Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Microinjection van CRISPR/Cas9 eiwit in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, embryo's voor Gene Editing

Published: January 20, 2018 doi: 10.3791/56275
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 4, 4, 5, 5, 1
1School of Fisheries, Aquaculture and Aquatic Sciences, Auburn University, 2Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine, Suez Canal University, 3Anatomy and Embryology Department, Faculty of Veterinary Medicine, Cairo University, 4Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 5Life Science Institute, University of Michigan
* These authors contributed equally

Summary

Een eenvoudige en efficiënte microinjection protocol voor het bewerken van het gen in channel catfish embryo's met behulp van de CRISPR/Cas9-systeem wordt gepresenteerd. In dit protocol, begeleiden RNAs en Cas9 eiwit in de dooier van één-cel embryo's waren microinjected. Dit protocol is gevalideerd door kloppen uit twee channel catfish immuun-gerelateerde genen.

Abstract

Het volledige genoom van de channel catfish, Ictalurus punctatus, heeft sequenced, wat leidt tot meer kansen voor de studie van channel catfish genfunctie. Gene knock-out is gebruikt voor het bestuderen van deze gene functies in vivo. De geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen/CRISPR geassocieerde eiwit 9 (CRISPR/Cas9) systeem is een krachtig hulpmiddel gebruikt voor het bewerken van genomic opeenvolgingen van DNA om te veranderen van de genfunctie. Terwijl de traditionele benadering is geweest om CRISPR/Cas9 mRNA in de eencellige embryo's door middel van microinjection, kan dit een langzaam en inefficiënt proces in meerval. Hier, wordt een gedetailleerd protocol voor microinjection van channel catfish embryo's met CRISPR/Cas9 eiwit beschreven. Kort, eieren en sperma werden verzameld en dan kunstmatige bevruchting uitgevoerd. Bevruchte eieren werden overgedragen aan een petrischaal met Holtfreter de oplossing. Geïnjecteerd volume was gekalibreerd en vervolgens begeleiden RNAs/Cas9 gericht op de tol/interleukine 1 receptor domein-bevattende adapter molecuul (TICAM 1) gen en rhamnose bindend lectine (RBL) gen werden microinjected in de dooier van één-cel embryo's. Het gen raakeffect was succesvol want microdeleties werden bevestigd door DNA sequentiebepaling. De voorspelde eiwit sequentie wijzigingen als gevolg van deze mutaties frameshift opgenomen en afgekapt eiwit vanwege voortijdige stop codonen.

Introduction

Microinjection is een gemeenschappelijk laboratorium techniek gebruikt voor het leveren van een kleine hoeveelheid van een stof zoals DNA, RNA, eiwitten en andere macromoleculen in cellen of embryo's via een glazen capillaire1. Microinjection wordt uitgevoerd met behulp van speciale apparatuur installatie met inbegrip van een microinjector, micromanipulator en een Microscoop2. De techniek is gebruikt door onderzoekers genetisch wijzigen vele organismen door middel van de generatie van transgenics, gene uitsparingen en gentherapie, met als doel inzicht in de dynamiek van intracellulaire componenten3,4 , 5.

De channel catfish (Ictalurus punctatus) is de meest populaire meerval soorten in de aquacultuur en recreatieve visserij-activiteiten in de Verenigde Staten. Er is een toenemende behoefte aan de studie van functionele genomica in channel catfish, en sequentiebepaling van het volledige genoom van channel catfish verbetert het nut van de recente vooruitgang in genoom editing tools6,7. Begrip van de genfunctie zou niet alleen het verrijken van het onderzoek dat wordt gevoerd op meerval, maar kan ook leiden tot meer effectieve genetische verbetering programma's ter verbetering van de meerval industrie. Als kritische genen voor een bepaalde eigenschap van belang worden geïdentificeerd, kunnen zij worden gebruikt genetisch meerval om productie te verbeteren door het genoom bewerken voor het genereren van positieve allelen, selectie voor deze allelen, het onderdrukken van de schadelijk allelen, overbrengen het gunstige allel via Transgenese, of een combinatie van deze opties. Combineren de beste genen voor verschillende commercieel gunstige eigenschappen van verschillende soorten in één vis zou de productiviteit en winstgevendheid van vis productie operaties8, aanzienlijk verbeteren.

Gene knock-out is een directe methode om te studeren gene functies in vivo. Mutaties op DNA niveau zal worden overgenomen door toekomstige generaties die de studie van hun effecten in verschillende generaties zal vergemakkelijken. Verschillende genoom bewerkingshulpmiddelen zijn ontwikkelde inclusief zink vinger nucleasen (ZFNs), transcriptie activator-achtige effector nucleasen (TALENs), en geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen/CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (CRISPR/Cas9 ) systeem9,10,11,12.

Het systeem van CRISPR/Cas9 is een krachtige en efficiënte tool die is gebruikt voor het bewerken van genomic DNA-sequenties, met inbegrip van gene knock-out in vis door RNA-geleide site-specific DNA decollete5,13. Het systeem bestaat uit een gids-RNA (gRNA), die de gerichte volgorde in het genoom en een DNA endonuclease enzym, Cas9 bepaalt. De CRISPR/Cas9-systeem kan worden ontworpen om het richten van een willekeurige tekenreeks in het genoom met verschillende voordelen ten opzichte van ZFNs en TALENs: (1) lager kosten (2) gemakkelijker engineering (3) meer specifieke binding van RNA gids in de reeks van de doelgroep, en verminderd af-target mutaties (4) meerdere reeksen kunnen worden gericht met verschillende gRNA hetzelfde tempo tijd (5) hoge mutagenese in genen die kon niet worden gemuteerd door TALENs, en (6) verbeterde germline transmissiesnelheid van mutaties voor tot 6-fold in vergelijking met ZFNs en TALENs14, 15,16,17,18.

De belangrijkste alternatieve methode voor microinjection is electroporation, waarin elektrische impulsen worden toegepast op embryo's of cellen membraan permeabiliteit en de opname van biologische moleculen19,20te verhogen. Verschillende transgene vis waren gegenereerd met behulp van electroporation zoals medaka (Oryzias latipes), zebravissen (Danio rerio), chinook zalm (Oncorhynchus tshawytscha), channel catfish, zeebrasem (Sparus sarba), en gemeenschappelijke carp (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.

Electroporation is gebruikt voor het leveren van de plasmide DNA, RNA en Cas9 eiwitten voor gene knock-out. In de cellen van zoogdieren, Cas9/gRNA plasmide DNA, Cas9 mRNA/gRNA, en Cas9 eiwit/gRNA complexen werden geleverd met behulp van electroporation en de mutagenese tarieven waren hoogste met behulp van Cas9 eiwit/gRNA complexen voor meeste electroporation voorwaarden getest27. TALENs uiten constructies werden in de ascidian chordate (Ciona intestinalis), electroporated in bevruchte eieren voor het opwekken van knockout van meerdere genen28. ZFNs uiten plasmide constructies waren electroporated om knock-out luteïniserend hormoon in channel catfish29. Echter zodra ingevoerd in de cel, plasmide constructies zal moeten worden herschreven als RNA en vertaald naar functionele eiwitten voordat ze kunnen richten op de gewenste opeenvolging van DNA, die zou waarschijnlijk het vertragen van de tijd van de mutagenese ten opzichte van microinjection van RNA / eiwit. Als een embryo ontwikkelt zich, stijgt vertraagde mutagenese de mozaïcisme van ingespoten oprichters. Transgene expressie is daarnaast onwaarschijnlijk om de expressie niveau mogelijk met microinjection, verlagen de mutagenese efficiëntie te bereiken.

Als een middel voor de invoering van genoom bewerkingsgereedschappen in cellen, heeft microinjection diverse voordelen ten opzichte van electroporation. Genoom bewerken van moleculen kan betrouwbaar worden ingevoerd in cellen of embryo's door middel van microinjection30. Minder materiaal injectie nodig is. Het is gemakkelijk om te bepalen van de hoeveelheid materiaal geïnjecteerd. Hogere mutatie tarieven met lage mozaïcisme in de oprichter vis kunnen worden bereikt die germline transmissie van mutaties op F1zou verbeteren. Minder oprichter vis moet worden geanalyseerd om te produceren van de eerste generatie, als gevolg van het hogere tarief van de mutatie. Electroporation moeten meer oprichter vis worden geanalyseerd die kosten zal verhogen. Het voortbestaan van channel catfish microinjected embryo's is echter lager dan electroporated ones, hoewel dit kan worden overwonnen door het injecteren van meer embryo's31,32. In channel catfish, voortbestaan van embryo's varieerden van 16 tot 55%, afhankelijk van de genen gericht dooier-microinjected en de dosering van gRNA/Cas9 eiwit32.

Regelmatige microinjection van meerval embryo's is technisch veeleisend en tijdrovend, een snelle en efficiënte CRISPR/Cas9 eiwit protocollen protocol wordt echter gepresenteerd voor channel catfish embryo's. Dit protocol vereist minder tijd en deskundigheid, aangezien de CRISPR/Cas9 eiwit oplossing wordt geïnjecteerd in de dooier van één cel embryo's. Honderden bevruchte eieren kunnen worden geïnjecteerd in 1 h (ongeveer de tijd die nodig is voor de eerste celdeling te voorkomen). Voor het valideren van het protocol, werden twee ziekte gevoeligheid-gerelateerde genen gevloerd in channel catfish, de tol/interleukine 1 receptor domein-bevattende adapter molecuul (TICAM1) gen en het rhamnose bindend lectine (RBL) gen. TICAM 1 is betrokken bij de signalering traject gestart door toll-like receptor (TLR) 3. In channel catfish was TICAM 1 dramatisch upregulated na bacteriële challenge met Edwardsiella ictaluri, terwijl het was werden in blue catfish, een tot en met E. ictaluri33resistente soorten. RBL speelt een belangrijke rol in de vroege infectie met Flavobacterium columnare, de verwekker van de ziekte van de columnaris, waar acute en robuuste opregulatie werd opgenomen in een columnaris-gevoelige channel catfish stam in vergelijking met een columnaris-resistente stam34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dit experiment werd uitgevoerd op de vis Genetics Research Unit, E. W. Shell Fisheries Research Center, Auburn University, AL. Alle experimentele protocollen die worden gebruikt in dit experiment werden goedgekeurd door de Auburn University institutionele Animal Care en gebruik Comité (AU-IACUC), voordat het experiment werd gestart. Een lijst van de apparatuur en benodigdheden gebruikt in dit experiment kan worden gevonden in de tabel van de materialen. De volgende zijn de stappen en procedures voor de voorbereiding en microinjection van kanaal meerval one-cel embryo's zoals geïllustreerd in Figuur 1.

1. broeden Stock selectie en kuitschieten

  1. Kies gezond channel catfish brood voorraad uit de stam of de genetische lijn van belang. Channel catfish mannetjes en vrouwtjes moeten goede secundaire geslachtskenmerken vertonen.
  2. Mannetjes hebben een brede gespierde hoofd dat breder is dan de rest van hun lichaam met goed ontwikkelde genitale papil selecteren Donkere kleur, littekens en wonden van territoriale vechten zijn ook tekenen van seksuele bereidheid. Selecteer vrouwtjes hebben hoofden die smaller dan de rest van hun lichaam zijn en hebben zachte, voelbaar, goed-rond gemaakte buik. Voor nauwkeurigheid en te vermijden benadrukt de vis tijdens de initiële behandeling, stop voederen de vrouwtjes 2-3 dagen alvorens hun bereidheid voor het kuitschieten.
  3. Vis verwerking snel, maar zorgvuldig uit te voeren. Verklein behandeling stress en uitvoeren van alle procedures waarvoor behandeling vrouwtjes terwijl vis in de paaitijd zakken (32 mm grootte mesh).
  4. Meten net voor hormoon injectie voor het opwekken van de eisprong, het lichaamsgewicht van de vrouwtjes.
  5. Hang de paaitijd zakken met vrouwtjes binnen in een stroom door een tank met een continue waterstroming en voldoende beluchting.
  6. Aseptisch, laden de implanter die heeft een 14 G naald met 85 µg/kg luteïniserend hormoon releasing hormoon analoge (LHRHa) prothese. Spoel de injectieplaats (dorsale spieren) met steriele zoutoplossing 0,9% vóór de injectie. Plaats de implanter in een hoek van 45° en vrijgeven van het implantaat. Trekken de naald en swipe de injectieplaats met een katoenen bal eerder gedrenkt in 70% ethanol.
  7. Plaats de paaitijd tas in de holdingstank zodat de vis wordt volledig ondergedompeld in water 15-20 cm onder het wateroppervlak. Voldoende beluchting (boven 5 ppm opgeloste zuurstof) en goede waterkwaliteit zijn belangrijk voor de ovulatie van hoge kwaliteit eieren.
  8. De tijd van de ovulatie op basis van de temperatuur van het water met behulp van de graad-uur (h) relatie35voorspellen. Mate-h responstijd = tijd tussen inspuiting van het hormoon en ovulatie (h) * watertemperaturen (° C). Bijvoorbeeld, voor een graad-h responstijd van 900-1000, een vrouw naar verwachting paaien 36-40 uur uit hormoon injectie tijd bij 25 ° C. Meestal gebeurt de eerste controle voor eieren ongeveer 36 uur na inspuiting van het hormoon en vervolgens 4 uur tussenpoos.
  9. Om te controleren voor de ovulatie, til voorzichtig de paaitijd zak boven het wateroppervlak terwijl u zoekt op de eieren die zijn aangesloten in de paaitijd zak. Het zien van ten minste 10 eieren geeft aan deze vrouw eisprong en klaar voor het strippen van de hand.

2. zaadcellen voorbereiding

Opmerking: Sperma kan bereid worden een paar uur voor de verwachte eisprong.

  1. Euthanaseren mannetjes door een percussieve klap op het hoofd zonder verdoving, omdat de verdoving kan een negatief effect hebben op de beweeglijkheid van de zaadcellen.
  2. Verzamelen van de teelballen in een pannetje wegende verwijderen elk weefsel en wassen met 50 mL van 0,9% zout te verwijderen van bloed, indien nodig. Goed ontwikkelde teelballen zijn wit met vele villiform projecties ( Figuur 2).
  3. Het bepalen van het gewicht van de teelballen.
  4. Ter voorbereiding van het sperma-oplossing van ei bevruchting, overdracht van de teelballen naar het midden van een 100 cm2 100 µm gaas met pincet. Vouw het gaas met de testes binnen, crush de teelballen en filtreer het sperma in een tube van 50 mL collectie. Dit kan gebeuren door het toepassen van druk op de testes binnen het net tegen de rand van de buis van de collectie via de duim. Gebruik de zoutoplossing 0,9% te wassen van het sperma van de mazen in de buis van de collectie. Zoutoplossing kan tot 10 mL/g van teelballen worden toegevoegd.
  5. Bepaal de concentratie van de zaadcellen, de beweeglijkheid en de levensvatbaarheid controleren.
    Opmerking: Concentratie kan worden bepaald door het tellen van de zaadcellen in een bekende hoeveelheid verdunde milt met behulp van een hemocytometer. Als alternatief, de dichtheid van sperma kan worden geraamd door de beoordeling van de extinctie van de milt met behulp van een spectrofotometer. Bij deze methode wordt de absorptie bij 505 nm golflengte vergeleken met een besturingselement grafiek die eerder is opgesteld voor de absorptie van verschillende concentraties van sperma36. De beweeglijkheid van sperma kan onder de Microscoop worden gecontroleerd als het moment van activering van de zaadcellen tot stopzetting van sperma beweging (genaamd motiliteit duur)37. De levensvatbaarheid van sperma kan worden bepaald door de kleuring van het sperma met selectieve kleurstoffen zoals trypan blauw, die alleen niet-levensvatbare zaadcellen, vlekken zal terwijl levensvatbare zaadcellen onbevlekt zal blijven. Voor deze procedures van microinjection is dit echter niet nodig als de teelballen zijn goed ontwikkeld.
  6. Opslaan van sperma in een 0,9% zoutoplossing uit stap 2.5 bij 4 ° C en gebruiken binnen de 24u na bereiding.

3. ei collectie en bevruchting

  1. Toepassing van een zeer dun laagje plantaardige verkorting met een schone, droge kuitschieten pan diameter van 20 cm.
  2. Plaats het vrouwtje in de verdoving oplossing met 100 ppm van gebufferde tricaïne methaan sulfonaat met natriumbicarbonaat (pH van definitieve oplossing moet 7.0) totdat de vis volledig narcose38 is.
    Let op: Tricaïne methaan sulfonaat mogelijk irriterend als geïnhaleerd, ingenomen of geabsorbeerd door de huid.
  3. Zorgvuldig, haal de vis uit de paaitijd zakje en dompel het in een 0,9% zoutoplossing te wassen van de verdoving oplossing. Droog de vis af volledig met behulp van een schone handdoek, het vermijden van de verwijdering van de laag slijm op het lichaamsoppervlak van de vis.
  4. Plantaardige verkorting toepassen in het gebied rond de vent, met inbegrip van de pelvic fins, om te voorkomen dat beslag op de eieren tijdens het strippen van de hand.
  5. Hand strip de eieren in de ingevette paai pan door een zachte druk uit te oefenen op de eierstokken. Goede eieren verkeer, goudgeel van kleur, en met een minimale of geen klontjes of bloedstolsels (Figuur 2). Vermijd contact tussen de eieren en water vóór bevruchting, zoals water micropyle sluiting kan stimuleren.
  6. Om te bevruchten de eieren voor microinjection, door 200-300 eieren te overbrengen in een ingevette paai pan. Ingevet plastic plant etiketten kunnen worden gebruikt als een lepel overbrengen van eieren naar de ingevette paai pan. Voeg 1-2 mL van de oplossing van de zaadcellen (uit stap 2.5) op de eieren en meng voorzichtig. De verhouding van sperma aan egg moet ongeveer 11.000 sperma/ei.
  7. Zoetwater op de eieren te activeren van het sperma en de eieren toevoegen. Voeg genoeg water om licht de eieren. Swirl zachtjes de eieren voor 30 s. bevruchting in 1 – 2 min plaatsvinden moet. Het is belangrijk om te bevruchten eieren die zijn gerangschikt in een enkele laag. Meerval eieren voldoen aan elkaar waardoor het moeilijk te microinject van meerdere lagen van embryo's.
  8. Voeg meer zoet water op de bevruchte eieren en laat de eieren om te harden voor 10-15 min.
  9. Dekking van de paaitijd pan de resterende onbevruchte eieren bevattende een natte handdoek om te voorkomen dat het drogen en bemesten over een paar uur. Bemesting kan worden gedaan op een gefaseerde wijze, bijvoorbeeld, een partij van 200-300 eieren kunnen worden bevrucht elke 30-60 min om te zorgen voor een continue aanvoer van embryo's in het stadium van één cel voor microinjection en controle niet-ingespoten embryo's. Vermijd contact tussen de natte handdoek en de eieren als de eieren kunnen houden aan de natte handdoek waardoor het moeilijk is om ze te verwijderen. In dit protocol, eieren bevrucht binnen 2-3 uur na het strippen werden efficiënt microinjected en had soortgelijk succes als eieren bevrucht onmiddellijk na het strippen.

4. de naald trekken en laden

  1. Trek een 1,0 mm OD borosilicaatglas capillaire in 2 naalden (Figuur 3). Bewaar de naalden in een doos papier met een stukje spons waarin verscheidene insnijdingen zijn aangebracht. Te voorkomen dat het breken van de naald, moet de diameter van de spons kleiner is dan de lengte van de stengel van de naald.
  2. Open de tip van de naald door het breken van een klein stukje van de naald de dunste regio met behulp van een scherp voorwerp. Ook het openen van de naald door knijpen uit de dunste regio van het uiteinde met een tang onder de Microscoop.
  3. Bereid de injectie-oplossing door het mengen van gRNA(s) met Cas9 eiwit. Andere typen RNA of eiwit kunnen ook worden geïnjecteerd met dezelfde procedure. In dit protocol, waren de gRNAs ontworpen aan doel twee van de channel catfish immuun verwante genen, tol/interleukine 1 receptor domein-bevattende adapter molecuul (TICAM1) gen en rhamnose bindend lectine (RBL) gen en voorbereid volgens Shah et al.. met het gebruik van een high-fidelity Taq polymerase32,39. De genomische doelstellingen inzake gRNAs waren 5' GGA GGT GAA GCA CGT CGA GGA 3' voor TICAM 1 gen (Figuur 4) en 5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' voor exon 1 van RBL gen met protospacer aangrenzende motief (PAM) volgnummer onderstreepte (Figuur 6).
    1. BLAST gids RNA doelstellingen tegen het genoom channel catfish volgnummer en selecteer degenen met geen potentiële af-target sites.
    2. Fenol rood aan kleur de gRNA/Cas9-eiwit mengen tot een derde van het totale volume toevoegen.
    3. De uiteindelijke concentratie van gRNA/Cas9 eiwit mix met nuclease gratis water zodanig aanpassen dat elk embryo wordt geïnjecteerd met 50 nL met ongeveer 2,5 ng gRNA en 7.5 ng Cas9 eiwit. Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten op ijs vóór gebruik.
  4. Met een microloader, 5-10 µL van het mengsel van gRNA/Cas9 in laadt de injectie naald door het invoegen van de microloader in de naald stengel en uitzetting van het mengsel langzaam terwijl het intrekken van de microloader tip (Figuur 3). Voorkom overvulling luchtbellen binnen.
  5. De naald hechten aan de houder van de micropipet en zorgen voor een strakke verbinding, en vervolgens de houder aan de micromanipulator koppelen. Vrije stabiele verkeer te waarborgen. Oefen druk uit voor microinjection door de stikstof cilinder openen en de drukregelaar aan te passen.
    Opmerking: Het volume van injectie kan beïnvloed worden door de druk, de diameter van het diafragma van de naald en de duur van injectie. Om het volume aan injecteren injecteren een druppel van minerale olie op een hemocytometer geplaatst. Indien nodig, kan de druk, de duur van de injectie en de diameter van de naald worden aangepast verhoogt of verlaagt het volume van de injectie. Meerdere keren te injecteren in de minerale olieresten consistent volume wordt gewaarborgd.

5. microinjection van Catfish embryo 's

  1. Breng een zeer dunne laag van plantaardige verkorting aan een schone petrischaal van 100 mm.
  2. Met behulp van een ingevet plastic plant-label, 50 – 100 eieren uit de bevruchting pan overbrengen in de petrischaal en bestrijk ze met de Holtfreter van oplossing (materialen tabel). Hiermee lijnt u de eieren tegen elkaar opnemen in een enkele laag. Deze afstemming moet de eieren op zijn plaats houden tijdens het proces van microinjection.
  3. Plaats de petrischaal met de eieren in het werkgebied van de Microscoop en houd met een hand. Verlaag de naald met de andere hand (Figuur 3) totdat het doorboort het chorion en de dooier in één vloeiende beweging. De tip van de naald moet zo dicht mogelijk bij de blastodiscus voor het leveren van het materiaal van de injectie.
    1. Druk op de pedaal te leveren van het materiaal van de injectie in de dooier. Als de blastodiscus niet duidelijk zichtbaar is, kan dan de injectie-materiaal in verschillende locaties in de dooier worden gespreid. Om dat te doen, de naald wordt ingevoegd aan het einde van de dooier en het pedaal deprimerend of intrekking van de naald tegelijkertijd worden gedaan om het verspreiden van het materiaal van de injectie door de verschillende gebieden van de dooier. Tot 50 nanoliters kan worden geïnjecteerd in de dooier van channel catfish embryo's, echter, de hoeveelheid gRNA/Cas9 eiwit moet worden geoptimaliseerd voor elk gen te bereiken de beste resultaten voor mutatie tarief en embryo overleving32.
  4. Intrekken van de naald soepel om niet te beschadigen het ei. Verplaats de petrischaal te injecteren een ander ei met dezelfde procedure. Vermijd beweging van de petrischaal tijdens de injectie proces zoals dit kan het ei beschadigen of breken van de naald. Verwijderen van eieren die zijn gescheurd of beschadigd als gevolg van microinjection. Injectie kan worden gestart op 15 – 20 minuten na de bevruchting en blijven zolang de embryo's zijn nog in het stadium van één cel (tot ongeveer 60-90 minuten na de bevruchting).
  5. Plaats ingespoten embryo's terug in de Holtfreter oplossing met 10 ppm van doxycycline en continu zachte beluchting voor 6-7 dagen tot40broedeieren. De oplossing dagelijks veranderen en verwijderen van dode embryo's.

6. mutatie detectie

  1. Willekeurig, verzamelen van verschillende ingespoten embryo's op 72 h post bevruchting, verwijder de dooier en uittreksel genomic DNA. 3 – 5 niet-ingespoten embryo's als een besturingselement bevatten.
    Opmerking: Genomic DNA kan worden geëxtraheerd uit embryo's na verwijdering van eierschalen en dooier materiaal via proteïnase K spijsvertering en ethanol neerslag32.
  2. Een DNA-segment flankerend de genomic doelstellingen voor gRNA van elk gen, waar mutaties naar verwachting optreden, met behulp van een high-fidelity Taq polymerase32versterken. Voor TICAM 1, de inleidingen 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG 3' (in voorwaartse richting) en 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (omgekeerde) werden gebruikt voor het versterken van een 750 bp terwijl voor RBL, de inleidingen 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3' (in voorwaartse richting) en 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (omgekeerde) werden gebruikt om versterken een 375 bp segment van het RBL-gen.
    1. Gebruik de volgende PCR reactie: maximaal 20 µL PCR rang water; 1 x HiFi Taq enzym reactie buffer met MgCl2, 0,2 mM dNTP mix, 0.4 µM voor elk van de voorwaartse en omgekeerde primer van dezelfde set, 100-300 ng genomic DNA en 1,25 eenheden van high-fidelity Taq enzyme blend. Uitvoeren van PCR fietsen voorwaarden: eerste denaturatie bij 94 ° C gedurende 3 minuten; 35 cycli van denaturatie bij 94 ° C voor 30 s, gloeien bij 60 ° C gedurende 55 s voor TICAM, en 40 s voor RBL, uitbreiding bij 72 ° C gedurende 1 min/kb; en laatste uitbreiding bij 72 ° C gedurende 10 minuten.
  3. Detecteren van de mutant embryo met een mutatie detectiemethode, zoals de sequencing van gezuiverde PCR producten, landmeter mutatie detectie assay, heteroduplex mobility assay, verlies van restrictie-enzym erkenning site, of een andere mutatie detectiemethode die is geschikt voor het doel. Detecteren mutant embryo's met behulp van landmeter mutatie detectie assay voor TICAM 1 en verlies van restrictie-enzym die SAPI site gesneden evenals rangschikken van gezuiverde PCR producten voor RBL gene in dit protocol.
  4. Voor de identificatie van mutant allelen zijn klonen PCR producten en volgorde vectoren uit afzonderlijke kolonies. De mutant allelen gepresenteerd in Figuur 4 en Figuur 6 kwam uit ingespoten embryo's. PCR producten van zes microinjected en 3 controle embryo's voor elk gen werden gebundeld in twee afzonderlijke buizen, één voor microinjected embryo's en de andere voor controle embryo's, snel gekloond en 86 vectoren voor TICAM 1 en 48 vectoren voor RBL gene sequenced, waarvan 8 reacties van 3 controle niet-ingespoten embryo's voor elk gen sequencing.
  5. Vergelijk de sequenties van mutant embryo's in het wild type reeks hulpprogramma elke DNA sequentie uitlijning zoals BLAST of T-COFFEE voor de identificatie van verschillende mutant allelen zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om aan te tonen van de efficiëntie van het protocol van microinjection, werden ontworpen om te richten van de channel catfish tol/interleukine 1 receptor domein-bevattende adapter molecuul (TICAM1) gen en rhamnose bindend lectine (RBL) gen gRNAs microinjected.

TICAM 1
DNA sequencing van vectoren uit afzonderlijke kolonies van samengevoegd, gekloonde PCR producten bleek de indel mutaties, geïnduceerde in TICAM 1 gen. De mutaties was 79% in de 24 personen geanalyseerd. Voorbeelden van mutaties worden geïllustreerd in Figuur 4 en Figuur 5. Effecten van indel mutaties in het TICAM1-gen dat codeert opeenvolging van channel catfish op de voorspelde eiwit lengte en volgorde ten opzichte van de wilde typen volgorde worden weergegeven in tabel 1. Schrapping mutaties resulteerde in de verwijdering van een paar verschillende aminozuren uit de voorspelde eiwitten, wat leidt tot de stroomafwaartse leesraam wijzigen en voortijdig beëindigen vertaling (tabel 1).

In de meeste gevallen was meer dan 80% van de voorspelde eiwit sequentie als gevolg van een voortijdige stop codon afgekapt. In deze gevallen de lengte van de voorspelde polypeptide varieerden van 91 tot 106 aminozuurresidu's (wild type TICAM 1 heeft 520 aminozuurresidu's). Mutaties met uiterst afgeknotte eiwit wordt verwacht dat het produceren van een niet-functionele eiwit. In het geval van de 87 bp schrapping Mutatie (tabel 2, Figuur 4), werden 29 aminozuren verwijderd uit het eiwit zonder het leesraam. De functionele gevolgen van dergelijke mutaties moeten experimenteel worden geëvalueerd.

RBL
DNA sequencing van vectoren uit afzonderlijke kolonies van samengevoegd, gekloonde PCR producten bevestigd de aanwezigheid van indel mutaties (Figuur 6). De mutaties was 88% in de 40 personen geanalyseerd. Verwijderingen varieerden van 5 bp 183 bp, terwijl maximaal 20 bp zijn ingevoegd. Interessant is dat verwijderd de 183 bp verwijderingen volledig intron 1, exon 2, en 19 bp van intron 2. Theoretisch, moet dit beïnvloeden de splicing van het RBL-gen, aangezien de splice sites hebben is gemuteerd.

Indel mutaties variabele effect gehad op de voorspelde eiwit sequentie in vergelijking met de wild type eiwit sequentie (308 aminozuurresidu's) (tabel 2). Meer dan 70% van microdeleties heeft geleid tot een voorspelde afgeknotte eiwit dat is 10% of minder is dan de lengte van het wild type eiwit. In sommige microdeleties (Mutatie nummer 4, 5 en 6) was de voorspelde polypeptide minder dan 10 aminozuren. Slechts 2 gevallen (nummer 2 en 3) resulteerde in de verwijdering van 2 en 4 aminozuren in het voorspelde eiwit zonder het leesraam die al dan niet van invloed kan zijn op de eiwitfunctie.

Bi-allèlique mutaties werden geïnduceerde met twee andere gRNAs (Elaswad et al.., onuitgegeven) waar beide chromosomen werden gemuteerd in sommige embryo's en geen wild type allelen werden ontdekt. Met de Elektroforese van het gel van PCR producten had deze embryo's slechts één band die korter dan de wild type band (meer dan 200 bp schrapping was). DNA sequencing van gekloonde PCR producten bevestigd de aanwezigheid van slechts één mutant allel in alle vectoren sequenced van één embryo (homozygoot biallelic mutatie) terwijl twee mutant allelen in andere embryo's (heterozygoot biallelic mutatie opgetreden). In sommige andere embryo's die mozaïek voor de mutatie werden, werden zowel mutant (maximaal 4 allelen) en wild type allelen ontdekt door DNA sequentiebepaling van gekloonde PCR producten.

Figure 1
Figuur 1 : Een samenvatting van de microinjection procedures voor één-cel channel catfish (Ictalurus punctatus) embryo's met gRNA/Cas9 eiwit om knock-out tol/interleukine 1 receptor domein-bevattende adapter molecuul (TICAM1) gen en rhamnose bindend lectine (RBL) gen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Testes en eieren voor channel catfish, Ictalurus punctatus . (A) goed ontwikkelde teelballen van channel catfish mannetjes zijn wit met vele villiform projecties. (B) goede eieren van channel catfish koeien zijn gouden-geel van kleur met minimale of geen bloedstolsels. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Microneedle trekken, laden en microinjection van één-cel channel catfish, Ictalurus punctatus , embryo's. (A) naald met een verticale naald trekker te trekken. Structuur van de naald en diameter worden beïnvloed door de warmte van de kachel gloeidraad en de elektromagnetische kracht. (B) Microneedle laden met de mix van de CRISPR/Cas9 met behulp van een microloader-tip. (C) regeling van embryo's die channel catfish in een petrischaal van 100 mm met Holtfreter de oplossing. Microneedle is verlaagd tot het raakt en de eicel doorboort. (D) vergroot gedeelte van deelvenster C waarin het proces van het ei piercing. Opmerking de tip naald duwt de chorionic membraan naar binnen maar is het nog niet doorgedrongen. Ingespoten embryo's hebben de rode injectie materiële inside. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : CRISPR/Cas9 geïnduceerde mutaties in tol/interleukine 1 receptor domein-bevattende adapter molecuul (TICAM1) gen dat codeert opeenvolging van channel catfish, Ictalurus punctatus . Blauwe reeks vertegenwoordigt het protospacer aangrenzende motief (PAM), terwijl de groene reeks het streefcijfer voor gRNA vertegenwoordigt. Dubbele strand break geïnduceerd door Cas9 eiwit verwachtte optreden op de site van de 2 rode driehoeken. Mutaties worden toegewezen nummers 1 t/m 8. Schrapping mutaties worden vertegenwoordigd door een stippellijn waarin elk streepje overeenkomt met een nucleotide die is verwijderd. Rode sequenties zijn invoegingen terwijl paars vervanging mutatie vertegenwoordigt. Breuken van 78 vertegenwoordigen het aantal gemuteerde allelen in 78 sequencing Reacties (bijvoorbeeld 3/78 betekent dat een allel is gevonden in 3 sequencing reacties van een totaal van 78 reacties). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Indel mutaties in de channel catfish, Ictalurus punctatus , tol/interleukine 1 receptor domein-bevattende adapter molecuul (TICAM1) gen dat codeert reeks geïnduceerd door microinjection van gRNA/Cas9 eiwit in kanaal meerval one-cel embryo's zoals geopenbaard door DNA sequencing chromatogram. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 : CRISPR/Cas9 geïnduceerde mutaties in rhamnose bindend lectine (RBL) gen voor channel catfish, Ictalurus punctatus . Exonic sequenties zijn hoofdletters terwijl intronic sequenties kleine letters zijn. Blauwe reeks vertegenwoordigt het protospacer aangrenzende motief (PAM), terwijl de groene reeks het streefcijfer voor gRNA vertegenwoordigt. Een double strand break geïnduceerd door Cas9 eiwit was naar verwachting zullen optreden op de site van de 2 rode driehoeken. Mutaties worden toegewezen nummers 1 t/m 9. Schrapping mutaties worden vertegenwoordigd door een stippellijn waarin elk streepje overeenkomt met een nucleotide die is verwijderd. Rode sequenties zijn invoegingen. Breuken 40 vertegenwoordigen het aantal gemuteerde allelen in 40 reacties bv 2/40 sequencing betekent dat een allel is gevonden in 2 sequencing reacties van een totaal van 40 reacties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Mutatie Plaatsingskosten Verwijdering Mutatie (Δ) Eiwit lengte (aminozuur) Frameshift gewijzigd Voortijdige stop codon Voorspelde eiwit sequentie
WT 0 0 0 520 No No MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTSCSSYSLEISVST
ATTNNSNKESRPLPLKTPPESRDGQNHEAKPSS
PLVDHKPFYSVTKSYKSSDPTPLQERAQLEKFKF
RQYPDKHDTSEIVTPKSPNIESGLEKTFLSIPSGG
GKVGAQPVSTSKPPEASSTQEVGKHDSFSTEKQ
ASQEEEDMFYAFVILHAEEDSEEAVRLKSRLESIS
STIGATFSEDFAVPGQSTFRSVEDAIENSAYVMLL
LTPNFNTHLNETNADSALMNSIEKPHKHNTVIPL
LPRANGLTRNQMPFILRTKNPLVETRDRDTFEKM
AKKVLDLRNIQRQKSMWTEAQLVKKQREKQQW
LQEKKRYCKDFIQESPRVRELEEQIQQLKMQQQ
HLQPPYAQQTNSHQGFPGRPQSSGPMPFRSPS
PMPSYYSGNMWPQLPSNIHIQNAKCIMIGNNSTM
TVGGGVDSGDEDNF
(GenBank: NP_001187154.1
1 0 5 -5 104 Ja Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTFVQLLQPRNQRIHS
HNQ
2 5 40 -35 94 Ja Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSIS
GSRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAF
KVQKEPPKRDDSYPSSLRSTSNKSHNQ
3 0 87 -87 491 No Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSKTPPESRDGQNHE
AKPSSPLVDHKPFYSVTKSYKSSDPTPLQERAQ
LEKFKFRQYPDKHDTSEIVTPKSPNIESGLEKTFL
SIPSGGGKVGAQPVSTSKPPEASSTQEVGKHDSF
STEKQASQEEEDMFYAFVILHAEEDSEEAVRLKS
RLESISSTIGATFSEDFAVPGQSTFRSVEDAIENSA
YVMLLLTPNFNTHLNETNADSALMNSIEKPHKHN
TVIPLLPRANGLTRNQMPFILRTKNPLVETRDRDT
FEKMAKKVLDLRNIQRQKSMWTEAQLVKKQREK
QQWLQEKKRYCKDFIQESPRVRELEEQIQQLKMQ
QQHLQPPYAQQTNSHQGFPGRPQSSGPMPFRSP
SPMPSYYSGNMWPQLPSNIHIQNAKCIMIGNNST
MTVGGGVDSGDEDNF
4 3 131 -128 95 Ja Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSRAFKSPG
5 1 0 1 106 Ja Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSIFVQLLQPRNQRIH
SHNQ
6 1 0 1 106 Ja Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTFVQLLQPRNQRIH
SHNQ
7 14 0 14 100 Ja Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSRSTPPPRAAPTA
8 35 9 26 91 Ja Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTQV

Tabel 1: Effecten van indel mutaties in de tol/interleukine 1 receptor domein-bevattende adapter molecuul (TICAM1) gen dat codeert opeenvolging van channel catfish, Ictalurus punctatus, op voorspeld lengte van eiwitten (aminozuren) en volgorde ten opzichte van het wild Typ reeks (WT).

Mutatie Plaatsingskosten Verwijdering Mutatie (Δ) Eiwit lengte (aminozuur) Frameshift gewijzigd Voortijdige stop codon Voorspelde eiwit sequentie
WT 0 0 0 308 No No MMLFLKLSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQR
LTCETGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFT
NCALRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFG
TYKYYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSIE
IINANYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNTL
SIVAAMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYLT
VSYICTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGRT
DSTTCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARCE
EQSSCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
(GenBank: AHJ14694.1) 53
1 0 5 -5 29 Ja Ja MMLFLKPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
2 0 6 -6 306 No No MMLFLSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQRLT
CETGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFTN
CALRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFG
TYKYYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSI
EIINANYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNT
LSIVAAMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYL
TVSYICTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGR
TDSTTCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARC
EEQSSCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
3 0 12 -12 304 No No MILSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQRLTCE
TGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFTNCA
LRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFGTYK
YYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSIEIINA
NYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNTLSIVA
AMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYLTVSYI
CTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGRTDST
TCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARCEEQS
SCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
4 0 16 -16 6 Ja Ja MMLFLN
5 0 183 -183 8 No Ja MMLFLKRI (uitgaande van splicing wordt niet gewijzigd)
6 1 183 -182 5 Ja Ja MMLFL (uitgaande van splicing wordt niet gewijzigd)
7 1 0 1 31 Ja Ja MMLFLKTQPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
8 1 0 1 31 Ja Ja MMLFLKSQPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
9 20 0 20 18 Ja Ja MMLFLKASSHISSSASSP

Tabel 2: Effecten van indel mutaties in de rhamnose lectine (RBL) gen van channel catfish, Ictalurus punctatus, bindt voorspeld lengte van eiwitten (aminozuren) en volgorde ten opzichte van de wild type reeks (WT).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een gedetailleerd protocol voor microinjection van channel catfish embryo's te bereiken van gen knock-out werd gepresenteerd. Injectie van CRISPR/Cas9 eiwitten in de dooier is veel eenvoudiger, bespaart u tijd en vereist geen uitgebreide opleiding in vergelijking met de microinjecting van de blastodiscus van het embryo één-cel, die de gemeenschappelijke techniek voor de meeste genenoverdracht en gene bewerken met vis 30 , 42. het huidige protocol bewezen succesvol te zijn in het inducerende microdeleties in channel catfish TICAM 1en RBL genen. Deze betrouwbare en doeltreffende procedures leggen de basis voor het genereren van toekomstige gene uitsparingen in channel catfish. Het protocol kan worden aangepast voor de doelgroep van andere genen in het genoom van de channel catfish met behulp van de CRISPR/Cas9-systeem, of voor de aanpassing van de andere technologieën gen aan catfish, zoals de tol2 gemedieerde Transgenese. Het loont ook op evaluatie bij andere meerval diersoorten zoals de blauw meerval (I. furcatus), die commercieel belang zijn en hun eieren lijken te zijn gevoeliger voor behandeling dan channel catfish eieren. Echter, als andere gRNAs of biologisch actieve stoffen zoals DNA of mRNA worden geïnjecteerd, het protocol wellicht worden geoptimaliseerd om de beste voorwaarden te bepalen.

In de protocollen van microinjection van vis embryo's, microinjection procedures kunnen worden onderverdeeld in twee hoofdcategorieën: injectie in de embryonale cellen en injectie in de dooier. In medaka, werden in het cytoplasma van een cel embryo's te bestuderen van verschillende ontwikkelings processen in vivo41morpholinos gepompt. CRISPR/Cas9 mRNA gericht op het GnRH-gen waren in channel catfish microinjected in de blastodiscus van één-cel embryo's30. In de Driedoornige stekelbaars (Gasterosteus aculeatus), waren blastomeren microinjected voor het genereren van transgenics en gene uitsparingen42. Aan de andere kant, waren een-cel zebrafish embryo's dooier-ingespoten met morpholinos voor het manipuleren van het eiwit Heart of Glass (Heg), die bleek te zijn effectieve43. Deze 2 soorten aanpak hebben hun voor- en nadelen, maar als beide blijken te hebben van de zelfde doeltreffendheid voor dezelfde soort, dooier microinjection van één-cel embryo's zou de voorkeur om verschillende redenen.

Dooier microinjection is minder ingrijpende op de embryo's, aangezien de microinjection naalden niet de embryonale cellen doorboren doen. Daarnaast kunnen veel embryo's worden geïnjecteerd in een korte periode, terwijl de embryo's nog steeds in de eerste fase van de cel zijn. Er is geen behoefte aan het uitlijnen van de embryo's op een bepaalde positie. Dit zou ook tijd besparen en verminderen de stress van de behandeling van embryo's. In het hoogseizoen paai vis, is er een beperkte paai tijd waarin alle de procedures worden gedaan moeten om succesvolle knock-out. In channel catfish, de paaitijd duurt ongeveer 2 maanden44. Ontwikkelen van een snelle en effectieve microinjection protocol staat dan ook toe microinjection van veel embryo's te richten op vele genen in deze korte periode. Gelukkig, channel catfish kan kunstmatig worden voortgebracht voor de levering van een groot genoeg aantal embryo's voor microinjection te overwinnen van de hoge sterfte als gevolg van microinjection procedures45. Daarnaast kan het moment van bevruchting worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat de embryo's in de fase van de één-cel wanneer nodig.

Microinjection van CRISPR/Cas9 geïnduceerde microdeleties in verschillende vissoorten, waaronder zebrafish, Atlantische zalm (Salmo salar L.), de Nijl tilapia (Labeo niloticus), channel catfish, Atlantische poolfish (Fundulus heteroclitus) 46en common carp5,30,46,47,48,49,50. Bovendien, werd het systeem CRISPR/Cas9 gebruikt om genen in Labeo rohita karper via homologe recombinatie-gemedieerde inbrengen van buitenlandse DNA in gerichte genen51verstoren. In dit protocol werden succesvol microdeleties veroorzaakte in de codering sequenties met dramatische gevolgen voor de voorspelde eiwit sequentie, met inbegrip van frameshift mutaties resulterend in voorbarig stop codon. De fenotypische effecten van deze mutaties nog onderzocht moeten worden. Afgeknotte mRNAs zijn waarschijnlijk aangetast door de onzin-gemedieerde mRNA verval (NMD) traject, resulterend in de vermindering of de remming van expressie, en indien uitgedrukt, afgeknotte eiwitten zal waarschijnlijk achterblijven52,53 .

In ons experiment met het RBL-gen, twee typen mutaties (nummer 5 en 6) resulteerde in de verwijdering van 183 bp de helft van de exon 1, intron 1, exon 2, en deel van intron 2 volledig wordt verwijderd. Theoretisch, kan dit soort mutatie wijzigen de splicing van RBL pre-mRNA. Mutaties op de sites van de splice remmen de mogelijkheid van het spliceosoom te herkennen van de exon-54.

Kortom, is de ontwikkeling van een betrouwbaar efficiënt protocol voor gerichte gene bewerken in channel catfish van cruciaal belang voor de studie van functionele genomica, vooral nadat de genomic middelen hebben verrijkt met de recente sequentiebepaling van het channel catfish genoom. De hier beschreven procedures zijn eenvoudig, snelle maar efficiënte en zijn bewezen om te slagen op gene knock-out. Twee genen, TICAM 1 en RBL, werden gericht om aan te tonen van de efficiëntie van CRISPR/Cas9 knock-out met behulp van microinjection. Afhankelijk van wat wordt wordt geïnjecteerd, kan het protocol worden aangepast voor andere biologisch actieve stoffen bevatten. Het kan ook worden aangepast om de microinject van andere soorten meerval of andere vissoorten die soortgelijke ei structuur en samenstelling hebben. Dit protocol wordt de fundering van gene knock-out in channel catfish.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen conflict van belang hebben.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd gefinancierd door de USDA-NIFA award 2015-67015-23488 naar Roger Cone. De auteurs bedanken Dr. Ronald Phelps voor de beschrijving van brood voorraad selectiecriteria in de video. Ahmed Elaswad en Karim Khalil bedank de Egyptische culturele en educatieve Bureau in Washington DC voor de financiering van hun doctoraatsonderzoek.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reproboost implant Center of Marine Biotechnology Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females
TRICAINE-S Western Chemical. Inc. For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. 
Phenol red Sigma-Aldrich P0290 0.5%, sterile filtered
Stereo microscope Olympus 213709 For visualizing the eggs during microinjection
Microinjector ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MPPI-3 For the delivery of the injection material into the embryos
Micromanipulator ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MM33  For holding and controlling the movement of the injection needle. 
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956.003 For loading injection solution into microinjection needles.
Vertical needle puller David Kopf Instruments Model 720 For pulling microinjection needles
Cas9 protein PNA Bio Inc.  CP01 Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.
Expand High FidelityPLUS PCR System  Roche Diagnostics, USA For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation
Borosilicate glass capillaries Fisher Scientific 1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.
Petri dish VWR 25384-302 For holding the embryos during the microinjection.
Crisco The J.M. Smucker Company Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. 
Holtfreter`s solution Home Made 59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. 
Doxycycline hyclate USP (monohydrate) Letco Medical 690904 Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hammer, R. E., et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 315, 680-683 (1985).
  2. Komarova, Y., Peloquin, J., Borisy, G. Components of a microinjection system. , Cold Spring Harb. Protoc. 935-939 (2011).
  3. Du, S. J., et al. Growth enhancement in transgenic Atlantic salmon by the use of an "all fish" chimeric growth hormone gene construct. Nat. Biotechnol. 10 (2), 176-181 (1992).
  4. Davis, B., Brown, D., Prokopishyn, N., Yannariello-Brown, J. Micro-injection-mediated hematopoietic stem cell gene therapy. Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (4), 412-419 (2000).
  5. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  6. Liu, Z., et al. The channel catfish genome sequence provides insights into the evolution of scale formation in teleosts. Nat. Commun. 7, (2016).
  7. Abdelrahman, H., et al. Aquaculture genomics, genetics and breeding in the United States: current status, challenges, and priorities for future research. BMC Genomics. 18 (1), 191 (2017).
  8. Dunham, R. A. Aquaculture and Fisheries Biotechnology : Genetic Approaches. , 2nd, CABI. (2011).
  9. Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat. Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
  10. Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
  11. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  12. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  15. Cradick, T. J., Fine, E. J., Antico, C. J., Bao, G. CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Res. 41 (20), 9584-9592 (2013).
  16. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  17. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  18. Li, M., Zhao, L., Page-McCaw, P. S., Chen, W. Zebrafish genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Trends Genet. 32 (12), 815-827 (2016).
  19. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841 (1982).
  20. Powers, D. A., et al. Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish (Brachydanio rerio), channel catfish (Ictalurus punctatus), and common carp (Cyprinus carpio). Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 301-308 (1991).
  21. Inoue, K., et al. Electroporation as a new technique for producing transgenic fish. Cell Differ. Dev. 29 (2), 123-128 (1990).
  22. Buono, R., Linser, P. Transient expression of RSVCAT in transgenic zebrafish made by electroporation. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 271-275 (1991).
  23. Sin, F., et al. Gene transfer in chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) by electroporating sperm in the presence of pRSV-lacZ DNA. Aquaculture. 117 (1-2), 57-69 (1993).
  24. Dunham, R. A., et al. Enhanced bacterial disease resistance of transgenic channel catfish Ictalurus punctatus possessing cecropin genes. Mar. Biotechnol. 4 (3), 338-344 (2002).
  25. Lu, J. K., Fu, B. H., Wu, J. L., Chen, T. T. Production of transgenic silver sea bream (Sparus sarba) by different gene transfer methods. Mar. Biotechnol. 4 (3), 328-337 (2002).
  26. Cheng, Q., et al. Interaction of diet and the masou salmon Δ5-desaturase transgene on Δ6-desaturase and stearoyl-CoA desaturase gene expression and N-3 fatty acid level in common carp (Cyprinus carpio). Transgenic Res. 23 (5), 729-742 (2014).
  27. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J. Biotechnol. 208, 44-53 (2015).
  28. Treen, N., et al. Tissue-specific and ubiquitous gene knockouts by TALEN electroporation provide new approaches to investigating gene function in Ciona. Development. 141 (2), 481-487 (2014).
  29. Qin, Z., et al. Editing of the luteinizing hormone gene to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using a modified zinc finger nuclease technology with electroporation. Mar. Biotechnol. 18 (2), 255-263 (2016).
  30. Qin, Z. Gene editing of luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone and gonadotropin-releasing hormone genes to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using zinc finger nuclease, transcription activator-like effector nuclease and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 technologies. , Auburn University. AL. Ph.D. thesis (2015).
  31. Dunham, R. A., Winn, R. N. Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. Pinkert, C. A. , Elsevier BV. Amsterdam. 308-336 (2014).
  32. Elaswad, A. Genetic technologies for disease resistance research and enhancement in catfish. , Auburn University. AL. Ph.D. thesis (2016).
  33. Baoprasertkul, P., Peatman, E., Somridhivej, B., Liu, Z. Toll-like receptor 3 and TICAM genes in catfish: species-specific expression profiles following infection with Edwardsiella ictaluri. Immunogenetics. 58 (10), 817-830 (2006).
  34. Thongda, W., Li, C., Luo, Y., Beck, B. H., Peatman, E. L-rhamnose-binding lectins (RBLs) in channel catfish, Ictalurus punctatus: Characterization and expression profiling in mucosal tissues. Dev. Comp. Immunol. 44 (2), 320-331 (2014).
  35. Phelps, R. P., et al. Effects of temperature on the induced spawning of channel catfish and the production of channel× blue catfish hybrid fry. Aquaculture. 273 (1), 80-86 (2007).
  36. Poole, W., Dillane, M. Estimation of sperm concentration of wild and reconditioned brown trout, Salmo trutta L. Aquacult. Res. 29 (6), 439-445 (1998).
  37. Billard, R. Spermatogenesis and spermatology of some teleost fish species. Reprod. Nutr. Dev. 26 (4), 877-920 (1986).
  38. Coyle, S. D., Durborow, R. M., Tidwell, J. H. Anesthetics in aquaculture. , Southern Regional Aquaculture Center Publication 3900. Stoneville, Mississippi. (2004).
  39. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nat. Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  40. Armstrong, J., Duhon, S., Malacinski, G. Developmental Biology of the Axolotl. , 220-227 (1989).
  41. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J. Vis. Exp. (46), (2010).
  42. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055 (2016).
  43. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  44. Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. Biology and Culture of Channel Catfish. 34, Elsevier. 69-94 (2004).
  45. Su, B., et al. Relative effectiveness of carp pituitary extract, luteininzing hormone releasing hormone analog (LHRHa) injections and LHRHa implants for producing hybrid catfish fry. Aquaculture. 372, 133-136 (2013).
  46. Aluru, N., et al. Targeted mutagenesis of aryl hydrocarbon receptor 2a and 2b genes in Atlantic killifish (Fundulus heteroclitus). Aquat. Toxicol. 158, 192-201 (2015).
  47. Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
  48. Edvardsen, R. B., Leininger, S., Kleppe, L., Skaftnesmo, K. O., Wargelius, A. Targeted mutagenesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.) using the CRISPR/Cas9 system induces complete knockout individuals in the F0 generation. PLoS ONE. 9 (9), e108622 (2014).
  49. Li, M., et al. Efficient and heritable gene targeting in tilapia by CRISPR/Cas9. Genetics. 197 (2), 591-599 (2014).
  50. Zhong, Z., et al. Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp. Sci. Rep. 6, (2016).
  51. Chakrapani, V., et al. Establishing targeted carp TLR22 gene disruption via homologous recombination using CRISPR/Cas9. Dev. Comp. Immunol. 61, 242-247 (2016).
  52. Lim, J., Ghadessy, F. J., Yong, E. A novel splice site mutation in the androgen receptor gene results in exon skipping and a non-functional truncated protein. Mol. Cell. Endocrinol. 131 (2), 205-210 (1997).
  53. Gatfield, D., Unterholzner, L., Ciccarelli, F. D., Bork, P., Izaurralde, E. Nonsense-mediated mRNA decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian pathways. The EMBO Journal. 22 (15), 3960-3970 (2003).
  54. Talerico, M., Berget, S. M. Effect of 5'splice site mutations on splicing of the preceding intron. Mol. Cell. Biol. 10 (12), 6299-6305 (1990).

Tags

Genetica kwestie 131 CRISPR/Cas9 gene bewerken gene knockout microinjection channel catfish embryo's mutatie eiwit microdeleties afgekapt
Microinjection van CRISPR/Cas9 eiwit in Channel Catfish, <em>Ictalurus punctatus</em>, embryo's voor Gene Editing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elaswad, A., Khalil, K., Cline, D.,… More

Elaswad, A., Khalil, K., Cline, D., Page-McCaw, P., Chen, W., Michel, M., Cone, R., Dunham, R. Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing. J. Vis. Exp. (131), e56275, doi:10.3791/56275 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter