En strömlinjeformad protokoll för att utföra en omfattande biokemiska och strukturell karaktärisering av ett kolhydrat substrat bindande protein från Streptococcus pneumoniae presenteras.
Utvecklingen av nya antimikrobiella ämnen och vacciner för Streptococcus pneumoniae (pneumokocker) är nödvändiga för att stoppa den snabba ökningen flera resistenta stammar. Kolhydrat substrat bindande proteiner (SBPs) representerar livskraftig mål för utvecklingen av protein-baserade vacciner och nya antimikrobiella medel på grund av deras extracellular localization och centralityen av kolhydrat import för pneumokocker ämnesomsättning, respektive. Beskrivs här är en rationaliserad integrerad protokoll att genomföra en omfattande karakterisering av SP0092, som kan utökas till andra kolhydrater SBPs från pneumokocker och andra bakterier. Detta förfarande kan stöd struktur-baserade utformningen av hämmare för denna klass av proteiner. Presenteras i den första delen av detta manuskript är protokoll för biokemisk analys av termiska Skift assay, multi-vinkel ljusspridning (MALS), och storlek utslagning kromatografi (SEC), som optimerar stabilitet och homogenitet av provet riktade till kristallisering prövningar och så öka sannolikheten att lyckas. Den andra delen av den här proceduren beskriver karakterisering av SBP kristaller med en avstämbara våglängd avvikande diffraktion synkrotron beamline och data insamling protokoll för mätdata som kan användas för att lösa kristalliserad proteinet struktur.
S. pneumoniae (pneumokocker) är en grampositiv bakterie bosatt asymptomatiskt i de övre luftvägarna i människans luftvägar med möjligheten att migrera till normalt steril nischer orsakar öroninflammation, lunginflammation, sepsis, blodförgiftning, och meningit1,2. Dessutom är pneumokockinfektion den ledande orsaken till samhällsförvärvad pneumoni, som bidrar till en kliniska och ekonomiska bördan i världen3,4. Antibiotikaresistenta stammar av S. pneumoniae har spridit sig över hela världen och även om en sju-valent och en 13-valent konjugerat protein konjugerat vaccin har hjälpt minska graden av antimikrobiell resistens, ersättare stammar från Vaccinet har uppstått och har lett till ökade krav på forskning i utvecklingen av nya behandlingar för pneumokocksjukdom5,6,7,8.
Pneumokocker beror på socker som importerats från mottagande som ett kol källa9,10; verkligen ägnar det 30% av dess importera maskiner till transporten av 32 olika kolhydrater11,12,13. Dessa importörer inkludera minst åtta ABC-transportörer13. I ABC transportörer spelar de extracellulära SBPs en grundläggande roll i att bestämma specificiteten för liganden och presentera det för integrerad membran transportören för upptag i cellen. SBPs representera giltiga mål för design av nya vacciner och antimikrobiella medel eftersom de är ytproteiner och deras viktiga roll i cellulära processer.
Mål protein karakterisering och detaljerad beskrivning av strukturella funktioner som ligand fickor och interdomain flexibilitet, ger ett användbart verktyg för strukturbaserad design14,15. Röntgenkristallografi är metoden för val av strukturella karakterisering av proteiner vid nära atomär upplösning, men kristallisation är oförutsägbara, tidskrävande och inte alltid framgångsrik. Systematiska metoder har förbättrat framgång och viktiga faktorer är provets kvalitet och stabilitet. Framgången av kristallisering är influerad av protein kemiska egenskaper och prov förberedelse metod. Effekten av dessa kan bedömas och informeras av biokemisk karakterisering16,17.
En ytterligare komplikation för struktur-baserad design är kristallografiska fas problemet, som måste åtgärdas. Så mer protein strukturerar har blivit tillgängliga, kan många strukturer lösas genom metoden molekylär ersättning, som kräver en homologa strukturen18. Som SBPs presenterar en flexibel domänstruktur, kan molekylär ersättning också vara utmanande19. Om en strukturell modell som är tillräckligt lik målproteinet inte är tillgänglig, kan ett antal tekniker användas för att erhålla experimentella fasa20. Bland dessa metoden Single-våglängd avvikande Dispersion (SAD) har vuxit fram som den primära tekniken och har i stor utsträckning används för att lösa fas problem21. Användningen av metoden SAD har tidigarelagts vidare med förbättringar i maskinvara och programvara, samt data collection strategier för att möjliggöra identifiering och användning av svaga avvikande signaler för utfasning22,23, 24. Dessutom förskott i direkta metoder för lösa strukturer av makromolekyler, som tidigare krävde diffraktion data till atomär upplösning, kan nu utnyttjas genom att kombinera exempelvis stereokemiska kunskap som genomförts i programmet ARCIMOLDO25. En nyttig genomgång av metoder för att lösa problemet fas i kristallografi ges av Taylor26.
