Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Персонализированные пептид массивы для обнаружения Alloantibodies HLA в трансплантации

doi: 10.3791/56278 Published: September 6, 2017

Summary

Несоответствия в человеческий лейкоцитарный антиген (HLA) последовательности между органа доноров и получателей пары являются основной причиной антител опосредованной отторжения при трансплантации. Здесь мы представляем использование пользовательских антигена массивов, которые основаны на индивидуальных доноров HLA последовательности зондировать alloantibodies HLA анти доноров в орган получателей.

Abstract

В трансплантации органов функции и долговечность трансплантат критически полагаются на успех управления иммунологические неприятие реактивностью против Человеческие лейкоцитарные антигены (HLA). Гистосовместимости руководящие принципы основаны на лабораторных испытаний анти HLA иммунитета, который представляет либо как существующие или de novo генерируется HLA антитела, которые представляют собой основные трансплантации барьер. Текущий тесты строятся на один антиген бусины (НКС) платформы, с помощью фиксированного набора ~ 100 предварительно рекомбинантных антигенов HLA зонда трансплантации сера. Однако в организме человека существует гораздо больше различных типов HLA, с не двух лиц за исключением однояйцевых близнецов, которые могут совместно использовать то же сочетание HLA последовательностей. В то время как передовые технологии для HLA набрав и сразу sequencing точно может захватить любые несоответствия в последовательности ДНК между донором и получателя HLA, SAB assay, благодаря его ограниченное разнообразие в последовательности представление, не может точно обнаружить alloantibodies специально против Хла несоответствия доноров. Мы стремились разработать дополнительный метод, используя различные технологии для обнаружения и характеризуют HLA антитела анти доноров на персональной основе. Средство проверки является массивом пользовательских пептидов доноров HLA-производные последовательностей для зондирования сыворотки после трансплантации органа получателя для оценки риска для антител опосредованной отказа. В одном массиве для одной пары донор реципиент до 600 уникальных пептиды принимаются на основании донора HLA белковых последовательностей, каждый пептид, проведение по крайней мере один из несовпадающие остатков в последовательности 15-амино кислоты. В наших экспериментальных экспериментов для сравнения антигена шаблоны для до и после трансплантации сывороток на эти массивы мы смогли обнаружить анти HLA сигналы с разрешением, что также позволило нам выявить иммунные epitopes участвующих. Эти персонализированные антигена массивы позволяют с высокой разрешающей способностью обнаружения доноров специфические epitopes HLA в трансплантации.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Заместительной терапии в орган, который регулярно проводится по всему миру позволила спасти миллионы человеческих жизней. Твердых трансплантации происходит в приблизительно 100 пациентов на миллион человек в США ежегодно, хотя большее число по-прежнему находятся на очереди для получения донорских органов из-за острой нехватки питания (согласно информации, представленной органом Закупки и трансплантации сети - OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Трансплантации высоко регулируется с целью сокращения отходов органа и спасти жизни, но в эффективности ограничены научные инструменты, используемые для информирования этих правил. К примеру, научное сообщество полностью признает высоко полиморфный государства молекул HLA и точные генетические тесты ДНК с помощью разрешением ввод и ввод на основе последовательности (SBT) были разработаны в последние годы1, 2. Однако, методы тестирования alloantibody пока не удалось производить огромное разнообразие индивидуальных последовательностей HLA как антиген зонды. Стандартный тест сегодня использует неизменный группа ~ 100 аллельные антигенов, которые состоят из общих вариантов HLA, A, B, C, DQ, DP и DR последовательностей в человеческие популяции3,4,5,6. Часто, фактической доноров HLA последовательности не включаются в панели теста, заставляя трансплантации врачей и хирургов вывести доноров конкретных реактивности, основанные на общих сходство между фактической последовательности донора и соответствующих «стандарты» в тестовый набор7,8. Следовательно иногда бывает сложно сделать надежную оценку неприятие риска на основе антител теста результаты9,10,,1112. Таким образом, новые лично настраиваемые тесты для alloantibodies являются крайне необходимых13,14.

HLA гены кодировать гистосовместимости комплекс (MHC) рецепторы, которые имеют ключевые функции в иммунных ответов6. Чтобы быть наиболее полиморфных генов в геноме человека6известны HLA гены. Из-за быстрого прогресса в ДНК секвенирования генов HLA, новые аллельные варианты стратегий (или просто называют аллели) в настоящее время обнаружены взрывные темпы15,16. По марта 2017 16,755 проверенных аллели был сдан в базе данных IMGT/HLA (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), из которых 12,351 были класса я и 4,404 были класса II групп. В противоположность только чуть более 100 различных аллелей представлены в assay Стандартный одноместный антиген бусины (НКС), который обычно используется для обнаружения alloantibodies в трансплантации. SAB метод построен на платформе Luminex, с помощью проточной цитометрии. Так как assay использует неизменный набор антигенов, помимо незначительных партии к партии вариативности в производстве, антисыворотка тест может быть энергично стандартизирована через отдельных лиц и через5лабораторий. Однако, этот тест не может захватить все alloantibodies разработаны специально против доноров аллелей, особенно при отсутствии последовательности доноров от САБ. Хотя пользовательские производства антигенов доноров на основе истинной последовательности желательны, остаются технические проблемы в рационализации необходимых производство и процедур тестирования.

