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Genetics

Microinjection de protéine CRISPR/Cas9 dans des embryons de barbue de rivière, Ictalurus punctatus, pour Gene Editing

Published: January 20, 2018 doi: 10.3791/56275
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 4, 4, 5, 5, 1
1School of Fisheries, Aquaculture and Aquatic Sciences, Auburn University, 2Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine, Suez Canal University, 3Anatomy and Embryology Department, Faculty of Veterinary Medicine, Cairo University, 4Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 5Life Science Institute, University of Michigan
* These authors contributed equally

Summary

Un protocole de microinjection simple et efficace pour l’édition de gène dans des embryons de barbue en utilisant le système CRISPR/Cas9 est présenté. À ce protocole, le guide des ARN et protéine Cas9 étaient micro dans le jaune d’embryons unicellulaire. Ce protocole a été validé par assommant deux gènes immunitaires de barbue.

Abstract

Le génome complet de la barbue de rivière, Ictalurus punctatus, a été séquencé, menant à plus grandes possibilités pour l’étude de la fonction du gène barbue. Knock-out du gène a été utilisé pour étudier ces fonctions de gènes in vivo. Le cluster régulièrement entrecoupées de protéine de courtes répétitions/CRISPR palindromique associé 9 (CRISPR/Cas9) système est un outil puissant permettant de modifier les séquences d’ADN génomique pour altérer la fonction du gène. Alors que l’approche traditionnelle a été d’introduire CRISPR/Cas9 ARNm dans des embryons de cellule unique entre la microinjection, cela peut être un processus lent et inefficace dans le poisson-chat. Ici, un protocole détaillé pour microinjection des embryons de barbue avec CRISPR/Cas9 protéine est décrite. Brièvement, œufs et du sperme ont été recueillie et puis artificielle fécondation effectuée. Les œufs fécondés sont transférés à une boîte de Pétri contenant la solution de Holtfreter. Volume d’injection a été étalonné et ensuite guider RNAs/Cas9 ciblant le gène de la molécule (1 TICAM) adaptateur contenant du domaine récepteur péage/interleukine 1 et gène de rhamnose binding lectine (RBL) ont été microinjected dans le jaune d’embryons unicellulaire. Le coup de grâce de gène a réussi comme indels ont été confirmés par le séquençage de l’ADN. Les altérations de séquence de protéine en raison de ces mutations inclus déphasage et tronquée de protéine en raison de codons stop prématurés.

Introduction

Microinjection est une technique courante de laboratoire utilisée pour livrer une petite quantité d’une substance telle que l’ADN, ARN, protéines et autres macromolécules dans des cellules ou des embryons dans un capillaire de verre1. Microinjection est effectuée à l’aide de la configuration d’équipements spéciaux dont un microinjector micromanipulateur et un microscope2. La technique a été utilisée par les chercheurs de modifier génétiquement les nombreux organismes grâce à la génération de transgénèse, débouchures de gènes et thérapie génique, dans le but de comprendre la dynamique des composants intracellulaires3,4 , 5.

La barbue de rivière (Ictalurus punctatus) est l’espèce de poisson-chat plus populaires dans l’aquaculture et les activités de pêche récréative aux États-Unis. Il y a un besoin croissant pour l’étude génomique fonctionnelle chez la barbue et le séquençage du génome complet du barbue améliore l’utilité des progrès récents en génomique édition outils6,7. Comprendre la fonction du gène n’enrichirait pas seulement la recherche qui est actuellement menée sur le poisson-chat, mais pourrait également conduire à des programmes d’amélioration génétique plus efficaces pour améliorer l’industrie du poisson-chat. Une fois que les gènes critiques pour un trait donné d’intérêt sont identifiés, ils peuvent être utilisés pour améliorer génétiquement production poisson-chat par l’édition de génome pour générer des allèles bénéfiques, sélection pour ces allèles, supprimant les allèles préjudiciables, transfert les allèles avantageux grâce à la transgénèse, ou une combinaison de ces options. Combinant les meilleurs gènes pour différents traits commercialement bénéfiques provenant de différentes espèces dans un poisson améliorerait considérablement la productivité et la rentabilité de poisson production opérations8.

Knock-out du gène est une méthode directe pour étudier les fonctions de gènes in vivo. Mutations au niveau de l’ADN seront héritées par les générations futures qui faciliteront l’étude de leurs effets dans les différentes générations. Outils d’édition différents génomes ont été développés notamment zinc finger nucleases (ZFNs), transcription nucléases activator comme effecteur (TAPS) et groupés régulièrement dois‑je court palindrome répétitions/CRISPR-protéine associée à la 9 (CRISPR/Cas9 ) système9,10,11,12.

Le système CRISPR/Cas9 est un outil puissant et efficace qui a été utilisé pour modifier des séquences d’ADN génomique y compris knock-out du gène chez les poissons à guidage RNA DNA in situ clivage5,13. Le système est constitué d’un ARN guide (gRNA), qui détermine la séquence ciblée dans le génome et une enzyme d’endonucléase ADN, Cas9. Le système CRISPR/Cas9 peut être conçu pour cibler n’importe quelle séquence du génome avec plusieurs avantages par rapport aux ZFNs et TALENs : (1) plus bas coût d’ingénierie (2) plus facile fixation (3) plus spécifique du guide RNA de la séquence cible et réduit les mutations hors cible (4) plusieurs séquences peuvent être ciblées avec différent gRNA à la même vitesse de mutagenèse haute heure (5) dans les gènes qui ne pourrait pas être muté par TALENs et (6) taux de transmission meilleure lignée germinale des mutations pour jusqu'à 6 fois par rapport aux ZFNs et TALENs14, 15,16,17,18.

L’autre principale méthode de microinjection est électroporation, dans lequel les impulsions électriques sont appliquées à des embryons ou des cellules pour augmenter la perméabilité de la membrane et l’absorption des molécules biologiques19,20. Plusieurs poissons transgéniques ont été générés en utilisant l’électroporation comme medaka (Oryzias latipes), poisson zèbre (Danio rerio), le saumon chinook (Oncorhynchus tshawytscha), barbue, la dorade (Sparus sarba), et commune la carpe (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.

Électroporation a été utilisée pour fournir des protéines ADN, d’ARN et Cas9 de plasmide pour knock-out du gène. Dans les cellules de mammifères, Cas9/gRNA plasmid DNA, Cas9 ARNm/gRNA et des complexes de protéine/gRNA Cas9 ont été livrés à l’aide d’électroporation et les taux de mutagenèse étaient plus élevés utilisant des complexes de protéine/gRNA Cas9 pour la plupart électroporation conditions testées27. Les chordés ascidies (Ciona intestinalis), TALENs exprimant les constructions étaient électroporation dans des oeufs fécondés pour induire la knockout de multiples gènes28. ZFNs exprimant le plasmide constructions étaient électroporation pour assommer l’hormone lutéinisante dans barbue29. Cependant, une fois introduit dans la cellule, des constructions de plasmide devra être transcrit à l’ARN et traduit en protéines fonctionnelles avant qu’ils peuvent cibler la séquence d’ADN désirée, ce qui retarderait probablement le temps de la mutagénèse par rapport à la microinjection d’ARN / protéine. Telle qu’un embryon se développe, mutagenèse retard augmente le mosaïcisme des fondateurs injectées. En outre, l’expression transgénique est peu susceptible d’atteindre le niveau d’expression possible avec microinjection, abaissant l’efficacité de la mutagénèse.

Comme un moyen pour introduire des outils d’édition du génome dans les cellules, microinjection présente plusieurs avantages sur électroporation. Génome, édition de molécules peut être fiable introduit dans des cellules ou des embryons par microinjection30. Moins de matériel injection est nécessaire. Il est facile de déterminer les quantités de matériau injecté. Mutation plus élevée avec faible mosaïcisme chez les poissons du fondateur, les taux peuvent être réalisés qui améliorerait la transmission de la lignée germinale des mutations à F1. Moins de poissons fondateur doivent être analysées pour produire la première génération, en raison du taux de mutation plus élevé. Dans l’électroporation, plus de poisson fondateur doivent être analysées qui augmentera les coûts. Cependant, la survie des embryons de barbue micro est inférieure à électroporation ceux, même si cela peut être surmonté en injectant plus embryons31,32. Barbue de rivière, la survie des embryons de jaune d’oeuf-micro varie de 16 à 55 % selon les gènes ciblés et le dosage de la protéine gRNA/Cas932.

Microinjection régulière des embryons de poisson-chat est techniquement difficile et chronophage, cependant, un protocole de microinjection de protéine CRISPR/Cas9 rapid et efficace est présenté pour les embryons de barbue. Ce protocole requiert moins de temps et expertise, puisque la solution protéique CRISPR/Cas9 est injectée dans le jaune d’un embryons de cellule. Des centaines d’oeufs fécondés peuvent être injectés en 1 h (environ le temps nécessaire à la première division cellulaire se produire). Pour valider le protocole, deux gènes reliés à la susceptibilité de la maladie ont été éliminés barbue, le gène molécule (TICAM1) adaptateur sans frais/interleukine 1 récepteur contenant du domaine et le gène de lectine (RBL) de liaison de rhamnose. 1 TICAM est impliqué dans la voie de signalisation initiée par récepteur toll-like (TLR) 3. Chez la barbue, TICAM 1 a considérablement augmenté suite à un tacle bactérien avec Edwardsiella ictaluri, alors qu’il était diminuée dans le poisson-chat bleu, une espèce résistante à ictaluri E.33. RBL joue un rôle important dans l’infection précoce avec celui de Flavobacterium, l’agent causal de la maladie columnaris, où aiguë et upregulation robuste a été enregistrée chez une souche de barbue columnaris-sensible par rapport à un souche résistante à columnaris34.

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Protocol

Cette expérience a été menée au poisson Genetics Research Unit, E. W. Shell Fisheries Research Center, Université d’Auburn, Alabama. Tous les protocoles expérimentaux utilisés dans cette expérience ont été approuvées par l’Auburn University Institutional Animal Care et le Comité de l’urbanisme (UA-IACUC) avant le début de l’expérience. Une liste du matériel et des fournitures utilisées dans cette expérience se trouvent dans la Table des matières. Voici les étapes et les procédures de préparation et de la microinjection d’embryons unicellulaire barbue tel qu’illustré à la Figure 1.

1. sélection de titres et de frai de géniteurs

  1. Choisissez saine barbue de géniteurs de la souche ou lignée génétique d’intérêt. Femelles et mâles de barbue devraient montrer bon les caractères sexuels secondaires.
  2. Sélectionner les mâles qui ont une tête large et musclée qui est plus large que le reste de leur corps avec la papille génitale bien développé. Couleur sombre, de cicatrices et de blessures de ces combats territoriaux sont aussi des signes de préparation sexuelle. Sélectionner les femelles qui ont des têtes qui sont moins larges que le reste de leur corps et ont un abdomen mou, palpable, bien équilibré. Pour une précision et d’éviter soulignant le poisson lors de la première manipulation, cesser de nourrir les femelles 2 ou 3 jours avant d’examiner leur état de préparation pour le frai.
  3. Effectuer des poissons manutention rapidement, mais avec précaution. Pour réduire le stress de la manipulation, effectuez toutes les procédures nécessitant une manipulation femelles tout en maintenant le poisson fraie sacs (maillage de taille 32 mm).
  4. Juste avant l’injection d’hormones pour induire l’ovulation, mesurer le poids des femelles.
  5. Accrocher les sacs de reproduction avec des femelles à l’intérieur d’un flux par le biais de réservoir avec écoulement continu de l’eau et l’aération adéquate.
  6. Conditions d’asepsie, charger l’implanteur qui a une aiguille de 14 G avec 85 µg/kg de l’hormone lutéinisante implant (LHRHa) analogue de l’hormone. Rincez le site d’injection (musculature dorsale) 0,9 % solution saline stérile avant l’injection. Insérez l’implanteur à un angle de 45° et libérer l’implant. Retirer l’aiguille et le coup du site d’injection avec un tampon d’ouate gonflée dans l’éthanol à 70 %.
  7. Place le sac de frai dans le réservoir afin que le poisson soit totalement immergé dans l’eau 15 à 20 cm sous la surface de l’eau. Une aération adéquate (au-dessus de 5 ppm dissous d’oxygène) et bonne qualité d’eau sont importantes pour l’ovulation des oeufs de haute qualité.
  8. Prédire le moment de l’ovulation basé sur la température de l’eau à l’aide de la relation de degré-heure (h)35. Temps de réponse de degré-h = temps entre l’injection d’hormones et de l’ovulation (h) * température (° C) de l’eau. Par exemple, pour un temps de réponse de degré-h de 900 à 1 000, une femme est censée frayer à 36-40 h de temps d’injection de l’hormone à 25 ° C. Habituellement, la première vérification des oeufs se faite à environ 36 h après l’injection d’hormones, puis à intervalle de 4 h.
  9. Pour vérifier l’ovulation, soulevez doucement le sac frai au-dessus de la surface de l’eau pendant que vous cherchez les oeufs qui sont fixées à l’intérieur du sac de frai. Voir au moins 10 oeufs indique cette femelle est ovulation et prêt pour le décapage de la main.

2. préparation de sperme

NOTE : Sperme peut être préparé quelques h avant l’heure prévue de l’ovulation.

  1. Euthanasier les hommes par un percussion coup sur la tête sans anesthésie, car l’anesthésie peut avoir un effet négatif sur la motilité des spermatozoïdes.
  2. Recueillir les testicules dans une petite casserole de pesage, supprimer n’importe quel tissu et lavez-les avec 50 mL de sérum physiologique 0,9 % pour enlever le sang, si nécessaire. Testicules bien développées sont blanches avec nombreuses projections villiformes ( Figure 2).
  3. Déterminer le poids des testicules.
  4. Pour préparer la solution de sperme pour la fécondation de l’ovule, transférer les testicules vers le centre de la maille 100 cm2 100 µm avec une pincette. Plier le maillage avec les testicules à l’intérieur, écraser les testicules et le sperme de filtre dans un tube de prélèvement de 50 mL. Cela peut être fait en appliquant une pression de testicules à l’intérieur de la maille contre le bord de la douille de la collection via le pouce. Solution saline à 0,9 % permet de laver le sperme de la maille dans le tube de prélèvement. Une solution saline peut ajouter jusqu'à 10 mL/g de testicules.
  5. Déterminer la concentration des spermatozoïdes, vérifier la motilité et la viabilité.
    Remarque : La Concentration peut être déterminée en comptant les spermatozoïdes dans un volume connu de dilué de laitance utilisant un hémocytomètre. Alternativement, on peut estimer la densité du sperme en évaluant la densité optique de laitance à l’aide d’un spectrophotomètre. Dans cette méthode, l’absorption à la longueur d’onde de 505 nm est comparée à une Charte de contrôle qui a été préalablement préparée pour l’absorption des différentes concentrations de sperme36. La motilité des spermatozoïdes peut être vérifiée au microscope comme le moment de l’activation des spermatozoïdes jusqu'à cessation de sperme mouvement (appelé durée de motilité)37. La viabilité des spermatozoïdes peut être déterminée par le sperme avec des colorants sélectifs tels que le bleu de trypan qui tache de spermatozoïdes seulement non viables, tandis que les spermatozoïdes viables restera sans tache de coloration. Cependant, à ces opérations de microinjection, ce n’est pas nécessaire si les testicules sont bien développés.
  6. Stocker le sperme dans une solution saline 0,9 % de l’étape de 2,5 à 4 ° C et utiliser dans les 24h après préparation.

3. collecte et fécondation des oeufs

  1. Appliquez une très fine couche de matière grasse pour une propre et sèche pan de frai de 20 cm de diamètre.
  2. Placer la femelle dans la solution anesthésique contenant 100 ppm de méthane-sulfonate de tricaïne tamponnée avec du bicarbonate de sodium (pH de la solution finale doit être 7.0) jusqu'à ce que le poisson soit complètement anesthésiés38.
    ATTENTION : Méthane-sulfonate de tricaïne peut être irritant, s’il est inhalé, ingéré ou absorbé par la peau.
  3. Avec précaution, retirez le poisson du sac frai et tremper dans une solution saline de 0,9 % à laver la solution anesthésique. Sécher le poisson complètement à l’aide d’une serviette propre, en évitant la suppression de la couche de mucus sur la surface de corps de poisson.
  4. Appliquer shortening végétal sur la zone autour de l’évent, y compris les nageoires pelviennes, pour éviter la saisie des œufs pendant le stripping de la main.
  5. Main la bande les oeufs dans la poêle graissée fraie en appliquant une légère pression aux ovaires. Bons oeufs devraient circuler librement, être de couleur jaune doré et très peu ou aucun amas ou des caillots de sang (Figure 2). Éviter tout contact entre les oeufs et l’eau avant la fécondation, car l’eau peut stimuler la fermeture du micropyle.
  6. Pour fertiliser les oeufs à la microinjection, transférer 200 à 300 œufs dans un plat graissé de frai. Plante en plastique graissé étiquettes peut être utilisées comme une cuillère pour transférer les oeufs dans la poêle graissée fraie. Ajouter 1 à 2 mL de la solution de sperme (de l’étape 2.5) aux œufs et mélanger doucement. Le ratio des spermatozoïdes à le œuf doit être environ 11 000 spermes/ovules.
  7. Ajouter eau douce aux œufs pour activer le sperme et les ovules. Ajouter assez d’eau pour couvrir légèrement les œufs. Doucement agiter les oeufs pour 30 s. fécondation survient dans 1 à 2 min. Il est important de fertiliser les oeufs qui sont disposées en une seule couche. Oeufs de silure adhèrent les uns aux autres, compliquant la microinject des couches multiples d’embryons.
  8. Ajouter plus d’eau douce pour les oeufs fécondés et laisser les oeufs à durcir pendant 10 à 15 min.
  9. Couvrez la casserole fraie contenant les oeufs non fécondés restants par une serviette humide pour éviter le dessèchement et fertiliser pendant quelques heures. La fécondation peut se faire de manière échelonnée, par exemple, un lot de 200 à 300 oeufs peuvent être fécondés toutes les 30 à 60 minutes afin d’assurer un approvisionnement continu des embryons au stade une cellule pour la microinjection et embryons témoins non injectées. Éviter tout contact entre la serviette humide et les oeufs car les œufs peuvent adhérer à la serviette humide rendant difficile de les enlever. Dans ce protocole, oeufs fécondés dans les 2 – 3 h après le décapage ont été efficacement micro et avait un succès similaire comme œufs fécondés immédiatement après le décapage.

4. l’aiguille en tirant et chargement

  1. Extraire un verre de borosilicate de 1,0 mm OD capillaire dans 2 aiguilles (Figure 3). Rangez les aiguilles dans une boîte de papier avec un morceau d’éponge dans laquelle plusieurs incisions ont été faites. Pour éviter de casser l’aiguille, le diamètre de l’éponge doit être inférieur à la longueur de la tige de l’aiguille.
  2. Ouvrir l’extrémité de l’aiguille en brisant un petit morceau de région plus mince de l’aiguille à l’aide d’un objet pointu. Vous pouvez également ouvrir l’aiguille en pinçant au large de la région plus mince de la pointe avec une pince au microscope.
  3. Préparer la solution d’injection en mélangeant gRNA(s) protéine Cas9. Autres types d’ARN ou protéine peuvent aussi être injectés avec la même procédure. Dans ce protocole, gRNAs ont été conçus pour cibler deux des gènes apparentés immunitaire barbue, gène de molécule (TICAM1) adaptateur contenant du domaine du récepteur toll/interleukine 1 et gène de rhamnose binding lectine (RBL) et préparées selon Shah et al.. avec l’utilisation d’une haute fidélité Taq polymérase32,,39. Les cibles génomiques de gRNAs étaient GGA GGT GAA GCA CGT CGA GGA 3' pour TICAM 1 gène (Figure 4) 5' et 5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' de l’exon 1 du gène RBL avec motif adjacent de protospacer (PAM) séquence soulignée (Figure 6).
    1. BLAST guide RNA cibles contre le génome de barbue de séquence et choisissent ceux avec aucun hors-cible des sites potentiels.
    2. Ajouter rouge de phénol à la couleur de la protéine gRNA/Cas9 mélanger à un tiers du volume total.
    3. Ajuster la concentration finale de protéine gRNA/Cas9 mélange avec de l’eau libre nucléase afin que chaque embryon est injecté avec le 50 nL contenant environ 2,5 ng gRNA et 7,5 ng Cas9 protéine. Incuber le mélange pendant 10 min sur la glace avant utilisation.
  4. Avec un microloader, charger 5 à 10 µL du mélange gRNA/Cas9 dans l’aiguille d’injection en insérant le microloader dans la tige de l’aiguille et expulser le mélange lentement tout en rétractant la pointe de microloader (Figure 3). Ne pas emprisonner de bulles d’air à l’intérieur.
  5. Fixer l’aiguille à l’exploitant une micropipette et assurer un lien étroit, puis visser le support sur le micromanipulateur. Garantir la libre circulation stable. Appliquer une pression de microinjection en ouvrant la bouteille d’azote et en ajustant le régulateur de pression.
    Remarque : Le volume d’injection peut être affecté par la pression, le diamètre de l’ouverture de l’aiguille et la durée de l’injection. Pour déterminer le volume à injecter, à injecter dans une goutte d’huile minérale sur un hémocytomètre. Si nécessaire, la pression, la durée de l’injection et le diamètre de l’aiguille peut être ajusté pour augmenter ou diminuer le volume de l’injection. Injecter plusieurs fois dans l’huile minérale pour volume cohérent.

5. la microinjection d’embryons de poisson-chat

  1. Appliquez une très fine couche de matière grasse pour un plat de Pétri propre de 100 mm.
  2. À l’aide d’une étiquette de plante en plastique graissé, transfert de 50 à 100 oeufs du bac de la fécondation à la boîte de Pétri et recouvrez-les avec la solution de Holtfreter (Table des matières). Aligner les oeufs uns contre les autres en une seule couche. Cet alignement doit maintenir les oeufs en place au cours du processus de microinjection.
  3. Placez la boîte de Pétri avec les oeufs sur la scène du microscope et maintenez-le avec une seule main. Piquez l’aiguille avec l’autre main (Figure 3) jusqu'à ce qu’il perce le chorion et le jaune dans un seul mouvement fluide. La pointe de l’aiguille doit être aussi proche que possible de la blastodisc avant de livrer le matériel d’injection.
    1. Appuyer sur la pédale pour livrer le matériel d’injection dans le jaune. Si le blastodisc n’est pas clairement visible, le matériel d’injection peut se propager dans des lieux différents dans le jaune d’oeuf. Pour ce faire, l’aiguille est insérée à l’extrémité du jaune, puis appuyer sur la pédale et en retirant l’aiguille se font simultanément pour diffuser le matériel d’injection à travers différents domaines du jaune. Jusqu'à 50 microseringues peuvent être injectés dans le jaune de barbue d’embryons, cependant, la quantité de protéines gRNA/Cas9 doit être optimisée pour chaque gène obtenir les meilleurs résultats pour mutation embryon et taux de survie32.
  4. Retirer l’aiguille en douceur pour éviter d’endommager le œuf. Déplacer la boîte de Pétri pour injecter un autre oeuf avec la même procédure. Éviter tout mouvement de la boîte de Pétri au cours du processus d’injection, car cela pourrait endommager le œuf ou de casser l’aiguille. Retirer les œufs s’est rompues ou endommagés en raison de la microinjection. Injection peut être démarré à 15 – 20 min après la fécondation et continuer aussi longtemps que les embryons sont encore en phase d’une cellule (jusqu'à environ 60 à 90 min après la fécondation).
  5. Placez les embryons injectées en solution de Holtfreter contenant 10 ppm de doxycycline et continue aération douce pour 6 à 7 jours avant l’éclosion de40. Changez la solution tous les jours et retirer les embryons morts.

6. détection de mutations

  1. Au hasard, recueillir plusieurs embryons injectées à 72 h après la fécondation, enlevez le jaune et extraire l’ADN génomique. Inclure non injectés de 3 – 5 embryons sous forme de contrôle.
    Remarque : L’ADN génomique peut être extraites des embryons après enlèvement des coquilles d’oeufs et de matériel de jaune de œuf à l’aide de la digestion de la protéinase K et éthanol précipitation32.
  2. Amplifier un segment d’ADN flanquant les cibles génomiques pour gRNA de chaque gène, où les mutations sont censées se produire, en utilisant une haute fidélité Taq polymérase32. Pour TICAM 1, les amorces 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG 3' (avec impatience) et 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (marche arrière) ont été utilisées pour amplifier un 750 bp alors que pour la RBL, les amorces 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3' (avec impatience) et 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (marche arrière) ont été utilisées pour amplifier un segment bp 375 du gène de la RBL.
    1. Utiliser la réaction PCR : jusqu'à 20 µL PCR l’eau de qualité ; 1 x haute fidélité tampon de réaction enzyme Taq avec MgCl2, dNTP 0,2 mM mix, 0,4 µM pour chacun de l’apprêt avant et arrière de la même série, 100-300 ng ADN génomique et 1,25 unité de mélange d’enzyme Taq haute fidélité. Effectuer des conditions cyclisme d’amplification : dénaturation initiale à 94 ° C pendant 3 min ; 35 cycles de dénaturation à 94 ° C pendant 30 s, recuit à 60 ° C pendant 55 s pour TICAM et 40 s pour RBL, extension à 72 ° C pendant 1 min/kb ; et une extension finale à 72 ° C pendant 10 min.
  3. Détecter les embryons mutants à l’aide d’une méthode de détection de mutation comme le séquençage des amplicons purifiées, test de détection de mutation arpenteur, analyse de mobilité hétéroduplex, perte du site de reconnaissance des enzymes de restriction, ou toute autre méthode de détection de mutation qui est approprié pour la cible. Dans ce protocole, détecter les embryons mutants à l’aide de test de détection de mutation arpenteur pour TICAM 1 et perte d’enzyme de restriction que SAPI couper site mais aussi de séquençage des produits PCR purifiés pour le gène de la RBL.
  4. Afin d’identifier les allèles mutants, cloner des produits PCR et vecteurs de la séquence des colonies individuelles. Les allèles mutants présentés dans la Figure 4 et Figure 6 provenaient d’embryons injectées. Produits PCR de six micro et embryons de 3 témoins pour chaque gène ont été regroupées dans deux tubes séparés, un pour les embryons microinjectés et l’autre pour les embryons de témoins, rapidement clonés et 86 vecteurs pour TICAM 1 et 48 vecteurs de gènes RBL séquencé, dont 8 le séquençage de réactions de 3 embryons de témoins non injectés pour chaque gène.
  5. Pour identifier les différents allèles mutants, comparer les séquences d’embryons mutants à la séquence de type sauvage à l’aide de n’importe quel outil d’alignement de séquence ADN comme BLAST ou T-café.

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Representative Results

Pour démontrer l’efficacité du protocole microinjection, gRNAs conçus pour cibler le barbue sans frais/interleukine 1 gène du récepteur contenant du domaine adaptateur molécule (TICAM1) et la rhamnose binding lectine (RBL) gène étaient micro.

TICAM 1
Séquençage de l’ADN des vecteurs de colonies individuelles de produits PCR regroupées, clonés a révélé les indel mutations induites dans le gène TICAM 1. Le taux de mutation était de 79 % dans les 24 individus analysés. Exemples de mutations sont illustrés dans la Figure 4 et Figure 5. Effets d’indel mutations dans le gène TICAM1, codant la séquence de barbue sur la protéine longueur et séquence par rapport à la séquence de type sauvage sont illustrées dans le tableau 1. Mutations de délétion a entraîné le retrait de quelques-uns à plusieurs acides aminés de la protéine, conduisant à l’évolution de la trame de lecture en aval et clôturant prématurément translation (tableau 1).

Dans la plupart des cas, plus de 80 % de la séquence de la protéine a été tronquée en raison d’un codon stop prématuré. Dans ces cas, la longueur de polypeptide prédit varie de 91 à 106 résidus d’acides aminés (type sauvage TICAM 1 a 520 résidus d’acides aminés). Les mutations avec protéine tronquée extrêmement devraient produire une protéine non fonctionnelle. Dans le cas de la 87 bp suppression mutation (tableau 2, Figure 4), 29 acides aminés ont été retirés de la protéine sans changer le cadre de lecture. Les conséquences fonctionnelles de telles mutations doivent être évalués de façon expérimentale.

RBL
Séquençage de l’ADN des vecteurs de colonies individuelles de produits PCR regroupées, clonés ont confirmé la présence de mutations indel (Figure 6). Le taux de mutation était de 88 % chez les 40 individus analysés. Destructions variaient de 5 bp à 183 bp, tout en pouvant atteindre 20 bp ont été insérés. Fait intéressant, les suppressions de bp 183 complètement enlevé intron 1, bp exon 2 et 19 de l’intron 2. Théoriquement, cela devrait influer sur l’épissage du gène RBL, étant donné que les sites d’épissage ont été mutés.

Indel mutations ont des effets variables sur la séquence de la protéine prédite par rapport à la séquence de protéine de type sauvage (308 résidus d’acides aminés) (tableau 2). Plus de 70 % des indels a résulté en une protéine tronquée prévue qui est de 10 % ou inférieure à la longueur de la protéine de type sauvage. Dans certains indels (numéro 4, 5 et 6 de la mutation), le polypeptide prédit était moins de 10 acides aminés. Seulement 2 causes (numéro 2 et 3) ont abouti à la suppression de 2 à 4 acides aminés dans la protéine sans modifier la trame de lecture qui peut ou peut ne pas affecter la fonction de protéine.

Mutations bi-alléliques ont été induites avec deux autres gRNAs (Erevlys et al., inédit) où les deux chromosomes ont été mutés dans des embryons et aucun allèles de type sauvage ont été détectés. Avec l’électrophorèse sur gel des produits PCR, ces embryons n'ont qu’une bande qui était plus courte que la bande de type sauvage (suppression de plus de 200 bp). Séquençage de l’ADN des produits PCR clonés ont confirmé la présence d’un seul allèle de mutant dans tous les vecteurs séquencée d’un embryon (mutations bialléliques homozygotes) alors que deux allèles mutants ont eu lieu dans les autres embryons (mutations bialléliques hétérozygotes). Dans certains autres embryons qui ont été mosaïque pour la mutation, mutant (jusqu'à 4 allèles) tant les allèles de type sauvage ont été détectés par séquençage de l’ADN des produits PCR clonés.

Figure 1
Figure 1 : Un résumé des procédures microinjection pour unicellulaire barbue (Ictalurus punctatus) embryons avec protéine gRNA/Cas9 pour assommer de gène de molécule (TICAM1) adaptateur contenant du domaine du récepteur toll/interleukine 1 et rhamnose gène de Binding lectine (RBL). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Testicules et œufs de barbue, Ictalurus punctatus . (A) bien développé des testicules des mâles de la barbue de rivière sont blancs avec plusieurs projections villiformes. (B) les bons œufs de femelles de la barbue de rivière soient jaune d’or en couleur avec très peu ou aucune formation de caillots sanguins. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Micro aiguille tirant, chargement et microinjection de barbue unicellulaire, Ictalurus punctatus , embryons. (A) l’aiguille en tirant avec un extracteur vertical de l’aiguille. Structure de l’aiguille et le diamètre sont affectés par la chaleur du filament de chauffage et de la force de solénoïde. (B) micro aiguille de chargement avec le mélange CRISPR/Cas9 à l’aide d’une pointe de microloader. (C) disposition des embryons de la barbue de rivière dans une boîte de Pétri 100 mm contenant une solution de Holtfreter. Micro aiguille est abaissée jusqu'à ce qu’il touche et perce le œuf. (D) amplifié section du panneau C montrant le processus de perçage de le œuf. Remarque la pointe de l’aiguille est la membrane chorionique en poussant vers l’intérieur, mais ne le n'a pas encore pénétré. Embryons injectés ont le matériel d’injection rouge à l’intérieur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : CRISPR/Cas9 induite par péage/interleukine 1 récepteur contenant du domaine adaptateur molécule (TICAM1) gène codant la séquence de la barbue de rivière, Ictalurus punctatus . Séquence bleue représente le motif adjacent de protospacer (PAM) alors que la séquence verte représente la cible pour gRNA. Cassure à double brin induite par la protéine Cas9 devait se produire sur le site des 2 triangles rouges. Des mutations sont numérotées 1 à 8. Mutations de délétion sont représentées par une ligne en pointillés dans lequel chaque tiret correspond à un nucléotide qui a été supprimé. Séquences de rouge sont insertions tandis que violet représente la mutation de substitution. Fractions de 78 représentent le nombre d’allèles mutés dans 78 séquençage réactions (par exemple, 3/78 signifie qu’un allèle a été détecté dans 3 réactions de séquençage d’un total de 78 réactions). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Indel mutations chez la barbue de rivière, Ictalurus punctatus , péage/interleukine 1 gène du récepteur contenant du domaine adaptateur molécule (TICAM1) séquence codante induite par microinjection de protéine gRNA/Cas9 dans des embryons d’unicellulaire barbue telle que révélée par le chromatogramme de séquençage ADN. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : CRISPR/Cas9 a provoqué des mutations dans le gène de rhamnose binding lectine (RBL) de barbue, Ictalurus punctatus . Silenceur séquences sont en majuscules, tandis qu’intronic séquences sont minuscules. Séquence bleue représente le motif adjacent de protospacer (PAM) alors que la séquence verte représente la cible pour gRNA. Une pause de double brin induite par Cas9 protéine devait se produire sur le site des 2 triangles rouges. Les mutations sont assignées des chiffres 1 à 9. Mutations de délétion sont représentées par une ligne en pointillés dans lequel chaque tiret correspond à un nucléotide qui a été supprimé. Séquences de rouge sont des insertions. Fractions de 40 représentent le nombre d’allèles mutés dans 40 séquençage réactions par exemple 2/40 signifie qu’un allèle a été détecté dans les 2 réactions de séquençage sur un total de 40 réactions. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Mutation Insertion Suppression Variation nette (Δ) Longueur de protéines (acides aminés) Déphasage changé Codon stop prématuré Séquence de la protéine
WT 0 0 0 520 N° N° MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTSCSSYSLEISVST
ATTNNSNKESRPLPLKTPPESRDGQNHEAKPSS
PLVDHKPFYSVTKSYKSSDPTPLQERAQLEKFKF
RQYPDKHDTSEIVTPKSPNIESGLEKTFLSIPSGG
GKVGAQPVSTSKPPEASSTQEVGKHDSFSTEKQ
ASQEEEDMFYAFVILHAEEDSEEAVRLKSRLESIS
STIGATFSEDFAVPGQSTFRSVEDAIENSAYVMLL
LTPNFNTHLNETNADSALMNSIEKPHKHNTVIPL
LPRANGLTRNQMPFILRTKNPLVETRDRDTFEKM
AKKVLDLRNIQRQKSMWTEAQLVKKQREKQQW
LQEKKRYCKDFIQESPRVRELEEQIQQLKMQQQ
HLQPPYAQQTNSHQGFPGRPQSSGPMPFRSPS
PMPSYYSGNMWPQLPSNIHIQNAKCIMIGNNSTM
TVGGGVDSGDEDNF
(GenBank : NP_001187154.1
1 0 5 -5 104 Oui Oui MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTFVQLLQPRNQRIHS
HNQ
2 5 40 -35 94 Oui Oui MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSIS
GSRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAF
KVQKEPPKRDDSYPSSLRSTSNKSHNQ
3 0 87 -87 491 N° Oui MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSKTPPESRDGQNHE
AKPSSPLVDHKPFYSVTKSYKSSDPTPLQERAQ
LEKFKFRQYPDKHDTSEIVTPKSPNIESGLEKTFL
SIPSGGGKVGAQPVSTSKPPEASSTQEVGKHDSF
STEKQASQEEEDMFYAFVILHAEEDSEEAVRLKS
RLESISSTIGATFSEDFAVPGQSTFRSVEDAIENSA
YVMLLLTPNFNTHLNETNADSALMNSIEKPHKHN
TVIPLLPRANGLTRNQMPFILRTKNPLVETRDRDT
FEKMAKKVLDLRNIQRQKSMWTEAQLVKKQREK
QQWLQEKKRYCKDFIQESPRVRELEEQIQQLKMQ
QQHLQPPYAQQTNSHQGFPGRPQSSGPMPFRSP
SPMPSYYSGNMWPQLPSNIHIQNAKCIMIGNNST
MTVGGGVDSGDEDNF
4 3 131 -128 95 Oui Oui MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSRAFKSPG
5 1 0 1 106 Oui Oui MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSIFVQLLQPRNQRIH
SHNQ
6 1 0 1 106 Oui Oui MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTFVQLLQPRNQRIH
SHNQ
7 14 0 14 30R Oui Oui MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSRSTPPPRAAPTA
8 35 9 26 91 Oui Oui MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTQV

Tableau 1 : Effets d’indel mutations du péage/interleukine 1 récepteur contenant du domaine adaptateur molécule (TICAM1) gène codant la séquence de la barbue de rivière, Ictalurus punctatus, sur prédit longueur de protéines (acides aminés) et séquence par rapport à l’état sauvage tapez la séquence (WT).

Mutation Insertion Suppression Variation nette (Δ) Longueur de protéines (acides aminés) Déphasage changé Codon stop prématuré Séquence de la protéine
WT 0 0 0 308 N° N° MMLFLKLSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQR
LTCETGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFT
NCALRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFG
TYKYYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSIE
IINANYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNTL
SIVAAMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYLT
VSYICTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGRT
DSTTCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARCE
EQSSCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
(GenBank : AHJ14694.1) 53
1 0 5 -5 29 Oui Oui MMLFLKPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
2 0 6 -6 306 N° N° MMLFLSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQRLT
CETGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFTN
CALRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFG
TYKYYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSI
EIINANYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNT
LSIVAAMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYL
TVSYICTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGR
TDSTTCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARC
EEQSSCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
3 0 12 -12 304 N° N° MILSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQRLTCE
TGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFTNCA
LRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFGTYK
YYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSIEIINA
NYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNTLSIVA
AMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYLTVSYI
CTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGRTDST
TCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARCEEQS
SCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
4 0 16 -16 6 Oui Oui MMLFLN
5 0 183 -183 8 N° Oui MMLFLKRI (en supposant que l’épissage n’est pas altérée)
6 1 183 -182 5 Oui Oui MMLFL (en supposant que l’épissage n’est pas altérée)
7 1 0 1 31 Oui Oui MMLFLKTQPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
8 1 0 1 31 Oui Oui MMLFLKSQPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
9 20 0 20 18 Oui Oui MMLFLKASSHISSSASSP

Tableau 2 : Effets de mutations indel dans le rhamnose lie gène lectine (RBL) de la barbue de rivière, Ictalurus punctatus, prédit longueur de protéines (acides aminés) et séquence par rapport à la séquence de type sauvage (WT).

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Discussion

Un protocole détaillé pour microinjection d’embryons de barbue d’atteindre knock-out du gène a été présenté. Injection de la protéine CRISPR/Cas9 dans le jaune d’oeuf est beaucoup plus simple, fait gagner du temps et ne nécessite pas de formation approfondie par rapport à microinjecting le blastodisc de l’embryon unicellulaire, qui est la technique courante pour la plupart de transfert de gène et gène édition avec poisson 30 , 42. le protocole actuel s’est avérée fructueuse dans l’induction des indels chez la barbue gènes TICAM 1 et RBL. Ces procédures fiables et efficaces, les fondements permettant de générer des débouchures future gène chez la barbue. Le protocole peut être modifié pour cibler d’autres gènes dans le génome de barbue en utilisant le système CRISPR/Cas9, ou pour l’adaptation des autres technologies de gène de poisson-chat, tels que tol2 médiée par transgénèse. Il est également intéressant l’évaluation chez d’autres espèces de poissons-chats tels que le poisson-chat bleu (I. furcatus), qui sont commercialement importantes et leurs oeufs semblent être plus sensibles à la manipulation que les oeufs de la barbue de rivière. Toutefois, si d’autres gRNAs ou substances biologiquement actives telles que l’ADN ou les ARNm sont à doser, le protocole devrez être optimisées afin de déterminer les meilleures conditions.

Dans les protocoles de microinjection des embryons de poisson, procédures de microinjection pourraient être divisées en deux grandes catégories : injection dans les cellules embryonnaires et injection dans le jaune. Chez le médaka, les morpholinos ont été injectées dans le cytoplasme des embryons unicellulaire d’étudier différents processus morphogénétiques in vivo41. Chez la barbue, ARNm CRISPR/Cas9 ciblant le gène de la GnRH ont été microinjected dans la blastodisc des embryons unicellulaire30. À trois – épines épinoche (Gasterosteus aculeatus), blastomères étaient micro pour générer la transgénèse et gène débouchures42. En revanche, des embryons de poisson-zèbre unicellulaire étaient jaune-injecté avec morpholinos pour manipuler la protéine Heart of Glass (Heg), qui s’est avérée efficace43. Ces 2 types d’approches ont leurs avantages et leurs inconvénients, mais si les deux ont la même efficacité pour la même espèce, se révèlent microinjection de jaune d’oeuf d’embryons unicellulaire est préférable pour plusieurs raisons.

Microinjection de jaune d’oeuf est moins invasive pour les embryons, car les aiguilles de microinjection ne pas piquer les cellules embryonnaires. En outre, de nombreux embryons peuvent être injectés dans une courte période alors que les embryons sont encore au premier stade de cellules. Il n’y a aucune nécessité d’aligner les embryons dans une certaine position. Cela serait également gagner du temps et réduire le stress de la manipulation des embryons. En géniteurs selon les saisons, il y a un temps limité de frai dans lequel toutes les procédures doivent être faites pour atteindre knockout réussie. Chez la barbue, la période de frai dure environ 2 mois44. Par conséquent, élaboration d’un protocole de microinjection rapide et efficace permettra de microinjection de nombreux embryons pour cibler plusieurs gènes dans ce court laps de temps. Heureusement, barbue peut artificiellement pondus pour alimenter un assez grand nombre d’embryons pour la microinjection de surmonter la forte mortalité en raison de procédures de microinjection45. En outre, le moment de la fertilisation peut être contrôlé pour s’assurer que les embryons sont dans le stade unicellulaire lorsque nécessaire.

Microinjection de CRISPR/Cas9 induit indels chez les espèces de poissons différentes y compris le poisson-zèbre, saumon de l’Atlantique (Salmo salar L.), le tilapia du Nil (Oreochromis niloticus), barbue, Atlantique choquemort (Fundulus heteroclitus) 46et common carp5,30,46,47,48,49,50. En outre, le système CRISPR/Cas9 servait à perturber des gènes chez la carpe Labeo rohita via médiée par recombinaison homologue insertion d’ADN étranger dans les gènes ciblés51. Dans ce protocole, indels réussies sont induits dans les séquences codantes avec des effets dramatiques sur la séquence de la protéine, y compris les mutations de déphasage résultant dans le codon stop prématuré. Les effets phénotypiques de ces mutations doivent encore être étudiées. Tronqué ARNm est probablement dégradée par le non-sens mRNA decay (NMD) médié, entraînant la réduction ou l’inhibition de l’expression, et s’exprime, protéines tronquées sera probablement non fonctionnel52,53 .

Dans notre expérience avec le gène de la RBL, deux types de mutations (numéro 5 et 6) a abouti à la suppression de 183 bp en supprimant complètement la moitié de l’exon 1, intron 1, exon 2 et une partie de l’intron 2. Théoriquement, ce type de mutation peut-être altérer l’épissage de l’ARN pré-messager RBL. Des mutations dans les sites d’épissage inhibent la capacité du splicéosome à reconnaître l' exon54.

En conclusion, l’élaboration d’un protocole fiable et efficace pour le gène ciblé d’édition chez la barbue est cruciale pour l’étude génomique fonctionnelle, surtout après que les ressources génomiques ont été enrichies avec le séquençage récent de la barbue de rivière génome. Les procédures décrites ici sont simples, rapides, efficaces et sont reconnus pour réaliser avec succès le Knock-out du gène. Deux gènes, TICAM 1 et RBL, visent à démontrer l’efficacité du CRISPR/Cas9 knockout à l’aide de microinjection. Selon ce qui est injecté, le protocole peut être modifié afin d’inclure d’autres substances biologiquement actives. Il peut être également modifiée pour microinject les autres espèces de poisson-chat ou autres espèces de poissons qui ont la composition et la structure d’oeuf semblable. Ce protocole de jeter les bases de knock-out du gène chez la barbue.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par prix USDA-NIFA 2015-67015-23488 à Roger Cone. Les auteurs remercient Dr Ronald Phelps pour la description des critères de sélection des stocks géniteurs dans la vidéo. Ahmed Elaswad et Karim Khalil tiens à remercier la culture égyptienne et Educational Bureau à Washington DC pour financer leur recherche de doctorat.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reproboost implant Center of Marine Biotechnology Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females
TRICAINE-S Western Chemical. Inc. For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. 
Phenol red Sigma-Aldrich P0290 0.5%, sterile filtered
Stereo microscope Olympus 213709 For visualizing the eggs during microinjection
Microinjector ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MPPI-3 For the delivery of the injection material into the embryos
Micromanipulator ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MM33  For holding and controlling the movement of the injection needle. 
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956.003 For loading injection solution into microinjection needles.
Vertical needle puller David Kopf Instruments Model 720 For pulling microinjection needles
Cas9 protein PNA Bio Inc.  CP01 Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.
Expand High FidelityPLUS PCR System  Roche Diagnostics, USA For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation
Borosilicate glass capillaries Fisher Scientific 1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.
Petri dish VWR 25384-302 For holding the embryos during the microinjection.
Crisco The J.M. Smucker Company Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. 
Holtfreter`s solution Home Made 59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. 
Doxycycline hyclate USP (monohydrate) Letco Medical 690904 Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.

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Genetics numéro 131 CRISPR/Cas9 gène édition Knock-out du gène micro-injection embryons de barbue mutation tronqué de protéine indels
Microinjection de protéine CRISPR/Cas9 dans des embryons de barbue de rivière, <em>Ictalurus punctatus</em>, pour Gene Editing
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Elaswad, A., Khalil, K., Cline, D., Page-McCaw, P., Chen, W., Michel, M., Cone, R., Dunham, R. Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing. J. Vis. Exp. (131), e56275, doi:10.3791/56275 (2018).

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