Här presenterar vi en rationaliserad protokoll för karakterisering av kolhydrat transport SBP, SP0092 av S. pneumoniae, integrera biokemiska och strukturella tekniker (figur 1). Detta stegvisa protokoll ger ett användbart exempel testfall strategier för att förbättra andelen framgångsrika strukturella studier på SBPs i allmänhet, som återfinns i alla riken av liv. I synnerhet protokollet understryker att karaktärisera den mest stabila Oligomera staten av proteinet i lösning i en snabb och effektiv metod, och möjliggör identifiering av de bästa arterna att följa upp för kristallisering experiment. Det finns över 500 SBP strukturer rapporterade i Protein Data Bank27, kan molekylär ersättning vara svårt på grund av den inneboende flexibiliteten i de två α/β-domänerna, som förbinds av en gångjärnet regionen19. Således, den andra delen av protokollet beskriver metoden ledsen för utfasning från bundna metalljoner, vilket är vanligt i SBPs, liksom införlivandet av selenometionin och användning av selen (Se) ledsen fasa.
3. Crystal karakterisering och röntgen datainsamling Crystal montering bereda frysskyddmedel lösning genom att lägga till 25% (v/v) av glycerol (slutlig koncentration) till kristallisation villkoret (ersätter därmed 25% vatten i inledande blandning) 38. Fyller en skum dewar med flytande kväve och placera den prov inhägnad del av en uni-puck i dewar. Låt den svalna till flytande kväve temperatur. Klippa och ta bort försegla tejpa från kristallisering plattan över drop där kristallerna bildas. Placera en droppe 1 µL frysskyddmedel lösning på en coverslide placerad i närheten av målet drop. Överföra valda kristallen från ursprungliga drop till frysskyddmedel lösning släppa med en nylon cryo-loop på en ryggrad standard bas monterad på en magnetisk trollstav 39 , 40. Snabbt överföra kristallen i frysskyddmedel listrutan till flytande kväve, placera öglan i den första tomma positionen av uni-pucken provhållaren. Upprepa (från tätning band skär steg) tills alla önskade kristaller skördas och lagras i uni-pucken provhållaren. Plats uni-pucken basera på uni-pucken med pucken staven och ta pucken till beamline (villkor flytande kväve). Varning: Extremt låg temperatur! Använda cryo-tången och pucken dewar lastmaskin att läsa in uni-puck(s) i beamline sample changer roboten dewar. Uni-pucken provhållaren kommer loss från bas locket lämnar prov loop innehavare upprätt i provet roboten dewar och därmed utsatta för det flytande kvävgasen och tillgänglig för sample changer roboten. Crystal karakterisering Obs: skördade kristallerna kan sedan undersökas för diffraktion kvalitet med hjälp av antingen en laboratorium röntgen källa eller på en synkrotronstrålning (SR) röntgen källa. Makromolekylär kristallografi (MX) linjer ger en avstämbara energikälla för att utnyttja avvikande diffraktion struktur lösning. I följande avsnitt, en serie av arbetsinstruktioner i linje med de experimentella funktionerna av Diamond Light Source MX linjer föreslås, men dessa riktlinjer kan också anpassas till MX linjer på andra synkrotroner världen över. Som ett första steg, det är nyttigt att antingen bekräfta eller identifiera avvikande scatterers i kristallen. Detta kan bekvämt uppnås genom att mäta en X-ray fluorescens spektrum från kristallen. Först kontrollera röntgen energin av beamline är tillräckligt hög för att väcka alla element som normalt kan förväntas för makromolekylära kristaller (14 keV eller högre). Använda programvaran beamline kontroll för att välja provet monteras av sample changer roboten; slingan centreras automatiskt i röntgen strålen och den crystal centrering kan bekräftas manuellt med beamline kontroll mjukvaran. Registrera en X-ray fluorescens spektrum med programvaran beamline kontroll: användaren väljer en exponeringstid och initierar mätning (fluorescens/fluorescens spektrum inställning, → kör, figur 2A). Beamline kontroll mjukvaran placerar automatiskt X-ray fluorescens detektorn i placera och bestämmer den minsta incidenten röntgen flux att få en läsbar signal på fluorescens detektorn. Förvärvade spektrumet analyseras sedan i ett automatiserat sätt med utsläpp toppar monteras på naturligt förekommande biologiska element. Dessa rutiner finns inom beamline kontroll programvara grafiska användargränssnittet (GUI) – GDA (www.opengda.org) på vårt företag och på synkrotroner i hela Europa 41 , 42. Om lämpliga element identifieras som kan utnyttjas för ett avvikande diffraktion experiment, utföra en X-ray absorption kanten energi sökning för att fastställa optimal våglängd för avvikande diffraktion uppgifter från kristallen: på beamline Kontrollera programvara, markerar du elementet och initiera sökningen (fluorescens/fluorescens Skanna inställning, → Atom namn, → kör, figur 2B). Observera: För en enda avvikande diffraktion experiment, toppen av absorption kanten används att maximera avvikande spridningen. Experimentell överväganden för att utföra ett flera våglängder avvikande diffraktion experiment har varit tidigare detaljerade 43. Att bestämma den crystal enhet cell parametrar, symmetri och diffraktionsgränsen, mäta tre röntgendiffraktion mönster 45° mellanrum med metoden svängning (Data insamling/Screening → kör ström, Figur 2 c). Beamline kontroll mjukvaran ger användaren ett val av svängningen vinkel och exponeringstid och möjlighet att ange procentuella överföringen av röntgen balken. För en standard crystal screening rekommenderas en svängning vinkel på 0,5 °, en exponeringstid på 0.5 s och 5% X-ray balk transmission. Uppmätta diffraktion bilderna analyseras automatiskt av rörledningen EDNA och returnerar en uppsättning strategier för insamling av en fullständig datauppsättning 22. Röntgen datainsamling Obs: användaren kan välja att samla in data i standard svängning eller omvänd beam läge, vilket gör Friedel kompisar registreras nära i tid och röntgen dos, och med ungefär samma absorption beteende möjliggör en mer exakt mätning av avvikande skillnader. Det sistnämnda är användbar särskilt om små avvikande skillnader förväntas eller proverna är strålning känsliga när de utför ett avvikande diffraktion experiment. Överväganden om de bästa data collection strategierna att använda har varit omfattande granskade 22 , 23 , 44 , 45 , 46 , 47. med beamline kontroll mjukvaran, importera data collection parametrarna som föreslagits av programmet strategi som kommer att ge: i. startposition ω-rotation axis ii. Svängningen bredd ω-axis rotation vinkel för varje diffraction bild iii. Exponeringstid för varje diffraction bild iv. Antal bilder för en komplett datamängd (indirekt definiera totala ω-axis rotationsvinkeln för hela datainsamlingen) v. andelen dämpning av röntgen balken att undvika överexponering och strålning skada Anmärkning: på vår institution, för Kör datainsamlingen, programvara rörledningarna för automatiserad behandling av insamlade data är väl etablerade: (i) diffraktion data reduceras (indexerade, integrerad och skalad) av xia2 rörledningen, som genererar reflektion mtz filer för användaren som indata för utfasning och struktur lösning/förfining 48. (ii) när en betydande avvikande signal detekteras under dataanalys, en första snabb automatisk struktur lösning pipeline (fast_ep) som använder SHELX försöker lösa tunga Atomen underkonstruktionen av experimentella fasa, som ger en stegvis elektron densitet karta där så är möjligt. En andra mer omfattande struktur lösning pipeline automatiskt åtar sig försöken att lösa och bygga kapitalstrukturenRe med oberoende programvara sviter 49 , 50 , 51 , 52; i fall där detta är framgångsrik, kommer användaren förses med en första modell och elektron densitet karta. Detta utgör grunden för användaren att slutföra förfining och validera modellen med de kristallografiska programserier val.
I detta papper, vi beskriva och validera ett integrerat protokoll för biokemiska och strukturell karaktärisering av kolhydrat SBPs med särskild tonvikt på proteiner från S. pneumoniae. Dock kan detta användas som ett standardförfarande för analys av andra SBPs från olika organismer och även andra orelaterade lösliga proteiner.
Den första delen av protokollet är inriktad på att tillhandahålla biokemiska information om protein stabilitet och Kvartär struktur, som kan utnyttjas vid utarbetandet av protein prover för kristallisering. I avsnittet termisk Skift analyser beskriver vi endast pH och NaCl koncentrationen variationer att upprätthålla den allmänna karaktären hos detta förfarande. Trots detta många andra buffert villkor kan testas på ett liknande sätt, till exempel inklusive någon kemisk förening som används som en stabiliserande tillsats: de faktiska ligand(s) som binder till en specifik SBP är särskilt anmärkningsvärt effektiva för att öka Tm av några grader Celsius31. I vissa fall kan denatureringen kurvor definieras dåligt på grund av låg signal eller en hög fluorescence bakgrund, som orsakas av protein aggregation eller delvis utspelas. Undvik detta genom kan en protein: färgämne titrering utföras för att optimera oklart denatureringen kurvorna. Om ingen förbättring erhålls, screening olika tillsatser som kan lindra stabiliteten av protein rekommenderas, och lämpliga skärmar har varit tidigare beskrivna54.
Vanligtvis de flesta SBPs är monomer i deras naturliga miljö, men som visas här multimerization kan uppstå vid de högsta koncentrationer som används i kristallisering experiment, oligomerisering beteende karakterisering som MALS och SEC är således viktigt att bedöma den mest gynnsamma stabil monodisperse oligomerisering staten för kristallisering. Det är dock svårt att förutsäga effekten av olika kemikalier som ingår i villkoret kristallisering på oligomerisering uppförandet av proteiner. Om SEK och MALS undersökningen visar omfattande aggregering av protein provet, vi rekommenderar följande för att minska sannolikheten att detta inträffar: använda färska protein prov (inte frysa-tinade) och utöka stabilisering analysen utförs med termisk Skift-analyser, tester möjliga tillsatser och milda tvättmedel som sista resurs, att minimera aggregering. I detta papper presentera vi grundläggande riktlinjer för kristallisering med hög genomströmning sparse matrix kommersiella kristallisering screening för att behålla den allmänna karaktären hos detta protokoll. Få högupplösta röntgendiffraktion proteinkristaller måste däremot iterativ finjustering för att optimera kristallisering villkoren vad gäller fällningsmedel koncentration, pH, tillsats av kemiska tillsatser, olika temperaturer, och andra faktorer förändrade jämvikt dynamiken mellan de crystal drop och reservoar16,17.
Den andra delen av protokollet beskriver karakterisering av protein kristallerna för att fastställa den optimala strategin för röntgendiffraktion datainsamling med särskilt fokus på förvärv av avvikande data för SORGLIGT fasa. Även om SBPs upprätthålla en liknande allmän arkitektur (och det finns många insatta 3D-strukturer potentiellt användbara som utgångsmaterial modeller), utfasning av dessa proteiner av metoden molekylär ersättning är inte alltid enkel på grund av variationer i den sekundärt strukturera element och den inneboende flexibiliteten av dessa proteiner. Därför vi föreslår metoden SORGLIGT och markera att dessa proteiner kan redan har intimt bundna metaller eller faktiskt icke-specifik bindning av metaller från kristallisering buffert villkorar, som kan ge en rad avvikande diffracting element som en standard steg i våra allmänna protokoll.
Avslutningsvis definierar detta protokoll en guidad standardarbetsflöde för förfaranden som möjliggör en detaljerad beskrivning av de biokemiska och strukturella funktionerna av SBPs som kan utnyttjas för att öka framgång struktur bestämning, samt påskynda strukturella karakterisering av SBPs i allmänhet.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner OPPF-UK för hjälp med kloning, Gemma Harris för SEC-gallerior och forskarna av linjer I03 och I04 på Diamond Light Source.
SelenoMethionine Medium Complete | Molecular Dimensions | MD12-500 | Based on a synthetic M9 minimal media supplemented with glucose, vitamins and amino acids with the exception of L-methionine. Other equivalent products are commercially available by other companies. |
MicroAmp Optical 96-Well plate | Applied Biosystems | 4306737 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems® 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers. |
SYPRO Orange | Molecular Probes | S6651 | SYPRO Orange Protein Gel Stain is a sensitive, ready-to-use fluorescent stain for proteins in 1D gels. Quite universal and well-established protein dye for hydrophobic regions. |
MicroAmp Optical Adhesive film | Applied Biosystems | 4311971 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate. It is ideal for optical measurement, because it gives low background. |
7500 Fast Real-time PCR System | Applied Biosystems | 4362143 | The Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System enables standard 96-well format high speed thermal cycling, significantly reducing your run time for quantitative real-time PCR applications, delivering results in about 30 minutes. The Upgrade Kit is available to upgrade a standard 7500 Real-Time PCR System to the Fast Configuration via a field service installation. Other RT-PCR machine can be used. Data export not easy for the old data analysis software. |
Superdex 200 increase 10/300 GL column | GE Healthcare | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL is a versatile, prepacked column for size exclusion chromatography in small-scale (mg) preparative purification as well as for characterization and analysis of proteins with molecular weights between 10 000 and 600 000, such as antibodies. Optimal separation ideal for high resolution biophysical techniques. |
DAWN HELEOS II | Wyatt | DAWN HELEOS II is the premier Multi-Angle static Light Scattering (MALS) detector for absolute characterization of the molar mass and size of macromolecules and nanoparticles in solution. The DAWN offers the highest sensitivity, the widest range of molecular weight, size and concentration, and the largest selection of configurations and optional modules for enhanced capabiliites. Other MALS detecting systems from other companies apart from Wyatt have not been tested, so no additional feedback can be provided. | |
Superdex 200 5/150 GL | GE Healthcare | 28906561 | Superdex 200 are prepacked size exclusion chromatography columns for high-resolution small-scale preparative and analytical separations of biomolecules. Superdex 200 has a separation range for molecules with molecular weights between 10 000 and 600 000. The peak separation is not as optimal as for the "increase" version but this model is ideal for the standard day by day use. |
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28989335 | HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade are prepacked XK columns designed for high-resolution preparative gel filtration chromatography. |
24 Well "Big" Sitting Drop Crystallization Plate | MiTeGen | XQ-P-24S-A | The 24 well "big" crystallization plate is used mainly for protein crystal screening by sitting drop vapor diffusion techniques, and for crystallization condition optimization. It has quite large reservoir well and sample container, which favor manual handling and big sized protein crystal growth. In addition, its flat surfaces are easily to be sealed by transparent tape or cover slips. |
PCT Pre-Crystallization Test | Hampton | HR2-140 | The PCT Pre-Crystallization Test is used to determine the appropriate protein concentration for crystallization screening. |
96 Well CrystalQuick | Greiner bio-one | 6098xx | Square-well plates have three crystallization wells per reservoir, making it possible to test 288 samples per plate. Generally used only for the inital screening because their squared edge make crystals fishing difficult. |
Uni-Puck | Molecular Dimensions | MD7-601 | The Universal V1-Puck (Uni-puck) is a sample pin storage and shipping container for use with the majority of automated sample mounting systems worldwide – includes the ACTOR, SAM and CATS systems amongst others (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI and across the USA) |
Standard Foam Dewar | Molecular Dimensions | MD7-35 | 5.7" diameter by 2.8" deep. 800mL capacity. |
Mounted CryoLoop – 20 micron | Hampton | HR4-955 | Mounted CryoLoops with 20 micron diameter nylon. These nylon loops are bonded to hollow, stainless steel MicroTubes™ that are used to mount, freeze, and secure the crystal during cryocrystallographic procedures and X-ray data collection. Different sizes exist and they can be adapted in lenght. They are quite versatile tools. |
CryoWand | Molecular Dimensions | MD7-411 | |
Puck dewar loading tool | Molecular Dimensions | MD7-607 | This tool is used to separate uni-pucks to load them into the robot dewar. It consists of two pieces: a Teflon tube part and a metal rod part. |