Мы недавно описал альтернативной методологии в технико-пересадка почки субъектов17. Метод используется пептидные антигены в формате массива, который для зондирования до и после трансплантации сера отдельных субъектов. Каждый массив была специально построена с использованием местом синтеза метод18,19,20,21,22,23 , производит пептидные антигены, каждый 15 аминокислоты в длину, полностью основан на соответствующих органа доноров HLA аллелей a, B, C, DQA1, DQB1 и DRB1. ПЯТНО синтез эксплуатируется на мембрану целлюлозы с использованием стандартного Fmoc химия22 и может производить сотни пользовательских пептидов параллельно с полностью автоматизированной робототехническая система19,21. Массив мембраны может выдержать несколько раундов зачистки и reprobing циклов. В нашем ретроспективное исследование17мы обнаружили изменения в структурах антигена с антисыворотками хранимых трансплантации, собранных в ряды (то есть, до и после трансплантации). Здесь мы описываем Технический протокол для рабочего процесса, включая массив дизайн, производство, антисыворотка зондирующего и результат анализа. Этот метод предназначен для обнаружения alloantibodies против конкретных линейных epitopes на молекулы HLA доноров трансплантации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все методы, описанные здесь были одобрены Северо-Западного университета институциональных Наблюдательный Совет (IRB протокол #: STU00104680). Процесс общего протокола проиллюстрирован на рис. 1.

1. анализ Bioinformatic доноров и получателей HLA последовательности

  1. извлекать последовательности из базы данных IMGT/HLA 15.
    1. Получить HLA набрав доклады органа доноров и его получателя.
      Примечание: Убедитесь, что используются надлежащие процедуры для защиты конфиденциальных медицинских записей. Как правило требуется утверждение институционального обзора Совет (IRB) протокол исследования или экспериментальные испытания за институциональные IRB руководящие принципы. Если HLA доклады на основе ПЦР типирование (высоким или низким резолюции) или на основе виртуализации ввода (SBT), перейдите к шагу 1.1.3. Если последовательности были получены из секвенирования геномных/HLA, и если они являются полными, используйте эти последовательности непосредственно, вместо этого. Иногда когда доступны только неполного ввода или последовательность результатов, выполните дополнительные шаг 1.1.2. Чтобы назначить " отсутствующих " аллели через веб-инструмент, описанный в шаге 1.1.2.
    2. Открыть неоднозначной комбинации аллелей, после веб ссылка - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html и поиск с использованием “ неоднозначной инструмент поиска комбинации аллелей ” функции для получения гипотетический аллелей. Затем перейдите к пункт 1.1.3. чтобы ввести имя аллеля.
    3. Откройте форму запроса IMGT/HLA аллелей на следующих веб-ссылку - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html и ввода тема ’ s аллеля имена (каждый индивидуально, как показано на рисунке 2) в “ Поиск для ” поле. Нажмите на “ Поиск аллели теперь ” кнопку. HLA аллелей имена следует использовать стандартные системы именования (то есть, A * A * 01, A * 01:01:01:01 и любые предыдущие обозначения как A * 01010101).
    4. Найти имя соответствующего аллеля, отображается на экране. Нажмите на кнопку аллеля.
    5. Копия " последовательности белка " и вставьте его в текстовый документ под строку заголовка " > аллеля имя ". Эффективно, текстовый документ находится в формате FASTA (FAST-All) аллеля имя и последовательности.
  2. Выполнять на основе гена нескольких рядов доноров и получателей и пациентом аллелей.
    1. Один ген (т.е. DQB1 * 03:01:01:01) в то время, скопируйте и вставьте все четыре аллели донора и пациента FASTA последовательностей (два от донора) и два от пациента в комбинированных текстовый документ. На данный момент, это важно для дифференциально обозначения доноров аллеля имена от пациента аллеля имена (варианты включают дифференциального использование верхней против нижней случаях; или создать отличительный расширение префикса или суффикса к имени каждой аллеля отдельно пометить доноров против. пациент аллели). Порядок входных последовательностей не важен, потому что после выравнивания, порядок будет перетасовываются по уровням сходство между любой парой последовательностей.
    2. Копирование и вставка последовательности в FASTA формат (как видно на рисунке 3) сверху в “ введите ваш входной последовательности ” поле на веб-сайте кластера Омега: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
    3. Нажмите на " представить вашу работу " с помощью стандартных настроек параметров: такие, как " PROTEINŔ и " Clustal ж / номера ". Выполнить выравнивание, нажав на " отправить ". Выравнивание четырех последовательностей отображается на экране ( Рисунок 4).
  3. Марк доноров конкретных рассогласований.
    Примечание: Следует особо отметить что аллельные последовательности, здесь были основаны на результатах HLA набрав, не виртуализации. Таким образом существует риск, что соответствующей последовательности вариации в конкретной паре доноров и получателей помощи могут быть пропущены. Эту потенциальную проблему будет смягчаться как больше и больше центров трансплантации принять точным разрешением ввода и прямого секвенирования ДНК.
    1. Копировать и вставить выравнивания текста в текстовом документе и создайте новый документ. Если формат файла соответствие нарушается, исправьте формат, изменив стиль шрифта и размер: всегда используйте " Courier New " шрифт в небольших тип размер по размеру строки. Сохраните документ после того, как решаются проблемы форматирования.
    2. Вручную проверять соответствие последовательности для определения всех несоответствующих остатков, которые однозначно относятся к донора. Марк каждого из этих конкретных доноров остатков с помощью отличительный цвет шрифта.
    3. Подчеркнуть все буквы в донора ' s последовательностей, которые расширяют 14 остатков оба вверх - и ниже по течению отмеченные несоответствия конкретных доноров (рассчитывается как 15 аминокислот пептидной минус 1 остатков несоответствия).
  4. Получают 15-mer пептид последовательностей в серии перекрывающихся.
    Примечание: Причина для выбора 15-mer пептиды была основана на общие знания о типичных epitopes, будучи 4-9 аминокислот в длину. Поэтому, когда мы применили " скользящее окно " процедура с размером шаг 4 аминокислот ( рис. 1), наш выбор длины 15 аминокислот осталось 15-4 = 11 перекрываются аминокислоты в любой соседней пептидов в серии. В теории, это перекрытие 11 аминокислотных достаточно для покрытия всех иммунных epitopes до 9 аминокислот в длину, так что не epitope будет случайно " разделить " пополам с только частичные последовательности в массиве.
    1. Использовать подчеркнутые последовательности как шаблоны последовательно получить краткое 15 аминокислот в серии перекрывающихся по 4 остатков между любые две последовательности непосредственно в серии.
    2. , Копировать и вставить эти 15 аминокислот в таблицу ( рис. 5) в формате столбцов в сопровождении нотации столбцы, которые включают соответствующие имена доноров аллелей. Дополнительный столбец включить aa остатков позиции может быть полезным.
  5. Повторите шаги от 1.1.3. 1.3. для каждой HLA аллелей (т.е. A, B, C, DQA1, DQB1, DRB1 и DP) стран-доноров и получателей пара для получения 15 aa коротких последовательностей донора.
  6. Копирование и вставить все столбцы в таблицу мастер для создания длинный непрерывный столбец всех 15 aa последовательностей из всех аллели донора. Запишите общее количество строк (для последовательностей пептида) в документе,.

2. Дизайн макета пользовательского массива и производства

  1. создать таблицу пептид последовательностей с соответствующего аллеля призвания. Массив имеет 30 столбцов и 20 строк и может вместить до 20 х 30 = 600 мест для пептидов. В зависимости от общего количества пептиды, записанная в 1,5 от одного конкретного донора и на основе нашего прошлого опыта с двумя примерами, которые мы пытались в Лю и др. 17 600 пятно массив может содержать все последовательности, генерируемые ~ 2 отдельных трансплантации случаев.
    1. Рационально планировать наиболее eОперативная способ соответствовать наборы пептидов в пределах 600-пятно формат массива.
    2. Если более чем один предмет может поместиться в одном весь массив, вставка пустых строк после первого доноров ' s последовательности соответствует общее количество строк, которые можно разделить на 30 (количество мест в строке в массиве).
    3. Сразу же после последнюю пустую строку для первого набора последовательностей, вставьте весь столбец последовательности содержимого из второй случай пересадки.
    4. Повторить эти шаги до тех пор, пока массив заполняется и не больше случаев могут быть добавлены без превышения 600 мест. Если пустые строки целиком заполнить внизу, " двигаться " пустую строку, чтобы располагаться между наборами двух доноров. Это широкое пространство между случаями делает резки мембраны после завершения синтеза проще - после шаг 3.2. ниже.
  2. Программа пептид последовательностей в контексте структуры массива. Программа SPOT синтезатор принимает текстовый формат последовательностей (одна строка один пептид последовательности), которые могут быть непосредственно получены путем сохранения результирующей таблицы из шага 2.1.4 как простой текстовый документ (без дополнительных столбцов для аллеля имена, aa позиции и т.д.).
  3. Синтез
  4. Запуск автоматизированных пептид массив через синтезатор пятно. Вся операция синтеза подробно в Kudithipudi et al. 21. Обратите внимание, что Fmoc синтез двух массивов ~ 4-5 дней.

3. Зонд и иммунные Reprobe от временных рядов индивидуума трансплантации получателя.

Примечание: 600-пятно мембраны массив имеет размеры ~ 7 см x 13 см. После синтеза массивы могут храниться при комнатной температуре как сухость оболочек для по крайней мере двух лет, когда защищены от прямого света. Избегайте чрезмерного складывания мембраны для сохранения ее долговечность для многократного использования.

  1. Увлажняет мембраны массив с этанолом и визуализировать пептид пятна, окрашенных с Понсо S. Массив
    1. Регидратационный мембраны, перевозящих пептиды после поэтапная процедура оптимизированы в Li et al. 24.
      1. погружают массив мембрану в 20 мл 100% этанола.
      2. Добавить 20 мл дистиллированной воды, чтобы разбавить раствор 50% этанола и инкубации при комнатной температуре 15 мин
      3. Изменить решение, погружение на 40 мл воды 100% три раза и инкубировать 15 мин каждый раз и.
      4. Мыть в надлежащей рабочей буфер, например, 20 мл TBST (Tris амортизированное saline с 0,1%), три раза за 5 мин.
    2. Понсо S пятнать массива для визуализации синтетических пептидов
      1. добавить 20 мл раствора предварительно разработанных Пуансо непосредственно в массиве гидратированных и проинкубируйте ~ 30 s встряхивании.
      2. Запуск дистиллированной воды постоянно над мембраной для исключения пятен фоновый цвет Пуансо. Во время процесса, пептид пятна красного цвета может стать видимыми.
      3. Отдельные части массива для каждого донора тщательно разрубом между разделами массива для отдельных случаев. Марк ориентации каждого массива.
  2. До блока массива.
    1. Блок мембрану в 20 мл 5% обезжиренное молоко растворить в TBST буфер. Это решение на базе молока будет далее де пятно Пуансо цвет. Заменить молоко буфер несколько раз для получения ярких изображений пептид.
    2. Для целей учета, сделать снимок изображения Пуансо массива с помощью ручной камеры (например, на рис. 6).
    3. По-прежнему блокирует мембраны в 5% обезжиренное молоко при температуре 4 ° C на ночь или при комнатной температуре на 2 ч с качания.
  3. Инкубировать массив с трансплантации антисыворотки.
    Примечание: Он должен быть отметил, что явление, известное как прозона или крюк эффект может быть результатом дополнение-зависимых от вмешательства в сыворотке антител анализа. Чтобы обойти эту проблему, предварительной обработки шаг необязательный сыворотки можно рассматривать с ЭДТА или тепловой инактивации образцов сыворотки.
    1. Удалить блокирующий буфер и промойте мембрану с 20 мл TBST три раза на следующий день для 5 минут каждый раз.
    2. Добавить 20 мкл сырой сыворотке крови получателя до 20 мл 2,5% молока в TBST буфер и инкубировать с мембраной для 2-3 ч при комнатной температуре. Обратите внимание, что в этот первоначальный раунд зондирование, рекомендуется сначала используется последний после трансплантации сыворотки (или вероятно наиболее сенсибилизированных сыворотки) временных рядов. Это основано на предположении, что ранее образцов в этой серии, особенно от момента времени до трансплантации, имеют менее разнообразных alloantibodies, которые имеют тенденцию развиваться с течением времени. Таким образом, любую возможность помех сигнала от " перенос " между зондирующего раундов может быть четко отличать от действительно развитые alloantibody реактивность вследствие иммунного ответа против трансплантата.
  4. Мыть массив с помощью 20 мл TBST и инкубировать с вторичные антитела и.
    1. Мыть каждый раз мембраны три раза за 10 мин.
    2. Инкубировать с Коза античеловеческие IgG-ПХ (пероксидазы) Вторичное антитело на мэм разрежения в TBST буфер с 1% молока для еще 2 h.
  5. Мыть и развивать блот.
    1. Мыть мембраны три раза с TBST 10 минут каждый раз.
    2. Выполнять усиленной хемилюминесценции (ЭСЛ) с 5 мл раствора luminol свежезаваренным смешанного с 5 мл раствора перекиси развивать мембраны (за 1 мин).
    3. Визуализировать ECL сигналов с помощью подходящего тепловизор (т.е., ChemiDoc систем обработки изображений или Azure C600).
  6. Сканирования и количественно блот.
    1. Сохранить развитых изображения ( рис. 7, ниже изображения) и выполнять количественная оценка пятно интенсивности.

4. Сравнивать антисыворотка реактивности по клинической временных рядов.

  1. Стрип массива.
    1. В этот момент, держите мембрану мокрой во все времена.
    2. Полосы мембраны при инкубации с 20 мл коммерческих зачистки буфера при 37 ° C в течение 20 минут и затем промойте мембрану с TBST три раза за 10 мин. Затем повторить блокировки (шаг 4.2) и проверки (шаг 4.3) шаги, с помощью различных сыворотке пациента, принятых в разное время точке.
  2. Блок раздели мембраны.
    Примечание: После зачистки, мембрана может быть повторно использован для еще один раунд зондирующего различных сыворотки из той же пациентки в временных рядов.
    1. Блокировать мембраны, используя буфер молоко 5%, как раньше (см. шаг 3.2).
  3. Reprobe различных антисыворотка из той же время серии (повторите шаги от 3,3-3,6; пример на рис. 7, верхнее изображение).
    Примечание: Раздели массив затем может использоваться для reprobe другого образца сыворотки. Так как пептиды ковалентно конъюгированных вспомогательную матрицу мембраны, мы показали, что массив может быть повторно использован для до 20 раундов зачистки и reprobing циклов без потери его performance.
  4. Длительного хранения массивов.
    1. Магазин мембраны в буфере TBS дополнена азид 0,02% w/w натрия в качестве консерванта. Используйте запечатанный пластиковый пакет для долгосрочного хранения. При температуре 4 ° C под защита от прямого света, мокрой мембраны могут быть сохранены для по крайней мере 2 лет.

5. Сбора и анализа данных

  1. вручную добавлять аннотации позитивные антигена пептиды.
    1. Найти пятна, показаны антитела положительных сигналов и определить каждый из их позиции сетки.
    2. Выделить соответствующие строки основного листа для положительных пептиды.
  2. Получить пептидные последовательности, перечисленных в основной лист ( рис. 7, внизу списка). По словам принцип проектирования, изложенных в шаге 1.4.1., соседних серийный пятна доля значительно перекрытие последовательностей (15-4 = 11), поэтому реактивной epitopes может разделяться пептидов в серию последовательных.
    1. Выделить любые позитивные пятна, происходящих в преемственности.
  3. Определить минимальные epitope длину для каждого пептида в серии.
    1. Выделить любой потенциально общей epitope последовательности на основе перекрывающихся сегментов реактивной пептидов.
  4. Структурно модель epitopes антигена.
    1. Получить прототип HLA кристаллических структур из банка данных белков, найти на следующих Web-ссылку: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.
    2. Отобразить прототип HLA структуры в Pymol (скачать с www.pymol.org).
    3. Карта " или модель обнаружил анти доноров epitopes в 3D структуры молекул HLA прототип, выделив реактивной пептид последовательности ( рис. 8). Нажмите на " экран ", затем " фон " и выберите " белый ". Чтобы сохранить изображение, перейдите на " файл " и " сохранить изображение как " и выберите формат файла " png ".
  5. Результаты и назначить соответствующее аллели реактивной epitopes.
  6. Сравнить массив результатов с результатами одного антиген бусины (НКС), если доступно.
    Примечание: SAB тест, с помощью единого аллельные антигены меры реактивности антитела к фиксированной группа HLA белков. Отдельные пептиды, которые показывают антитела реактивности принадлежат к определенным HLA аллелей, которые, если также включены в панели SAB, позволяют прямое сравнение между результатами САБ и массив. Наши предыдущие исследования 17 показали высокий уровень корреляции между результатами, предполагая, что пептид epitopes значительный вклад общей реактивности SAB. Кроме того массив результатов также выявить аминокислоты уровни специфичности.
    1. Получить SAB результаты из лаборатории для HLA который предоставляет сведения о том, следует ли и какие аллели доноров реагировать после пересадки сера пациента. Результаты от шага 5.5. на основе массива анализ также предоставляют информацию о соответствующих доноров аллели позитивный для реактивностью alloantibody.
    2. Сравнить САБ и массив результатов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В первоначальном исследовании, используя массив, скрининг метод17мы поступил в общей сложности 5 предметов трансплантации почек. Мы получили HLA набрав результаты нашей когорты и их соответствующих доноров. Их истории болезни и титры аллельные антитела от SAB испытаний также были доступны для нас. В нашем экспериментального исследования этих 5 пациентов, мы разработали две разные методики: стандартный массив, состоящий из фиксированной группа пептидов и персонализированные массивы, которые были пользовательские сделал для каждой пары доноров и получателей. В то время как первый метод позволило нам технически проверить производительность платформы массива в достижении высокого уровня конкретизации отдельных трансплантации, персонализированные протокол для этого последний метод описан в этой статьи и видео предназначены для комплексного скрининга доноров специфических антител (DSA), который часто коррелируют с плохой трансплантата результаты5,25,26.

Персонализированные массивы были применены в двух из пяти случаев17, и для иллюстрации процесса общего метода, здесь мы сосредоточиться на одном из этих двух пациентов (а именно, PTN #4). Ключевая технология для создания пользовательских пептидов массив включает в себя пятно синтезатор. Это полностью автоматизированная роботизированная система, которая делает пептиды, используя синтез Fmoc непосредственно на специально производных сотовой матрицы на мембране (рис. 1). Мы использовали гибкость синтезатор собрать большие наборы пептидов, полученных от доноров отдельных органов HLA последовательностей. Для того, чтобы иметь достаточный охват, чтобы избежать ситуации, когда непрерывное epitope это время «Сплит» и теряет антитела реактивности, мы следовали «ходьба» дизайн серийный пептидов, иметь 15-4 = 11 остатки дублирования между любой непосредственно примыкает пептиды, так что серии всегда достаточно для покрытия типичная длина антитела epitopes оценивается в 4-9 aa в длину (рис. 1).

Шаблон HLA последовательности непосредственно были загружены из базы данных репозитория в EMBL-Эби (Европейского института биоинформатики). В качестве примера, PTN #4 доноров по HLA-DQB1 * аллеля 03:01:01:01 был искали (веб-страницы иллюстрации на рис. 2). Совместно, мы отдельно скачал последовательности для донора второго аллеля HLA-DQB1 * 02: 01:01, а также PTN # 4, сам, HLA-DQB1 * 04:02 и * 05:01. Затем, несколько выравнивание последовательностей проводилось с использованием Clustal Омега веб-функций (рис. 3). Результирующий файл выравнивание был получен (рис. 4), из которого были определены все несоответствующие аминокислотных остатков (доноров остатки выделены). Далее мы отмечали шаблон последовательности (подчеркнуто) стран-доноров, которые были достаточно долго, чтобы охватить все его несоответствие остатков. На основе этих шаблонов последовательностей и после «ходьба» дизайн как описано выше, три ряда пептидов каждый 15 aa длиной были получены для HLA-DQB1. Этот процесс повторяется на остальную часть донора аллелей HLA-A, B, C, DQA1 и DRB1 (DRA1 и DP были исключены из-за отсутствия соответствующих клинических записи) по сравнению с соответствующей аллели его получателя. В конце в общей сложности 202 пептиды были зачислены для создания массива (пептид последовательности в массив иллюстрации на рисунке 6и листа на рисунке 5 ) специально для зондирования PTN #4 после трансплантации сыворотки и сравнили результаты с полученные от последующих reprobing его до трансплантации сыворотки (рис. 7). Из 202 пептиды, в общей сложности 10 сигналов показал антитела связанные с образца после трансплантации которых доноров конкретных остатков (несоответствие от получателя) E87, I306, W243 и K197 HLA-B * 52:01, -Б * 52:01, - C * 03:04 и - DQA1 * видимому, 05:01 участие в разжигании антитела реактивности (остатки обозначаются красными буквами на рис. 7).

Кроме того одним из ключевых преимуществ массива в качестве метода по сравнению с традиционными SAB тест является, что epitope информацию можно легко получить, как показано на рисунке 7. Мы сравнили антитела реактивной epitopes по HLA DQA1 - DQB1 от всех пяти пациентов (отдельный массив результатов в Лю et al. 17) их всех смоделированных для совместного Кристаллическая структура гетеродимера DQA1 и DQB1 (рис. 8). Отрадно, что сегмент известные структуры, известной как стренги β1 является «точка», что было гораздо больше шансов (3/5 у больных 2,3,5) быть мишенью для alloantibodies среди субъектов трансплантации 5 случае когорты.

Figure 1
Рисунок 1 . Общая схема антигена HLA-основе массива в качестве метода для обнаружения анти доноров Хла alloantibodies в орган получателей. (Адаптировано и изменение от Лю и др. 17) пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 . Веб-сайт репозитория данных
Для получения последовательности HLA, посетите следующий веб-сайт: http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html
Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
На рисунке 3. Несколько белковых последовательностей выравнивание доноров против получателей аллелей HLA-DQB1, с помощью веб-инструмента Clustal Омега.
Скопируйте и вставьте последовательности пациента #4(PTN#4) DQB1 * 0201 и 03:01 и донора DQB1 * 04:02, 05:01 в формате FASTA в http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ (для иллюстрации, DQB1 * 05:01 PTN #4 и DQB1 * 03:01 доноров отображаются в поле ввода) . Выберите параметр «Clustal ж / чисел» в «Шаг 2» для формата вывода и запустить выравнивание. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 . Сравнениедоноров vs. HLA-DQB1 пациента/получателей и выбор шаблона последовательности для синтеза пептида.
Донора последовательности находятся в полужирный, с донорами конкретных несоответствия в красный цвет шрифта и также подчеркнул с черные ящики. Эти остатки конкретных доноров содержат шаблон последовательности (подчеркнуто) для извлечения пептиды. (Эта цифра была адаптирована и изменения от Аль Liuet. 17) пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 . Наглядным примером основного листа электронной таблицы доноров HLA пептидов.
Пептид позицию в массиве указывается строка — столбец координаты. Пептид последовательности используются для программы синтеза с использованием роботизированной пятно синтезатор. Специфичные для доноров остатки (несоответствие от получателя соответствующего аллеля) выделены жирным шрифтом и подчеркнул. Также указывается начальное и конечное положение пептид, соответствует полной длины HLA-DQB1 последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 . Образ раздела массива витражи с Пуансо
Отметить различия в интенсивности цвета из-за разницы в аминокислотный состав среди пептидов, в то время как пептид концентрации среди всех пятно областей являются одинаковыми. (Изображение является наглядным примером, не один из этого фактического исследования). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7 . Конкретных доноров HLA-A, B, C, DQ, DR массив изучение несоответствие epitopes в PTN #4.
Серийный пептиды были получены от доноров последовательности для покрытия несоответствие остатков (пример DQB1 на рис. 4). Массив был использован для зонда после трансплантации сыворотки (Нижняя помаркой: пост TX) и впоследствии до трансплантации сыворотки (верхняя помаркой: pre-TX) от той же пациентки. Четыре набора сильных пятен от зондирования после трансплантации отмечены красными линиями (в нижнем пятно), в то время как два пятна средней интенсивности, которые связаны только с предварительного трансплантации сыворотки отмечены синими линиями (в верхнее пятно). В нижней таблице соответствующей последовательности пептида и их реактивности в сыворотке крови после трансплантации. Конкретных доноров (несоответствие) остатков E87, I306, W243 и K197 их соответствующих аллелей красными буквами и пептиды, показаны сильный антитела реактивности в жирным шрифтом. Эта цифра была адаптирована и изменены с Лю и др. 17. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8 . Структурные места HLA-DQ epitopes.
Совместное Кристаллическая структура HLA-DQ8 был использован как шаблон. Структура состоит из DQA1 и DQB1 подразделений вместе с антигеном пептида (A). Вторичные структуры протеина α-спиралей и β-пряди, отображаемые в панели (B). DQA1 и DQB1 пептидов, которые отреагировали с какой-либо из пяти сыворотки были расположены на совместное кристаллической структуре ( A и B: закрашены синим). Три β-стренги, β1, β6 и β12 (темно-синий в B), каждый представлен несколькими пептидов (короткие красные линии, соответствующие линейные aa позиции DQA1), отреагировал с несколькими пациентами образцов (оригинальные результаты в Лю et al. 17). все шесть DQB1 пептидов (жирным шрифтом) реагирует на антитела у больных #2, #3, #5 расположены в сегмент «горячих точек» β1 (в B: указывает красная стрелка). Этот показатель был адаптирован от Лю и др. 17. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Дизайн месте массива, описанный здесь является для экспериментального изучения alloantibody специфичность в пересадке против антигенов HLA органа доноров. В отличие от существующих пробирного SAB, широко используется в клинике метод массива антигена имеет большое преимущество в его гибкий дизайн, который может вместить истинный HLA последовательности отдельных доноров. Новая платформа использует возможности быстро развивающейся технологии секвенирование ДНК, которая вскоре будет в состоянии производить точные показания HLA аллельные последовательности без неоднозначности16,27 и потенциал места для баз данных для репозитория HLA последовательностей15 лет в общей численности населения. Наш текущий массив скрининг протокол был разработан основанный на успех нескольких экспериментальных исследований сыворотки трансплантации. Здесь мы должны подчеркнуть, что на данном этапе нашего прототипа массивы создаются только для использования в исследовательских целях, не для диагностики приложений в клинической практике.

Еще заметные различия между САБ и наш массив антигена является, что последний имеет более высокое разрешение, чтобы отличить потенциальных epitopes антигена в пределах 15 aa сегментов HLA последовательностей, которые могут предоставить ценную информацию о alloantigenicity18 . Однако в отличие от SAB, который представляет весь белков антигенов адаптировать их складчатых структур, антиген массив включает только короткие пептиды, которая исключает сведения о конформационных складывания. Таким образом, массивы не могут обнаружить антитела, которые признают лишь конформационные epitopes, который некоторые считают, составляют большинство всех функциональных эпитопов отношение к антител при посредничестве неприятие28,29. Тем не менее в других контекстах, действия антител против линейной epitopes, таких, как те в короткие пептиды, эксплуатируются в ответах вирусных антигенов и в вакцины дизайн30,31. Следует также отметить что в ограниченное количество пациентов образцов, обнаружения чувствительность производительность нашего массива превышает количество САБ и разрешено обнаружение антитела доноров раньше17 во время клинической прогрессирование антитела опосредованной отказ. Это объясняется высокая Молярная концентрация местных антигена пептидов в массиве по сравнению с САБ. Эта функция была особенно полезно в тех случаях, когда SAB обнаружено не реактивности при клинических и патологические антитела опосредованной отказа доказательства очевидны, как мы показали ранее17. Однако важно отметить, что этот индивидуальный тест является более длительным, чем стандартный тест на САБ. Массив тестов требует получения орган донора и (предлагаемых) получателя HLA последовательности перед началом проектирования антигена пептиды. Затем он занимает несколько дней для получения массива и еще 7-8 часов для получения результатов антитела. Таким образом громоздкая процедура не подходит для трупа трансплантации, если основная цель антитела для определения появление доноров специфические антитела после трансплантации, а не для оценки до пересадки существующих антител.

Метод массив имел значительное улучшение от существующего теста SAB в выявлении epitopes антигена. Кроме того мы предприняли попытку сопоставить структуру шаблона HLA-DQ, в которой мы отметили, по крайней мере один epitope известных «горячих точек» в его β1 пряди, которые произошли в трех из пяти пациентов17реактивных epitopes в пяти трансплантации пациентам. Интригующе стренги β1 и HLA DQA1 - DQB1 расположенный в канавку презентации антигена вогнутые (рис. 8), местоположение, заведомо антигенной в контексте трансплантации неприятие32. Таким образом мы ожидаем, что будущие исследования нашего метода массив персонализированные антигена в расширенной трансплантации когортные исследования даст ценную информацию по антигенной горячих точек в молекул HLA. Каталог этих выявленных очагов, когда рассматривать в сочетании с высокоточной секвенирования ДНК ввода HLA генов между потенциальными донорами и получателями, в конечном счете поможет до трансплантации решения через приемлемые несоответствие программ 33, призван более эффективно избегать определенные несоответствия в близости каталогизированных горячих точках.

В целом наши оригинальные исследования17 в изучении персонализированный дизайн массива антигена для обнаружения конкретных анти HLA alloantibodies был первым в своем роде. В исследовании основное внимание уделялось возможности массива проектирования и реализации, который послужил прототипом для потенциальных будущих технологий. Наши экспериментальные исследования не только созданные обнадеживающие результаты из клинических образцов, но также позволило нам оценить общую стоимость и скорость теста. Себестоимость производства одной персональной массива в нашей текущей настройки лаборатории меньше 1000 долларов, что является единовременные расходы, так как массив может затем использоваться с течением времени в до 20 раундов reprobing циклов без потери производительности. Вполне возможно, что дополнительного тестирования протокола массива с более широкой группой субъектов трансплантации будет усовершенствовать метод, которые могут быть использованы один день в клинической практике.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Конфликты интересов объявил.

Acknowledgments

Мы благодарим Drs. Шон Li и Li Xing Западного университета в Канаде за их любезное содействие с местом массив производства. Мы благодарны сотрудникам на ядре гистосовместимости и всеобъемлющей трансплантации центр из Северо-Западного университета для предоставления услуг образца. Эта работа частично поддерживает вспомогательные Совет Северо-Мемориальный госпиталь и Фондом запуска факультет, предоставляемую J.J. Северо-Западного университета.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peptide array INTAVIS Bioanalytical Instruments
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170
Non-fat milk Bio Rad Laboratories 1706404
TBST Santa Cruz Biotechnology 10711454001
Goat anti-human IgG–HRP  ThermoFisher Scientific A18811
Clarity Western ECL Substrate Bio Rad Laboratories 1705061
Restore Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientifics 21059
ChemiDoc gel imaging system Bio Rad Laboratories 1708265 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bradshaw, R. A., Dunn, P. P. Unambiguous high resolution genotyping of human leukocyte antigens. J Immunol Methods. (2017).
  2. Robinson, J., Halliwell, J. A., McWilliam, H., Lopez, R., Marsh, S. G. IPD--the Immuno Polymorphism Database. Nucleic Acids Res. 41, D1234-D1240 (2013).
  3. Tait, B. D. Solid phase assays for HLA antibody detection in clinical transplantation. Curr Opin Immunol. 21, (5), 573-577 (2009).
  4. Tait, B. D. Detection of HLA Antibodies in Organ Transplant Recipients - Triumphs and Challenges of the Solid Phase Bead Assay. Front Immunol. 7, 570 (2016).
  5. Gebel, H. M., Bray, R. A. HLA antibody detection with solid phase assays: great expectations or expectations too great? Am J Transplant. 14, (9), 1964-1975 (2014).
  6. Horton, R., et al. Gene map of the extended human MHC. Nat Rev Genet. 5, (12), 889-899 (2004).
  7. Duquesnoy, R. J. HLAMatchmaker: a molecularly based algorithm for histocompatibility determination I. Description of the algorithm. Hum Immunol. 63, (5), 339-352 (2002).
  8. Duquesnoy, R. J., Marrari, M. HLAMatchmaker-based definition of structural human leukocyte antigen epitopes detected by alloantibodies. Curr Opin Organ Transplant. 14, (4), 403-409 (2009).
  9. Wedel, J., Bruneau, S., Kochupurakkal, N., Boneschansker, L., Briscoe, D. M. Chronic allograft rejection: a fresh look. Curr Opin Organ Transplant. 20, (1), 13-20 (2015).
  10. Rostaing, L. P., Malvezzi, P. HLA-Incompatible Kidney Transplantation--Worth the Risk? N Engl J Med. 374, (10), 982-984 (2016).
  11. Gebel, H. M., Bray, R. A., Nickerson, P. Pre-transplant assessment of donor-reactive, HLA-specific antibodies in renal transplantation: contraindication vs. risk. Am J Transplant. 3, (12), 1488-1500 (2003).
  12. Haas, M. An updated Banff schema for diagnosis of antibody-mediated rejection in renal allografts. Curr Opin Organ Transplant. 19, (3), 315-322 (2014).
  13. Cecka, J. M., Reed, E. F., Zachary, A. A. HLA high-resolution typing for sensitized patients: a solution in search of a problem? Am J Transplant. 15, (4), 855-856 (2015).
  14. Tambur, A. R., Claas, F. H. HLA epitopes as viewed by antibodies: what is it all about? Am J Transplant. 15, (5), 1148-1154 (2015).
  15. Robinson, J., et al. The IPD and IMGT/HLA database: allele variant databases. Nucleic Acids Res. 43, D423-D431 (2015).
  16. Gabriel, C., et al. HLA typing by next-generation sequencing - getting closer to reality. Tissue Antigens. 83, (2), 65-75 (2014).
  17. Liu, P., et al. A Novel Method for Anti-HLA Antibody Detection Using Personalized Peptide Arrays. Transplant Direct. 2, (11), (2016).
  18. Frank, R., Overwin, H. SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes. Methods Mol Biol. 66, 149-169 (1996).
  19. Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. J Immunol Methods. 267, (1), 13-26 (2002).
  20. Amartely, H., Iosub-Amir, A., Friedler, A. Identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays. J Vis Exp. (93), (2014).
  21. Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).
  22. Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2, (6), 1333-1349 (2007).
  23. McBride, R., Head, S. R., Ordoukhanian, P., Law, M. Low-Cost Peptide Microarrays for Mapping Continuous Antibody Epitopes. Methods Mol Biol. 1352, 67-83 (2016).
  24. Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol Biol. 570, 67-76 (2009).
  25. Kaczmarek, I., et al. Donor-specific HLA alloantibodies: long-term impact on cardiac allograft vasculopathy and mortality after heart transplant. Exp Clin Transplant. 6, (3), 229-235 (2008).
  26. Claas, F. H. Clinical relevance of circulating donor-specific HLA antibodies. Curr Opin Organ Transplant. 15, (4), 462-466 (2010).
  27. Brown, N. K., Kheradmand, T., Wang, J., Marino, S. R. Identification and characterization of novel HLA alleles: Utility of next-generation sequencing methods. Hum Immunol. 77, (4), 313-316 (2016).
  28. Cino, E. A., Choy, W. Y., Karttunen, M. Conformational Biases of Linear Motifs. Journal of Physical Chemistry B. 117, (50), 15943-15957 (2013).
  29. Duquesnoy, R. J. Human leukocyte antigen epitope antigenicity and immunogenicity. Curr Opin Organ Transplant. 19, (4), 428-435 (2014).
  30. Lavinder, J. J., et al. Identification and characterization of the constituent human serum antibodies elicited by vaccination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (6), 2259-2264 (2014).
  31. Kloetzel, P. M. Antigen processing by the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, (3), 179-187 (2001).
  32. Filippone, E. J., Farber, J. L. The Humoral Theory of Transplantation: Epitope Analysis and the Pathogenicity of HLA Antibodies. J Immunol Res. 2016, 5197396 (2016).
  33. Claas, F. H., Witvliet, M. D., Duquesnoy, R. J., Persijn, G. G., Doxiadis, I. I. The acceptable mismatch program as a fast tool for highly sensitized patients awaiting a cadaveric kidney transplantation: short waiting time and excellent graft outcome. Transplantation. 78, (2), 190-193 (2004).
Персонализированные пептид массивы для обнаружения Alloantibodies HLA в трансплантации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).More

Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter