under hånden stripping.
  5. Hånd stripe eggene i smurt gyting pannen ved å bruke lett trykk eggstokkene. God egg bør flyte fritt, være gyllengul farge og har minimal eller ingen klumper eller blodpropp (figur 2). Unngå kontakt mellom egg og vann før befruktning, som vann kan stimulere micropyle nedleggelse.
  6. Overføre 200-300 egg for å befrukte egg for microinjection, til en gyting smurt. Smurt plast anlegget etiketter kan brukes som en skje til å overføre egg til gyting smurt. Legg 1-2 mL av sæd løsningen (fra trinn 2.5) egg og bland forsiktig. Forholdet mellom sædcellene å egg bør være ca 11000 sperm/egg.
  7. Sammenlegge freshwater til eggene å aktivere sæd og egg. Legg nok vann til å dekke noe egg. Forsiktig swirl eggene for 30 s. befruktning skulle skje i 1-2 min. Det er viktig å befrukte egg som er ordnet i et enkelt lag. Steinbit egg følge hverandre gjør det vanskelig å microinject flere lag av embryo.
  8. Legg mer ferskvann til befruktede eggene og tillate egg å stivne i 10-15 min.
  9. Dekk gyting kokekaret inneholder de resterende 5mas eggene av et vått håndkle å hindre tørking og gjødsle over et par timer. Befruktning kan gjøres på en forskjøvet måte, for eksempel, en batch 200-300 egg kan være befruktet hvert 30-60 min for å sikre en kontinuerlig tilførsel av embryo på én celle scenen for microinjection og kontroll ikke-injisert embryoer. Unngå kontakt mellom det våt håndkleet og egg egg kan overholde det våt håndkleet gjør det vanskelig å fjerne. I denne protokollen, egg befruktet innen 2-3 timer etter stripping var effektivt microinjected og hadde lignende suksess som egg befruktet umiddelbart etter stripping.

4. pinne trekke og lasting

  1. Dra en 1.0 mm OD Borosilikatglass kapillær inn 2 pinner (Figur 3). Lagre nålene i en papir med en svamp der flere snitt er gjort. For å unngå å bryte nålen, bør diameteren på svampen være mindre enn lengden på nål stammen.
  2. Åpne pinne-spissen ved å bryte et lite stykke nålens thinnest regionen med en skarp gjenstand. Også åpne nålen av klemming av regionen tynneste tips med tang under mikroskopet.
  3. Forberede injeksjon løsningen ved å blande gRNA(s) med Cas9 protein. Andre typer RNA eller protein kan også være injisert med samme fremgangsmåte. I denne protokollen, gRNAs for målet to kanalen Gråsteinbit immun beslektede gener, toll/interleukin 1 reseptor domenet inneholder kort molekyl (TICAM1) gene og rhamnose bindende Lektiner (RBL) genet og utarbeidet etter Shah et al. med bruk av et Hi-Fi Taq polymerase32,39. Genomic målene for gRNAs var 5' GGA GGT GAA GCA CGT CGA GGA 3' for TICAM 1 genet (Figur 4) og 5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3 for ekson 1 av RBL genet med protospacer tilstøtende motiv (PAM) sekvens understreket (figur 6).
    1. BLAST guide RNA mål mot kanalen Gråsteinbit genomet sekvens, og velge de med ingen potensielle off-målet områder.
    2. Legge til fenol rød farge gRNA/Cas9 protein blande opp til en tredjedel av det totale volumet.
    3. Justere siste konsentrasjonen av gRNA/Cas9 proteinet blanding med nuclease kostnadsfritt vann slik at hver embryoet injiseres med 50 nL som inneholder ca 2,5 ng gRNA og 7,5 ng Cas9 protein. Inkuber blandingen for 10 min på is før bruk.
  4. Med en microloader, åpne 5-10 µL av gRNA/Cas9 blandingen i injeksjon nålen ved å sette microloader inn nålen stammen og utviste blandingen langsomt mens trekke microloader spissen (Figur 3). Unngå overlapping luftbobler i.
  5. Knytte nålen til innehaveren av brønnene og sikre en fast tilkobling, og deretter feste holderen til micromanipulator. Sikre stabil frie. Bruk Trykk for microinjection ved å åpne nitrogen sylinder og justere trykkregulatoren.
    Merk: Volumet av injeksjon kan påvirkes av press, diameteren på nålen blenderåpning og varighet av injeksjon. Å avgjøre volumet å injisere, injisere i en dråpe mineralolje plassert på en hemocytometer. Hvis nødvendig, kan trykk, injeksjon, og nålen diameter justeres for å øke eller redusere volumet av injeksjon. Sette inn flere ganger i mineralolje å sikre konsistent volum.

5. microinjection av steinbit embryo

  1. Bruke et meget tynt lag av vegetabilske forkorte til et 100 mm ren bensin fat.
  2. Bruke en smurt plast anlegget etikett, overføre 50-100 egg fra befruktning pannen til Petriskål og dekke dem med Holtfreters løsning (materialer tabell). Juster egg mot hverandre i et lag. Denne justeringen skal holde egg på plass under microinjection prosessen.
  3. Plasser Petriskål med egg på scenen av mikroskopet og holder det med én hånd. Senk nålen med den andre hånden (Figur 3) til skjærer plasmocitara og eggeplomme i en enkelt jevn bevegelse. Spissen av nålen skal være så nær som mulig til blastodisc før du leverer injeksjon materialet.
    1. Trykk ned pedalen for å levere injeksjon materialet i eggeplomme. Hvis blastodisc ikke er synlig, kan injeksjon materialet spres til forskjellige steder i eggeplomme. For å gjøre det, nålen settes til enden av eggeplomme, så deprimerende pedalen og uttak nålen utføres samtidig for å spre injeksjon materialet gjennom forskjellige områder av eggeplomme. Opptil 50 nanoliters kan injiseres i eggeplomme av kanalen Gråsteinbit embryoer, men mengden av gRNA/Cas9 protein må optimaliseres for hver genet å oppnå de beste resultatene for mutasjon rate og embryo overlevelse32.
  4. Trekke nålen glatt for ikke å skade egg. Flytte Petriskål å injisere et annet egg med samme fremgangsmåte. Unngå bevegelse av Petriskål under injeksjon prosessen som dette kan skade egg eller bryte nålen. Fjerne egg som er sprukket eller ødelagt på grunn av microinjection. Injeksjon kan startes i 15-20 min etter befruktning og fortsette så lenge embryoene er fortsatt i én celle scenen (til ca 60-90 min etter befruktning).
  5. Plass injisert embryo tilbake i Holtfreters løsning med 10 ppm doxycycline og kontinuerlig mild lufting for 6-7 dager før klekking40. Endre løsningen daglig og fjerne døde embryoer.

6. mutasjon gjenkjenning

  1. Tilfeldig, samle flere injisert embryoer på 72 h innlegget befruktning, fjerne eggeplomme og ekstra genomisk DNA. Inkluder 3-5 non-injisert embryo som en kontroll.
    Merk: Genomic DNA kan hentes fra embryo etter fjerning av egg skall og eggeplomme materiale ved hjelp av proteinasen K fordøyelsen og etanol nedbør32.
  2. Forsterke et DNA segment flankert genomisk målene for gRNA av hver genet, der mutasjoner forventes å inntreffe, bruker en Hi-Fi Taq polymerase32. For TICAM 1, primerne 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG 3' (fremover) og 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (bakover) ble brukt til å forsterke en 750 bp mens for RBL, primerne 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3' (fremover) og 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (bakover) som ble brukt til forsterke et 375 bp segment fra RBL genet.
    1. Bruk følgende PCR reaksjon: opptil 20 µL PCR klasse vann; 1 x Hi-Fi Taq enzym reaksjon buffer med MgCl20.2 mM dNTP blande, 0.4 µM for hver av de forover og bakover grunning av samme, 100-300 ng genomisk DNA og 1,25 enheter av Hi-Fi Taq enzym blanding. Utføre PCR sykling forhold: første rødsprit ved 94 ° C i 3 min; 35 sykluser av rødsprit 94 ° c for 30 s, annealing ved 60 ° C i 55 s for TICAM, og 40 s RBL, utvidelse ved 72 ° C i 1 min/kb; og endelig utvidelse ved 72 ° C i 10 min.
  3. Oppdage de muterte embryoene bruker en mutasjon gjenkjennings-metoden som sekvensering av renset PCR produkter, landmåler mutasjon oppdagelsen analysen, heteroduplex mobilitet analysen, tap av begrensning enzym anerkjennelse webområdet eller andre mutasjon oppdagelsen metoden som er passende for målet. Denne protokollen, oppdage mutant embryo bruker landmåler mutasjon oppdagelsen analysen for TICAM 1 og tap av begrensning enzym SapI kuttet nettstedet samt sekvensering av renset PCR produkter for RBL genet.
  4. For å identifisere mutant alleler, klone PCR produkter og sekvens vektorer fra enkelte koloniene. De muterte alleler presentert i Figur 4 og figur 6 kom fra injisert embryoer. PCR produkter fra seks microinjected og 3 kontroll embryo for hver genet ble samlet i to separate rør, for microinjected embryoer og den andre for kontroll embryoer, raskt klonet og 86 vektorer for TICAM 1 og 48 vektorer for RBL genet sekvensert, inkludert 8 sekvensering reaksjoner fra 3 kontroll ikke-injisert embryo for hver genet.
  5. For å identifisere forskjellige mutant alleler, kan du sammenligne sekvenser fra mutant embryo vill type sekvensen alle DNA sekvens justering verktøy som BLAST eller T-kaffe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å demonstrere effektiviteten av microinjection-protokollen, var gRNAs ment til kanalen Gråsteinbit toll/interleukin 1 reseptor domenet inneholder kort molekyl (TICAM1) gene og rhamnose bindende Lektiner (RBL) gen microinjected.

TICAM 1
DNA sekvensering av vektorer fra enkelte koloniene fra gruppert, klonet PCR produkter avslørte den indel mutasjoner indusert i TICAM 1 gen. Mutasjonshastigheten var 79% i 24 personer analysert. Eksempler på mutasjoner er illustrert i Figur 4 og figur 5. Effekter av indel mutasjoner i genet TICAM1 koding sekvens av kanalen Gråsteinbit på anslått protein lengde og rekkefølgen sammenlignet med vill type sekvensen er illustrert i tabell 1. Sletting mutasjoner resulterte i fjerning av noen få til flere aminosyrer fra spådd protein, fører til endre nedstrøms lesing rammen og tidlig avslutning oversettelse (tabell 1).

I de fleste tilfeller, ble mer enn 80% av spådd protein sekvensen avkortet på grunn av en tidlig stopp codon. I disse tilfellene hvor spådd polypeptid varierte fra 91 til 106 aminosyre rester (wild type TICAM 1 har 520 aminosyre rester). Mutasjoner med ekstremt avkortet protein er ventet å produsere en ikke-fungerende protein. I 87 bp sletting mutasjon (tabell 2, Figur 4), ble 29 aminosyrer fjernet fra protein uten å endre lese rammen. Funksjonell konsekvensene av slike mutasjoner må evalueres eksperimentelt.

RBL
DNA sekvensering av vektorer fra enkelte koloniene fra gruppert, klonet PCR produkter bekreftet tilstedeværelse av indel mutasjoner (figur 6). Mutasjonshastigheten var 88% i 40 personer analysert. Slettinger varierte fra 5 bp til 183 bp, mens opptil 20 bp ble satt inn. Interessant, fjernet 183 bp slettingene helt intron 1, ekson 2 og 19 bp fra intron 2. Teoretisk sett bør dette påvirke skjøting av RBL genet siden skjøte nettsteder har blitt mutert.

Indel mutasjoner hadde variabel effekter på spådd protein sekvensen sammenlignet med vill type protein sekvensen (308 aminosyre rester) (tabell 2). Mer enn 70% av indeler resulterte i en anslått avkortet protein som er 10% eller mindre enn lengden på wild type protein. I noen indeler (mutasjon nummer 4, 5 og 6) var det spådd polypeptid 10 aminosyrer. Bare 2 tilfeller (nummer 2 og 3) resulterte sletting av 2 og 4 aminosyrer i protein spådd uten å endre lese rammen hvilke kanskje eller kanskje ikke påvirke funksjonen protein.

Bi-allel mutasjoner ble indusert med to andre gRNAs (Elaswad et al., upublisert) hvor begge kromosomene ble mutert i noen embryoer og ingen wild type alleler ble oppdaget. Med gel geleelektroforese PCR produkter hadde disse Foster bare ett band som var kortere enn vill type bandet (mer enn 200 bp sletting). DNA sekvensering av klonet PCR produkter bekreftet tilstedeværelse av bare en mutant allelet i alle vektorer i rekkefølge fra ett embryo (homozygous biallelic mutasjon) mens to mutant alleler oppstod i andre embryoer (heterozygote biallelic mutasjon). I noen andre embryoer som var mosaikk på mutasjon, ble både mutant (opptil 4 alleler) og vill type alleler oppdaget av DNA sekvensering av klonet PCR-produkter.

Figure 1
Figur 1 : Et sammendrag av microinjection prosedyrer for en celle kanalen Gråsteinbit (Ictalurus punctatus) embryo med gRNA/Cas9 protein utmaske toll/interleukin 1 reseptor domenet inneholder kort molekyl (TICAM1) gene og rhamnose bindende Lektiner (RBL) genet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Testiklene og egg av kanalen Gråsteinbit, Ictalurus punctatus . (A) velutviklet testiklene av kanalen Gråsteinbit menn er hvite med mange villiform anslag. (B) god egg fra kanalen Gråsteinbit kvinner er gyllen-gule farge med minimal eller ingen blodpropp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Microneedle trekke, lasting og microinjection av en celle kanalen Gråsteinbit, Ictalurus punctatus , embryoer. (A) nål trekke med en loddrett p avtrekker. P struktur og diameter påvirkes av varmen fra ovnen filament og solenoid force. (B) Microneedle lasting med CRISPR/Cas9 blanding med en microloader tips. (C) Arrangement av kanalen Gråsteinbit embryo i en 100 mm Petriskål inneholder Holtfreters løsning. Microneedle senkes til det berører og skjærer egg. (D) forstørret delen av panelet C viser prosessen med piercing egg. Merk pinne-spissen presser chorion membranen innover, men har ikke trengt det ennå. Injisert embryoer har røde injeksjon materialet inne. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : CRISPR/Cas9 indusert mutasjoner i toll/interleukin 1 reseptor domenet inneholder kort molekyl (TICAM1) gen koding sekvens av kanalen Gråsteinbit, Ictalurus punctatus . Blå sekvens representerer protospacer tilstøtende motivet (PAM) mens grønne sekvensen representerer målet for gRNA. Dobbel strand pause indusert av Cas9 protein forventet å skje på stedet av disse 2 røde trekantene. Mutasjoner er tildelt nummer 1 til 8. Sletting mutasjoner er representert av en stiplet linje hvor hver dash tilsvarer en nukleotid som er slettet. Rød sekvenser er innsettinger mens lilla representerer substitusjon mutasjon. Brøkdeler av 78 representerer den muterte alleler i 78 sekvensering reaksjoner (f.eks 3/78 betyr at en allelet ble oppdaget i 3 sekvensering reaksjoner fra totalt 78 reaksjoner). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Indel mutasjoner i kanalen Gråsteinbit, Ictalurus punctatus , toll/interleukin 1 reseptor domenet inneholder kort molekyl (TICAM1) genet koding sekvens indusert av microinjection gRNA/Cas9 protein i kanalen Gråsteinbit en celle embryo som åpenbart av DNA sekvensering chromatogram. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : CRISPR/Cas9 indusert mutasjoner i rhamnose bindende Lektiner (RBL) genet av kanalen Gråsteinbit, Ictalurus punctatus . Exonic sekvenser er store mens intronic sekvenser er små bokstaver. Blå sekvens representerer protospacer tilstøtende motivet (PAM) mens grønne sekvensen representerer målet for gRNA. En dobbel tråd pause indusert av Cas9 protein skulle skje på stedet av disse 2 røde trekantene. Mutasjoner er tildelt nummer 1 til 9. Sletting mutasjoner er representert av en stiplet linje hvor hver dash tilsvarer en nukleotid som er slettet. Rød sekvenser er innsettinger. Fraksjoner av 40 representerer antall mutert alleler i 40 sekvensering reaksjoner f.eks 2/40 betyr at en allelet ble oppdaget i 2 sekvensering reaksjoner fra totalt 40 reaksjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Mutasjon Innsetting Sletting Bevegelse (Δ) Protein lengde (aminosyre) Frameshift endret Tidlig stopp codon Anslått protein sekvens
WT 0 0 0 520 nei nei MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTSCSSYSLEISVST
ATTNNSNKESRPLPLKTPPESRDGQNHEAKPSS
PLVDHKPFYSVTKSYKSSDPTPLQERAQLEKFKF
RQYPDKHDTSEIVTPKSPNIESGLEKTFLSIPSGG
GKVGAQPVSTSKPPEASSTQEVGKHDSFSTEKQ
ASQEEEDMFYAFVILHAEEDSEEAVRLKSRLESIS
STIGATFSEDFAVPGQSTFRSVEDAIENSAYVMLL
LTPNFNTHLNETNADSALMNSIEKPHKHNTVIPL
LPRANGLTRNQMPFILRTKNPLVETRDRDTFEKM
AKKVLDLRNIQRQKSMWTEAQLVKKQREKQQW
LQEKKRYCKDFIQESPRVRELEEQIQQLKMQQQ
HLQPPYAQQTNSHQGFPGRPQSSGPMPFRSPS
PMPSYYSGNMWPQLPSNIHIQNAKCIMIGNNSTM
TVGGGVDSGDEDNF
(GenBank: NP_001187154.1
1 0 5 -5 104 ja ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTFVQLLQPRNQRIHS
HNQ
2 5 40 -35 94 ja ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSIS
GSRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAF
KVQKEPPKRDDSYPSSLRSTSNKSHNQ
3 0 87 -87 491 nei ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSKTPPESRDGQNHE
AKPSSPLVDHKPFYSVTKSYKSSDPTPLQERAQ
LEKFKFRQYPDKHDTSEIVTPKSPNIESGLEKTFL
SIPSGGGKVGAQPVSTSKPPEASSTQEVGKHDSF
STEKQASQEEEDMFYAFVILHAEEDSEEAVRLKS
RLESISSTIGATFSEDFAVPGQSTFRSVEDAIENSA
YVMLLLTPNFNTHLNETNADSALMNSIEKPHKHN
TVIPLLPRANGLTRNQMPFILRTKNPLVETRDRDT
FEKMAKKVLDLRNIQRQKSMWTEAQLVKKQREK
QQWLQEKKRYCKDFIQESPRVRELEEQIQQLKMQ
QQHLQPPYAQQTNSHQGFPGRPQSSGPMPFRSP
SPMPSYYSGNMWPQLPSNIHIQNAKCIMIGNNST
MTVGGGVDSGDEDNF
4 3 131 -128 95 ja ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSRAFKSPG
5 1 0 1 106 ja ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSIFVQLLQPRNQRIH
SHNQ
6 1 0 1 106 ja ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTFVQLLQPRNQRIH
SHNQ
7 14 0 14 100 ja ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSRSTPPPRAAPTA
8 35 9 26 91 ja ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTQV

Tabell 1: Effekter av indel mutasjoner i toll/interleukin 1 reseptor domenet inneholder kort molekyl (TICAM1) genet koding sekvens av kanalen Gråsteinbit, Ictalurus punctatus, på spådd protein lengde (aminosyrer) og rekkefølge i forhold til naturen Skriv inn sekvens (WT).

Mutasjon Innsetting Sletting Bevegelse (Δ) Protein lengde (aminosyre) Frameshift endret Tidlig stopp codon Anslått protein sekvens
WT 0 0 0 308 nei nei MMLFLKLSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQR
LTCETGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFT
NCALRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFG
TYKYYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSIE
IINANYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNTL
SIVAAMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYLT
VSYICTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGRT
DSTTCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARCE
EQSSCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
(GenBank: AHJ14694.1) 53
1 0 5 -5 29 ja ja MMLFLKPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
2 0 6 -6 306 nei nei MMLFLSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQRLT
CETGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFTN
CALRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFG
TYKYYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSI
EIINANYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNT
LSIVAAMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYL
TVSYICTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGR
TDSTTCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARC
EEQSSCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
3 0 12 -12 304 nei nei MILSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQRLTCE
TGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFTNCA
LRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFGTYK
YYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSIEIINA
NYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNTLSIVA
AMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYLTVSYI
CTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGRTDST
TCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARCEEQS
SCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
4 0 16 -16 6 ja ja MMLFLN
5 0 183 -183 8 nei ja MMLFLKRI (forutsatt skjøting ikke endres)
6 1 183 -182 5 ja ja MMLFL (forutsatt skjøting ikke endres)
7 1 0 1 31 ja ja MMLFLKTQPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
8 1 0 1 31 ja ja MMLFLKSQPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
9 20 0 20 18 ja ja MMLFLKASSHISSSASSP

Tabell 2: Effekter av indel mutasjoner i rhamnose bindende Lektiner (RBL) genet av kanalen Gråsteinbit, Ictalurus punctatus, spådde protein lengde (aminosyrer) og rekkefølgen sammenlignet med vill type sekvensen (WT).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En detaljert protokoll for microinjection av kanalen Gråsteinbit embryo å oppnå genet knockout ble presentert. Injeksjon av CRISPR/Cas9 protein i eggeplomme er mye enklere, sparer tid og krever ikke omfattende opplæring i forhold til microinjecting blastodisc av en celle embryoet, som er den vanlige fremgangsmåten for de fleste genoverføring og gene redigering med fisk 30 , 42. gjeldende protokollen viste seg for å være vellykket i inducing indeler i kanalen Gråsteinbit TICAM 1 og RBL gener. Prosedyrene pålitelig og effektiv legge grunnlaget for å generere fremtidige genet knockouts i kanalen Gråsteinbit. Protokollen kan endres for å målrette andre gener i kanalen Gråsteinbit genomet ved hjelp av CRISPR/Cas9-systemet, eller for å tilpasse andre gene teknologier steinbit, som tol2 mediert transgenesis. Det er også verdt evaluering i andre steinbit arter som den blå steinbit (I. furcatus), som er kommersielt viktig og egg synes å være mer følsomme for håndtering enn kanalen Gråsteinbit egg. Men hvis andre gRNAs eller biologisk aktive stoffer som DNA eller mRNA injiseres, må protokollen være optimalisert for å finne de beste forholdene.

I protokoller for microinjection av fisk embryo microinjection prosedyrer kan deles inn i to hovedkategorier: injeksjon i embryonale celler og injeksjon i eggeplomme. I medaka, ble morpholinos injisert i cytoplasm i en celle embryo å studere ulike utviklingsprosesser i vivo41. I kanalen Gråsteinbit, CRISPR/Cas9 mRNA målretting GnRH genet ble microinjected i blastodisc av en celle embryo30. I Trepigget Stingsild (Gasterosteus aculeatus), var blastomeres microinjected for å generere transgenics og gene fortrenging42. På den annen side, var en celle sebrafisk embryo eggeplomme-injisert med morpholinos å manipulere protein hjertet av Glass (Heg), som viste seg for å være effektive43. Disse 2 typer tilnærming har sine fordeler og ulemper, men hvis begge bevise har samme effektiviteten for de samme artene, eggeplomme microinjection av en celle embryo vil bli foretrukket av flere grunner.

Eggeplomme microinjection er mindre invasiv til embryoer, siden microinjection nålene ikke pierce embryonale celler. I tillegg kan mange embryoer injiseres i en kort periode mens embryoene er fortsatt på den første cellen scenen. Det er ikke nødvendig å justere embryoene i en bestemt posisjon. Dette vil også spare tid og redusere stress håndtering av embryo. I sesongen gyting fisk, er det en begrenset gyting tid der alle prosedyrer må gjøres for å oppnå vellykket knockout. I kanalen Gråsteinbit, finne varer i ca 2 måneder44. Derfor tillater utvikle en rask og effektiv microinjection protokollen microinjection av mange embryo mot mange gener i denne kort tidsrom. Heldigvis kan kanalen Gråsteinbit være kunstig gytt for å levere et stort nok antall embryo for microinjection å overvinne den høye dødeligheten på grunn av microinjection prosedyrer45. I tillegg kontrolleres av befruktning for å sikre at embryo i én celle scenen ved behov.

Microinjection av CRISPR/Cas9 indusert indeler i ulike fiskeslag inkludert sebrafisk, laks (Salmo salar L.), Nil-tilapia (Oreochromis niloticus), kanalen Gråsteinbit, Atlantic killifish (Fundulus heteroclitus) 46og felles karpe5,30,46,47,48,49,50. I tillegg ble CRISPR/Cas9 systemet brukt til å forstyrre gener i Labeo rohita karpe via homologe rekombinasjon-mediert innsetting av utenlandske DNA i målrettede gener51. I denne protokollen, ble vellykket indeler indusert i koding sekvenser med dramatiske effekter på spådd protein sekvensen, inkludert frameshift mutasjoner som resulterer i tidlig stopp codon. Fenotypiske effekten av disse mutasjonene må undersøkes. Avkortet mRNAs er mest sannsynlig degradert gjennom tull-mediert mRNA forfall (NMD) sti, som resulterer i reduksjon eller hemming av uttrykk, og hvis uttrykt, avkortet proteiner vil trolig bli nonfunctional52,53 .

I vårt eksperiment med RBL genet, to typer mutasjoner (nummer 5 og 6) førte sletting av 183 bp helt fjerne halvparten av ekson 1, intron 1, ekson 2 og del av intron 2. Teoretisk sett kan denne typen mutasjon endre skjøting av RBL pre-mRNA. Mutasjoner på webområdene skjøte hemmer evnen til spliceosome å gjenkjenne ekson54.

I konklusjonen, er utviklingen av en pålitelig og effektiv protokoll for målrettet genet redigering i kanalen Gråsteinbit avgjørende for å studere funksjonell genomforskning, spesielt etter genomisk ressursene har blitt beriket med den siste sekvensering av kanalen gråsteinbit genomet. Prosedyrene som er beskrevet her er enkel, rask, men effektiv og er bevist å kunne oppnå genet knockout. To gener, TICAM 1 og RBL, var rettet for å demonstrere effektiviteten av CRISPR/Cas9 knockout bruker microinjection. Avhengig av hva er blitt injisert, kan protokollen endres for å inkludere andre biologisk aktive stoffer. Det kan også endres for å microinject andre steinbit arter eller andre fiskearter som har lignende egg struktur og sammensetning. Denne protokollen grunnlaget for genet knockout i kanalen Gråsteinbit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Denne forskningen ble finansiert av USDA-NIFA prisen 2015-67015-23488 til Roger Cone. Forfatterne takker Dr. Ronald Phelps for beskrivelsen av Foreldreomsorg og yngelens lager utvalgskriterier i videoen. Ahmed Elaswad og Karim Khalil gjerne takke egyptiske kulturelle og pedagogiske byrå i Washington DC for finansiering deres doktorgrad forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reproboost implant Center of Marine Biotechnology Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females
TRICAINE-S Western Chemical. Inc. For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. 
Phenol red Sigma-Aldrich P0290 0.5%, sterile filtered
Stereo microscope Olympus 213709 For visualizing the eggs during microinjection
Microinjector ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MPPI-3 For the delivery of the injection material into the embryos
Micromanipulator ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MM33  For holding and controlling the movement of the injection needle. 
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956.003 For loading injection solution into microinjection needles.
Vertical needle puller David Kopf Instruments Model 720 For pulling microinjection needles
Cas9 protein PNA Bio Inc.  CP01 Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.
Expand High FidelityPLUS PCR System  Roche Diagnostics, USA For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation
Borosilicate glass capillaries Fisher Scientific 1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.
Petri dish VWR 25384-302 For holding the embryos during the microinjection.
Crisco The J.M. Smucker Company Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. 
Holtfreter`s solution Home Made 59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. 
Doxycycline hyclate USP (monohydrate) Letco Medical 690904 Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hammer, R. E., et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 315, 680-683 (1985).
  2. Komarova, Y., Peloquin, J., Borisy, G. Components of a microinjection system. , Cold Spring Harb. Protoc. 935-939 (2011).
  3. Du, S. J., et al. Growth enhancement in transgenic Atlantic salmon by the use of an "all fish" chimeric growth hormone gene construct. Nat. Biotechnol. 10 (2), 176-181 (1992).
  4. Davis, B., Brown, D., Prokopishyn, N., Yannariello-Brown, J. Micro-injection-mediated hematopoietic stem cell gene therapy. Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (4), 412-419 (2000).
  5. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  6. Liu, Z., et al. The channel catfish genome sequence provides insights into the evolution of scale formation in teleosts. Nat. Commun. 7, (2016).
  7. Abdelrahman, H., et al. Aquaculture genomics, genetics and breeding in the United States: current status, challenges, and priorities for future research. BMC Genomics. 18 (1), 191 (2017).
  8. Dunham, R. A. Aquaculture and Fisheries Biotechnology : Genetic Approaches. , 2nd, CABI. (2011).
  9. Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat. Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
  10. Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
  11. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  12. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  15. Cradick, T. J., Fine, E. J., Antico, C. J., Bao, G. CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Res. 41 (20), 9584-9592 (2013).
  16. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  17. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  18. Li, M., Zhao, L., Page-McCaw, P. S., Chen, W. Zebrafish genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Trends Genet. 32 (12), 815-827 (2016).
  19. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841 (1982).
  20. Powers, D. A., et al. Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish (Brachydanio rerio), channel catfish (Ictalurus punctatus), and common carp (Cyprinus carpio). Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 301-308 (1991).
  21. Inoue, K., et al. Electroporation as a new technique for producing transgenic fish. Cell Differ. Dev. 29 (2), 123-128 (1990).
  22. Buono, R., Linser, P. Transient expression of RSVCAT in transgenic zebrafish made by electroporation. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 271-275 (1991).
  23. Sin, F., et al. Gene transfer in chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) by electroporating sperm in the presence of pRSV-lacZ DNA. Aquaculture. 117 (1-2), 57-69 (1993).
  24. Dunham, R. A., et al. Enhanced bacterial disease resistance of transgenic channel catfish Ictalurus punctatus possessing cecropin genes. Mar. Biotechnol. 4 (3), 338-344 (2002).
  25. Lu, J. K., Fu, B. H., Wu, J. L., Chen, T. T. Production of transgenic silver sea bream (Sparus sarba) by different gene transfer methods. Mar. Biotechnol. 4 (3), 328-337 (2002).
  26. Cheng, Q., et al. Interaction of diet and the masou salmon Δ5-desaturase transgene on Δ6-desaturase and stearoyl-CoA desaturase gene expression and N-3 fatty acid level in common carp (Cyprinus carpio). Transgenic Res. 23 (5), 729-742 (2014).
  27. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J. Biotechnol. 208, 44-53 (2015).
  28. Treen, N., et al. Tissue-specific and ubiquitous gene knockouts by TALEN electroporation provide new approaches to investigating gene function in Ciona. Development. 141 (2), 481-487 (2014).
  29. Qin, Z., et al. Editing of the luteinizing hormone gene to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using a modified zinc finger nuclease technology with electroporation. Mar. Biotechnol. 18 (2), 255-263 (2016).
  30. Qin, Z. Gene editing of luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone and gonadotropin-releasing hormone genes to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using zinc finger nuclease, transcription activator-like effector nuclease and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 technologies. , Auburn University. AL. Ph.D. thesis (2015).
  31. Dunham, R. A., Winn, R. N. Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. Pinkert, C. A. , Elsevier BV. Amsterdam. 308-336 (2014).
  32. Elaswad, A. Genetic technologies for disease resistance research and enhancement in catfish. , Auburn University. AL. Ph.D. thesis (2016).
  33. Baoprasertkul, P., Peatman, E., Somridhivej, B., Liu, Z. Toll-like receptor 3 and TICAM genes in catfish: species-specific expression profiles following infection with Edwardsiella ictaluri. Immunogenetics. 58 (10), 817-830 (2006).
  34. Thongda, W., Li, C., Luo, Y., Beck, B. H., Peatman, E. L-rhamnose-binding lectins (RBLs) in channel catfish, Ictalurus punctatus: Characterization and expression profiling in mucosal tissues. Dev. Comp. Immunol. 44 (2), 320-331 (2014).
  35. Phelps, R. P., et al. Effects of temperature on the induced spawning of channel catfish and the production of channel× blue catfish hybrid fry. Aquaculture. 273 (1), 80-86 (2007).
  36. Poole, W., Dillane, M. Estimation of sperm concentration of wild and reconditioned brown trout, Salmo trutta L. Aquacult. Res. 29 (6), 439-445 (1998).
  37. Billard, R. Spermatogenesis and spermatology of some teleost fish species. Reprod. Nutr. Dev. 26 (4), 877-920 (1986).
  38. Coyle, S. D., Durborow, R. M., Tidwell, J. H. Anesthetics in aquaculture. , Southern Regional Aquaculture Center Publication 3900. Stoneville, Mississippi. (2004).
  39. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nat. Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  40. Armstrong, J., Duhon, S., Malacinski, G. Developmental Biology of the Axolotl. , 220-227 (1989).
  41. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J. Vis. Exp. (46), (2010).
  42. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055 (2016).
  43. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  44. Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. Biology and Culture of Channel Catfish. 34, Elsevier. 69-94 (2004).
  45. Su, B., et al. Relative effectiveness of carp pituitary extract, luteininzing hormone releasing hormone analog (LHRHa) injections and LHRHa implants for producing hybrid catfish fry. Aquaculture. 372, 133-136 (2013).
  46. Aluru, N., et al. Targeted mutagenesis of aryl hydrocarbon receptor 2a and 2b genes in Atlantic killifish (Fundulus heteroclitus). Aquat. Toxicol. 158, 192-201 (2015).
  47. Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
  48. Edvardsen, R. B., Leininger, S., Kleppe, L., Skaftnesmo, K. O., Wargelius, A. Targeted mutagenesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.) using the CRISPR/Cas9 system induces complete knockout individuals in the F0 generation. PLoS ONE. 9 (9), e108622 (2014).
  49. Li, M., et al. Efficient and heritable gene targeting in tilapia by CRISPR/Cas9. Genetics. 197 (2), 591-599 (2014).
  50. Zhong, Z., et al. Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp. Sci. Rep. 6, (2016).
  51. Chakrapani, V., et al. Establishing targeted carp TLR22 gene disruption via homologous recombination using CRISPR/Cas9. Dev. Comp. Immunol. 61, 242-247 (2016).
  52. Lim, J., Ghadessy, F. J., Yong, E. A novel splice site mutation in the androgen receptor gene results in exon skipping and a non-functional truncated protein. Mol. Cell. Endocrinol. 131 (2), 205-210 (1997).
  53. Gatfield, D., Unterholzner, L., Ciccarelli, F. D., Bork, P., Izaurralde, E. Nonsense-mediated mRNA decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian pathways. The EMBO Journal. 22 (15), 3960-3970 (2003).
  54. Talerico, M., Berget, S. M. Effect of 5'splice site mutations on splicing of the preceding intron. Mol. Cell. Biol. 10 (12), 6299-6305 (1990).

Tags

Genetikk problemet 131 CRISPR/Cas9 gene redigering gene knockout microinjection kanalen Gråsteinbit embryo mutasjon avkortet protein indeler
Microinjection CRISPR/Cas9 protein i kanalen Gråsteinbit, <em>Ictalurus punctatus</em>, embryo for Gene Editing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elaswad, A., Khalil, K., Cline, D.,… More

Elaswad, A., Khalil, K., Cline, D., Page-McCaw, P., Chen, W., Michel, M., Cone, R., Dunham, R. Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing. J. Vis. Exp. (131), e56275, doi:10.3791/56275 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter