Summary
Vi præsenterer her, detaljerede protokollen blev vedtaget i BioMILD screening retssag for at udføre den cirkulerende mikroRNA klassificeringen Signaturtest for tidlig lunge kræft opdagelse.
Abstract
Udviklingen af en minimalt invasiv test, såsom flydende biopsi, for tidlig lunge kræft opdagelse i sin prækliniske fase er afgørende for at forbedre resultatet af denne dødelige sygdom. MicroRNA (miRNAs) er væv specifikke, små, ikke-kodende RNA'er regulering genekspression, der kan fungere som ekstracellulære budbringere af biologiske signaler stammer fra cross-talk mellem tumor og dens omgivende mikromiljø. De kunne således repræsenterer ideelle kandidater til tidlig påvisning af lungekræft. I dette arbejde foreslås en metodisk arbejdsproces for potentielle validering af en cirkulerende miRNA test ved hjælp af custom made mikrofluid kort og kvantitative Real-Time PCR i plasmaprøver af frivillige indskrevet i en lunge kræftscreening trial. Derudover siden udgivelsen af hæmolyse-relaterede miRNAs og mere generelle tekniske problemer kan påvirke analysen, præsenteres kvalitetskontrol foranstaltninger indgår i standardprocedurer også. Protokollen er reproducerbare og giver pålidelige kvantitative resultater; Når du bruger store klinisk serien, både præ analytisk og analytiske funktioner bør dog forsigtigt evalueres.
Introduction
Lungekræft er mest almindeligt diagnosticeret kræft verden over, tegner sig for omkring 25% af alle kræft diagnoser1. Trods den støt reduktion i lungekræft dødelighed i de sidste 2 årtier, hovedsagelig på grund af reduceret tobaksrygning, er lungekræft den hyppigste årsag til kræftdødsfald hos både mænd og kvinder. I 2017 forventes det, at tage højde for ca. 25% og 20% af de samlede kræftdødsfald i USA og Europa, henholdsvis1,2.
Da symptomerne ikke normalt forekommer i tidlig sygdom, er hovedparten af lungekræft diagnosticeret på sene stadier. Dette fører til en begrænset mulighed for terapeutisk intervention og dårlig effekt af behandlinger3. Derfor, mange videnskabelige indsats tager sigte på at identificere en effektiv test for tidlig lunge kræft opdagelse.
En bred vifte af screening forsøg viser, at brystet radiografi har ingen værdi i lunge cancer screening, mens lav-dosis beregnet tomografi (LDCT) er et bedre værktøj i forhold til røntgen til påvisning af tidlige fase lung cancer4. Desuden har det vist thatscreening med brug af LDCT reduceret lung cancer dødelighed op til 20% blandt nuværende og tidligere storrygere5. Disse data støtter brugen af lunge cancer screening i en høj risiko befolkning som defineret i retningslinjerne for flere faglige sammenslutninger4,6.
Af note, blandt de største bekymringer om LDCT screening, er der den høje sats af falsk-positive resultater og over-diagnose. At så det videnskabelige samfund er på udkig efter en strategi for at overvinde disse problemer og øge LDCT screening testens specificitet. Udvikling af non-invasiv supplerende biomarkører kunne være nyttigt her. Til dato, er der en omfattende liste over kandidat biomarkører under undersøgelsen, såsom miRNAs, celle-gratis DNA, gen methylering, små proteiner og andre7.
Blod-baserede biomarkører, herunder immunrespons biomarkører og cirkulerende miRNAs, er dem, når de mere avancerede validering fase8. Immunrespons biomarkører er baseret på den viden, som immunrespons mod begge intracellulær og overflade tumor antigener er bygget i lunge cancer patienter9. For eksempel, Ajona et al. evalueret af C4d, et forringet produkt af den klassiske supplement pathway i diagnose og prognose af lunge kræft10rolle. Ellers, et kommercielt tilgængelige autoantistoffer serum test undersøger syv tumor-relaterede antigener er valideret i patienter med ikke-småcellet lungecancer og viste 36% af sensibilitet og 91% af specificitet11. Immunrespons biomarkører er interessant, men yderligere valideringsundersøgelser er nødvendige for en potentiel klinisk anvendelse.
miRNAs er endogene lille ikke-kodende RNA'er med bevarede mekanisme og store funktionelle betydning hele dyre- og plantearter kongeriger. MiRNAs opgave at regulere protein Oversættelse: de undertrykke udtryk for et stort sæt af mål gener12. Det har været veldokumenteret at ændringer ofmiRNAs' udtryk bidrage til patogenesen af mest menneskelige kræft12,13,14. Derudover frigive både tumor og stromale celler miRNAs, stabiliseret med deres inkorporering i microvesicles eller gennem tilknytning til RNA-bindende proteiner, i kropsvæsker såsom plasma og serum15,16, urin17 , og spyt18. Cirkulerende miRNAs kan således afspejle host reaktionen og det dynamiske samspil mellem tumor og dens mikromiljø19. Tilsammen disse observationer har gjort cirkulerende miRNAs en lovende klasse af biomarkører for påvisning af menneskelige kræft.
Cirkulerende miRNAs kan påvises ved hjælp af forskellige metoder: microarray platforme20, kvantitative reverse transkription PCR (RT-qPCR)21, og næste generation sequencing (NGS)14,22. Forskellige udtryk profil undersøgelser baseret på de ovennævnte teknologier er blevet udviklet i de seneste år. Microarray er en høj overførselshastighed teknologi, stand til at analysere op til tusinder af miRNAs i én enkelt assay. Men det har lavere dynamikområde og specificitet i forhold til RT-qPCR eller NGS. Derudover microarray er en ikke-kvantitativ metode, derfor yderligere eksperimentelle efterprøvelse er krævede. Sekvens-baserede metoder kan tillade identifikation af ukendt miRNAs og egner sig især i en discovery fase. På den anden side NGS metoder er stadig dyrt og nødvendiggør specialudstyr og ekspert bioinformaticians, hvilket begrænser deres anvendelse i stor validering kohorter og i klinisk indstillinger23. RT-qPCR er i øjeblikket den mest vedtagne platform for cirkulerende miRNA påvisning i en diagnostisk/klinisk sammenhæng24. Der findes forskellige RT-qPCR teknologier til miRNAs analyse, men stem-loop RT efterfulgt af TaqMan PCR er den mest udbredte25. Denne teknik er meget følsom og præcis (single nucleotide forskelsbehandling) og har en høj dynamisk rækkevidde; men det giver mulighed for påvisning af kendte miRNAs kun.
MikroRNA kvalitetskontrol undersøgelse (miRQC undersøgelse) af Mestdagh et al. grundigt undersøgt Karakteristik af nogle kommercielt tilgængelige platforme for miRNAs profilering baseret på de tre ovennævnte teknologier26. Ved at analysere 196 miRNAs i væv og serumprøver, blev udførelsen af de forskellige platforme vurderet med hensyn til reproducerbarhed, følsomhed, nøjagtighed, specificitet og konkordans differentierede udtryksformer. Resultaterne har vist at platforme baseret på NGS og microarray teknologi havde en højere reproducerbarhed og specificitet, men RT-qPCR platforme var mere præcise, følsomme, og havde en højere opklaringsprocent, især for lav input RNA prøver, som kroppen væsker. RT-qPCR synes således at være den mest hensigtsmæssige metode til en potentiel anvendelse i rutinemæssig klinisk diagnostik.
I 2011 analyseret Sozzi et al. miRNA profil af plasmaprøver indsamlet fra frivillige indskrevet i en første LDCT screeningtrial (INT-IEO trial)27 og fire miRNA signaturer komponeret af gensidige forhold mellem 24 cirkulerende miRNAs blev genereret. Disse underskrifter var købedygtig skelne sygdommen frie individer fra patienter med nogen eller dødelig lungekræft tiden eller op til 2 år før LDCT disease detection28. I en yderligere papir, samme gruppe beskrevet for første gang miRNA signatur klassificering (MSC), opnås ved at kombinere fire miRNA underskrifter for at stratificere patienterne i tre risikoniveauer: høj, mellemliggende og lav. Sin kliniske anvendelighed blev valideret i et stort retrospektivt sæt af mere end 1.000 personer indskrevet i MILD screening retssag, en randomiseret undersøgelse, der sammenligner etårig eller toårig LDCT våben med en observation arm29. Ja, kombinationen af MSC og LDCT reduceret LDCT falsk positive rate af ca 5 gange og de tre MSC risiko grupperforbundet med samlet overlevelse.
Senere i 2013 på den "Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori" (Milano, det) en prospektiv screening retssag (BioMILD) gennemføre LDCT med plasma baseret MSC test blev lanceret. Frivillige indskrevet i BioMILD retssag gennemgå LDCT og blod tilbagetrækning, der behandles straks for at adskille plasma for miRNA profilering ved hjælp af custom made mikrofluid kort. Kombinationen af LDCT og MSC resultaterne definerer specifikke screening algoritme24.
I den nuværende arbejde, det hele metodologiske protokol, der bruges i BioMILD retssagen er beskrevet, startende fra blod prøve samling, til plasma isolation, RNA udvinding, og 24 miRNAs udtryk profilering ved hjælp af brugerdefinerede lavet RT-qPCR mikrofluid kort. I betragtning af den høje konsistens og reproducerbarhed, kan disse procedurer også bruges til udvikling af miRNA-baseret flydende biopsier i andre sygdomme.
Protocol
protokollen blev godkendt af en videnskabsetisk Komité i vores institution.
1. plasma prøve indsamling
- indsamle 10 mL fuldblod prøve i Vacutainer rør med spray-belagt K 2 EDTA og opbevares ved stuetemperatur.
Bemærk: For at minimere hæmolyse, adskille plasma inden for 2 h. Opbevar ikke fuldblod ved lav temperatur (dvs., 4 ° C) til at undgå termisk chok og celle lysis, der fører til en uspecifik miRNA frigivelse. - Inden for 1 h, adskille plasmaet ved en centrifugering begyndelse på 1,258 x g og 4 ° C i 10 min.
- Overføre plasma supernatanten i en 15 mL tube, omhyggeligt undgår kontakt med lymfatisk ringen.
- Centrifuge plasma endnu en gang på 1,258 x g og 4 ° C i 10 min.
- Plasma i 1,5 mL cryovials, undgå, indsamle plasma brøkdel i bunden af røret alikvot 1 mL.
- Gemme alle delprøver på − 80 ° C, undtagen én til evaluering af hæmolyse. Den molekylære analyser skal udføres inden for 5 uger.
2. Evaluering af hæmolyse ved spektrofotometrisk måling
- umiddelbart efter trinnet plasma adskillelse i en kuvette for spektrofotometri, gøre en 1:10 fortynding af plasmaprøve i 1 X PBS (fx, 100 µL plasma i 900 µL 1 X PBS) og blandes til at homogenisere den.
Bemærk: Plasmaprøve bør ikke fryses, før de spektrofotometriske målinger, som den fryse-optøning af prøven (og især i lipemic prøver), kunne danne flocculates, der forstyrrer den spektrofotometriske analyse. - Læse absorbans på 375 nm, 414 nm, 541 nm og 576 nm med en UV-Vis Spektrofotometer, med en baseline korrektion afgjort ved 750 nm og en lysvej på 10 mm. udføre en tom måling ved hjælp af 1 mL af 1 x PBS.
- Beregn forholdet mellem absorbans ved 414 nm og 375 nm; hvis højere end 1.4, overveje at prøve hemolyzed og gentage blod tilbagetrækning (QC1 i tabel 1).
3. Plasma Total RNA udvinding
- Forbered en 1-Thioglycerol/homogenisering (OMG) løsning med 20 µL af 1-Thioglycerol pr. mL af homogenisering løsning. Da 1-Thioglycerol er tyktflydende, omhyggeligt afpipetteres nøjagtig måling. Chill OMG løsning på is eller ved 2-10 ° C før du bruger det.
Bemærk: Brugsopløsning er stabilt på 2-10 ° C i 1 måned. - Suspendere den frysetørrede DNase jeg ved at tilføje 275 µL af nukleasen-gratis vand ind i hætteglasset og forsigtigt blandes (gør ikke vortex). Som en visuel støtte, tilføje 5 µL af blå farve til den rekonstituerede DNase og dispensere løsningen til engangsbrug delprøver i nukleasen-fri rør. Gemme rekonstitueret DNase jeg ved-30 ° C til -10 ° C.
- Starter fra 200 µL af plasma, tilføje 200 µL af opløsningen kølet OMG.
- Vortex 15-30 s til at sikre en fuldstændig homogenisering. Hvis skummende opstår, lad prøven bosætte sig på ice.
- Tilføje 200 µL af lysisbuffer og 25 µL af Proteinase K til den homogeniserede prøve og vortex for 20 s.
- Incubate prøver for 15 min i en thermomixer forvarmes ved 37 ° C.
- Indlæses en patron til hver prøve på dæk bakke instrument og placere plugger i den korrekte position.
- Overførsel af lysate til den relevante position i instrument patron.
- Tilføje 5 µL af DNase jeg løsning på den korrekte position i patronen.
- Tilføje 60 µL nukleasen-frit vand i bunden af hver eluering tube.
- Vælg den " RSC miRNA væv " metode og begynde automatiseret rensning køre. De total RNA prøver kan opbevares i − 80 ° C.
4. Taq-baserede RT
- bruge Taq RT Primer Pool med miRNAs af interesse for at konvertere RNA til cDNA med Taq mikroRNA Reverse transkription Kit.
- Forberede 12 µL af RT mastermix på is i en 1,5 mL microcentrifuge tube ifølge instruktionerne kit, ved hjælp af 6 µL af den brugerdefinerede Taq RT Primer Pool.
- Tilføje 3 µL af total RNA for en endelige mængden af 15 µL, og der inkuberes i isbad i 5 min.
- Læg RT reaktionen på en thermo-cycler konfigureret som følger: 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 min, 85 ° C i 5 min, og hold på 4 ° C.
Bemærk: CDNA kan være butik på -15-20 ° c i mindst én uge.
5. Før forstærkning
- Mix 2.5 µL af hvert produkt, RT med 12,5 µL af Taq Master Mix 2 x, 3,75 µL Custom Taq pool og 6,25 µL nukleasen-gratis vand, for en samlet maengde paa 25 µL.
- Udfører før forstærkning reaktion ved hjælp af en thermo cycler efter følgende varmeprofilen: 95 ° C i 10 min, 55 ° C i 2 min., 72 ° C i 2 min., 12 cyklusser af 95 ° C til 15 s og 60 ° C i 4 min , hold derefter på 99,9 ° C i 10 min og ved 4 ° C.
- Fortyndes produktet ved at tilføje 175 µL af 0,1 X TE, pH 8,0.
Bemærk: Det fortyndede produkt kan være butik på -15-20 ° c i mindst én uge.
6. RT-qPCR reaktion på Custom Taq Array mikroRNA kort
- Brug 384-godt microfluidicCustom Taq Array mikroRNA Card at måle plasmaniveauer af de 24 specifikke miRNAs (spottet i to eksemplarer) på 8 prøver samtidigt. MiRBase ID (v21) for de 24 miRNAs er: har-miR-101-3 p, har-miR-106a - 5p, har-miR-126-3 p, har-miR-133a - 3p, har-miR-140-3 p, har-miR-140-5 p, har-miR-142-3 p, har-miR-145-5 p, har-miR-148b - 3p, har-miR-15b - 5p, har-miR-16-5 p, har-miR-17-5 p, har-miR-197-3 p, har-miR-19b - 3p, har-miR-21-5 p, har-miR-221-3 p, har-miR-28-3 p, har-miR-30b - 5p, har-miR - 30c - 5p, har-miR-320a, har-miR-451a, har-miR-486-5 p, har-miR-660-5 p, og har-miR-92a - 3p.
- Mix 1.13 µL af de fortyndede PreAmp prøve med 56,25 µL af 2 X Taq Universal Master Mix og 55.69 µL nukleasen-frit vand i en 0,5 mL tube.
- Indlæses op til 8 PCR-mastermix på Custom Taq Array mikroRNA kort.
- Der centrifugeres ved 311 x g i 2 min.
- Forsegle den brugerdefinerede kort med array card sealer.
- Køre i Real-Time reaktion ved hjælp af en Real-Time PCR System ændre parametrene cykling som følger: 94,5 ° C i 10 min, 40 cyklusser af 97 ° C til 30 s og 59.7 ° C til 60 s.
7. Data ekstrapolation og nøgletal Generation
- brug softwaren til at få rå Ct værdier, angive en automatisk baseline til at fjerne baggrunden signaler og en fast grænse på 0,15 for alle assays og prøver. Fjerne steder med dårlig forstærkning kurver og/eller dårlig passiv reference signaler.
- Eksportere rå Ct værdier i " .xls " format og bruger værdien Ct betyde to dubletter for yderligere analyse.
- Korrelat miRNAs ' udtryk niveauer til historiske målinger på klinisk undersøgelse prøver (Tabel 2). Hvis mindst 50% af prøverne på hvert brugerdefineret gjort mikrofluid resultere i en Pearson ' s korrelation < 97,5, Gentag kortet (QC2 i tabel 1).
- Beregn den − ΔCts mellem alle miRNAs, svarer til log2 værdierne af miRNA nøgletal.
8. Evaluering af hæmolyse af den relaterede miRNA signatur
- Generer hæmolyse-relaterede miRNA signatur benytter de følgende miRNA nøgletal med respektive cut-offs (log2 værdier) for korte opbevaring plasmaprøver (1-5 uger på − 80 ° C): miR-126/451 < − 0,07, 15b/451 < − 3,67, 221/451 < − 3,18, 30b/451 < − 1.1, 126/486-5p < − 0,33, 15b/486-5 p < − 3,86, 221/486-5 p < − 3,17, 30b/486-5 p < − 1.42, 126/92a < 1,8, 15b/92a < − 1,8, 221/92a < − 1,04, 30b/92a < 0.87, 126/16 < − 2,85, 15b/16 < − 6,33, 221/16 < − 5.9, 30b/16 < − 3.68.
- Klassificeringen som hemolyzed prøver hvor mindst 50% af nøgletal (8 ud af 16) overstige respektive cut-off (QC3 i tabel 1).
9. Definitionen af risiko-niveau: høj, mellemliggende og lav
- Definer de fire signaturer af miRNA nøgletal komponere MSC som rapporteret i figur 3: risikoen for sygdom (RD), risiko for aggressive sygdom (RAD), tilstedeværelsen af sygdom (PD) og tilstedeværelse af aggressiv sygdom (PAD).
- For hver signatur, definere nøgletal overstiger den respektive cut-off værdi for kort opbevaring plasmaprøver (1-5 uger på − 80 ° C). Antallet af overstiger nøgletal skulle betragtes som positive er 9 ud af 27 for RD og PD og 14 ud af 28 for RAD og PAD ( fig. 3 A).
- Tilskriver til hver prøve det respektive MSC risikoniveau som følger: lav risiko, hvis RD neg ∩ PD neg ∩ RAD neg ∩ PAD neg; mellemliggende risiko hvis RD pos ∪ PD pos ∩ RAD neg ∩ PAD neg; eller høj risiko hvis RAD pos ∪ PAD pos ( fig. 3 B).
Representative Results
BioMILD retssag er en prospektiv undersøgelse for tidlig påvisning af lungekræft med det formål at teste effektiviteten af et kombineret LDCT-MSC tilgang som første-linje screeningstest i en stor kohorte af storryger individer. En klasse af risiko er tilskrevet hver volontør på grundlag af miRNA-test, som evalueres nøgletal mellem 24 plasma cirkulerende miRNAs. Som i vid udstrækning rapporterede30,31,32er hæmolyse et kritisk spørgsmål for analysen af cirkulerende miRNA, da falske resultater kunne opnås på grund af en uspecifik frigivelse af miRNAs af blodlegemer. I den foreslåede metodisk arbejdsproces, en pre analytiske kvalitetskontrol trin (QC1 i tabel 1) for at identificere hemolyzed og dermed ikke-analyzable, plasmaprøver blev beskrevet. Figur 1 rapporter en spektrofotometrisk analyse af hemolyzed (fig. 1A) og ikke-hemolyzed (figur 1B) plasmaprøver med respektive A414/A375 værdier. I klinisk sammenhæng var resultatet af en molekylær test er afgørende for frivillige ledelse, denne QC1 tillader gentagne blod prøveudtagning og i de fleste tilfælde, gendannelse af prøven.
Efter molekylære forarbejdning, skal RT-qPCR ydeevne vurderes præcist for at identificere eventuelle tekniske problemer. Figur 2 A viser en RT-qPCR med en lav ydeevne på grund af en dårlig passiv reference signal. I dette tilfælde genpålæsning pre forstærkning produkt til et nyt mikrofluid kort anbefales. Når RT-qPCR fungerer godt, som i figur 2B, kortet provenuet til den første post analytiske kvalitetskontrol skridt til at sikre, at miRNA udtryk værdier er sammenlignelige med de historiske måling (QC2 i tabel 1). Hvis trinnet QC2 mislykkes, et teknisk problem kan være opstået under reverse transkription eller i pre forstærkning reaktioner, og det er bekvemt at gentage hele molekylære behandling med udgangspunkt i reverse transkription.
Den sidste kvalitetskontrol trin (QC3 i tabel 1) evaluerer hæmolyse også på molekylært niveau. Udtrykket niveauer af 4 erytrocyt-specifikke miRNAs (mir-16, mir-451, mir-486-5 p og mir-92a) var i forhold til dem af 4 ikke-hæmolyse relaterede miRNAs (mir-126, mir-15b, mir-221 og mir-30b), generere hæmolyse-relaterede miRNA signatur består af den 16 (4 x 4) miRNA nøgletal. Positive prøver er klassificeret som hemolyzed, mens negative prøver videre til den endelige MSC risiko niveau klassificering som beskrevet i protokollen afsnit 9 og figur 3.
Figur 1: Spektrofotometriske analyse af frisk plasmaprøver. Spektrofotometriske profiler af (A) 2 hemolyzed og (B) 2 ikke-hemolyzed plasmaprøver, måling af absorbans forholdet mellem bølgelængder A414 og A375. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : RT-qPCR ydeevne i mikrofluid kort analyse. Forstærkning og flerkomponent parceller (A) at sammenligne fattige og (B) god kvalitet mikrofluid kort. Alle 24 miRNAs og en enkelt exemplifying miRNA er rapporteret i hvert panel. De stand parceller illustrere de passive reference signaler forekommer i disse RT-qPCR reaktioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: MSC algoritme for risiko stratificering. Repræsentative resultater i betragtning 6 plasmaprøver fra volontører tilmeldt BioMILD screening retssag. ()A) miRNA-nøgletal signaturer af risikoen for sygdom (RD), risiko for aggressive sygdom (RAD), tilstedeværelsen af sygdom (PD), tilstedeværelse af aggressiv sygdom (PAD), og tilsvarende cut-off værdier (log2) for plasmaprøver opbevares ved-80 ° C for på mindst 1 uge og op til 5 uger. (B) kombination af de fire signaturer til at stratificere analyzable prøver i høj (H), mellemliggende, (I) og lav (L) MSC risikerer niveau. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Faldgruber og udfordringer af de metodologiske arbejdsproces
Som BioMILD er den første fremadrettede undersøgelse analyserer cirkulerende miRNAs som et diagnostisk redskab, blev tærskler og cut-offs udnyttet for data-analyse genereret fra retrospektiv serie. For at løse spørgsmålet om forskellige storage interval af plasmaprøver, kan parametrene, der raffineres muligvis opnå en stigning på MSC ydeevne. Ikke desto mindre, før du starter miRNAs analyse, flere aspekter af den samlede proces skal vurderes omhyggeligt, såsom inklusionskriterierne, prøve indsamling og forarbejdning, og bioinformatik algoritme vedtaget til dataanalyse. De følgende afsnit vil fokusere på de mest kritiske punkter for den arbejdsgang, der er beskrevet i den nuværende papir, tage fat på de store spørgsmål for hvert enkelt trin og derefter foreslå strategier for at overvinde dem.
Studere befolkning
Tilmelding kriterier for BioMILD screening retssag er: 50-75 år gamle, tunge nuværende eller tidligere (mindre end 10 år) rygere med mindst 30 pack-år og ingen forudgående historie af kræft inden for 5 år. I denne befolkning var den anslåede lung cancer prævalens og incidens pr. år omkring 1% og 0,7%, henholdsvis. Anvende MSC test som beskrevet i den foreslåede protokol, bør befolkningens analyseret opretholde lignende karakteristika. Især indebærer QC2 trin ovenfor beskrevne sammenligning med den givne historiske data fra en lignende befolkning. Mens en korrelation nedenfor 97,5 kunne være vejledende for tekniske problemer, på den anden side er de fleste individer med ændrede cirkulerende miRNA niveauer afspejler risikoen for at få lungekræft faktisk under denne tærskel. Med andre ord, hvis QC2 skridt med de parametre, der er rapporteret her er anvendt en befolkning på højere risiko for at udvikle lungekræft, kan udelukke acceptable prøver. Nye, korrekt henvisning bør derefter være defineret parametre der er specifikke for hver befolkning analyseret ifølge forventede resultater.
Indsamling og hæmolyse
Udtagning af biologiske prøver er en afgørende pre analytiske trin, da det kan forringe prøve kvalitet og egenskaber, og dermed ændre de endelige resultater af analyser. Vedrørende blodprøver er det vigtigt at indsamle frisk blod og behandle modellen så hurtigt som muligt. Prøverne bør hverken være opbevares ved 4 ° C eller frosne efter blod tilbagetrækning, eftersom nedfrysning og optøning passager kan fremkalde celle lysis (hæmolyse) og RNA nedbrydning. For at minimere hæmolyse proces, er det foreslået for at adskille plasma inden for 2 h fra blod samling31 .
Hæmolyse er i vid udstrækning opdeling af røde blodlegemer (RBC) og deraf følgende frigivelse af deres indhold i det omgivende miljø. Dette kunne være et problem for cirkulerende miRNAs test fordi frigivelsen af røde blodlegemer intracellulære indhold dramatisk ændrer mikroRNA profil i blod, potentielt påvirker nøjagtigheden af plasma-baseret analyse30.
At kunne identificere også minimal niveauer af hæmolyse i plasmaprøver er afgørende for undersøgelser baseret på cirkulerende miRNAs som biomarkører. Hæmolyse kan i første omgang blive vurderet ved besigtigelse, siden efter de to centrifugering trin farven på plasma kan variere fra gul til rød for meget hemolyzed prøver. Simpel besigtigelse kan dog ikke være følsomme nok i forbindelse med molekylær biomarkør forskning.
En enkel, pre analytisk metode til at identificere hemolyzed plasmaprøver er spektrofotometrisk måling på bølgelængde (λ) = 414 nm vigtigste oxyhæmoglobin peak absorbans, efter passende justering for nogen anden kilde af interferens. Derfor, vi normaliseret 414 nm peak til værdien absorbans på 375 nm, betegnende for den lipidic indhold33. Alternativt, eller bedre, i kombination, en lipemia-independenthemolysis score (HS) kan være brugt34. Denne spektrofotometrisk baseret procedure kan identificere mindst 6,1 mg/dL gratis hæmoglobin. Ellers kan hemolyzed prøver identificeres gennem påvisning af erytrocyt-specifikke miRNAs. Da selv en meget lille procentdel af hæmolyse kan fremkalde en betydelig stigning i erytrocyt-specifikke miRNA niveauer32, identificeret Fortunato et al. et bestemt hæmolyse-relaterede signatur baseret på 16 miRNAs-nøgletal, der effektivt kan klassificere hæmolyse i plasma prøver33. Alle de nævnte assays kan anvendes i kombination siden absorbans forholdet 414/375 og/eller HS er vedtaget i en pre analytiske fase spare yderligere omkostninger, mens måling hæmolyse-relaterede miRNAs kan bruges i en post analytiske fase som en kvalitetskontrol skridt.
Cirkulerende miRNAs Isolation og RNA renhed
Udvinding RNA procedure er en meget indflydelsesrige skridt til succes for de efterfølgende analyser. Start fra en lav input prøve, såsom plasma, skal udtræk være så effektiv som muligt for at sikre en nøjagtig kvantificering af miRNAs. Plasma er kendetegnet ved høje koncentrationer af mange proteiner, herunder nukleaser og andre komponenter, som kan forstyrre downstream enzymatiske reaktioner af RT-qPCR og kunne påvirke cirkulerende miRNAs påvisning. Flere udvindingsmetoder har været anvendt i disse typer af undersøgelser, men i almindelighed, økologisk ekstraktion efterfulgt af silica-baserede RNA berigelse tillader fjernelse af plasma hæmmere bedre så TRIzol alene35. Ikke desto mindre, i de sidste par år, manuelle udvinding er blevet erstattet af automatiske ekstraktion. Den mindre risiko for kontaminering, højere reproducerbarhed og økonomiske tid brug er de vigtigste fordele ved automatiserede systemer i forhold til manuel isolering protokoller. Desuden viste automatiseret udvindingsmetoder de højeste miRNA beløb fra blodprøver og den højeste effektivitet i forhold til manuel protokoller36.
Normalisering spørgsmål
Normalisering af miRNA plasmaniveauer er stadig et kontroversielt emne. Faktisk, forskelle i stikprøven kvalitet eller mængde kan interferere med identifikationen af ægte ændringer i miRNAs udtryk niveauer skyldes tilstedeværelsen eller risikoen for sygdomme, og dermed fører til tvetydige data fortolkninger og vildledende konklusioner. Hidtil har har manglen konsensus resulteret i forskellige normalisering strategier37.
Total RNA ekstraheret fra plasmaprøver er normalt under tærsklen på standard kvantificering metoder såsom UV spektrofotometri eller fluorescens-baserede spektrofotometri, således udelukker RNA masse standardisering38. Derfor bør et fast volumen i stedet for et fast beløb på elueret RNA vælges som input for RT reaktion39.
Husholdning udskrifter anvendt til miRNA analyse i vævsprøver, er som RNU48 og RNU6, ikke egnet til normalisering ekstracellulære miRNA målinger, som de begge ikke er altid kan spores i omløb, på grund af RNase-medieret nedbrydning40, og er også dereguleret i en sygdoms-specifikke måde37. Det er uklart, om nogen cirkulerende miRNAs kunne reelt kan bruges som reference kontrolelementer. For eksempel, er miR-16 ofte foreslået for husholdning, men dndre undersøgelser har vist, at det er liberaliseret i plasmaprøver af kræft patienter28,37. Derudover er miR-16 niveauer stærkt ramt af hæmolyse30.
Mens for høj overførselshastighed assays måling flere miRNAs og normalisering af betyder udtrykket værdien er generelt accepterede41, når et begrænset antal miRNAs skal analyseres, kan ikke denne normalisering fremgangsmåde anvendes. For at omgå problemet normalisering, etableret Boeri et al. tidligere en algoritme baseret på gensidige nøgletal blandt 24 miRNAs28. En sådan fremgangsmåde, selvom det er meget nyttigt for udviklingen af den diagnostiske værktøj, tillader ikke let skelne effektivt ændret miRNAs der muligvis har en rolle i tumor udvikling, og dermed identificere miRNAs som fungerende kalibratorer. En anden effektiv strategi, vedtaget af gruppen af Bianchi et al. , udviklet en serum miR-Test til lung cancer tidlig påvisning, var baseret på normalisering på den geometriske middelværdi af en gruppe af 6 "husholdning serum-miRNAs" varierende mindre blandt prøver og klasser af patienter42.
Funktioner af miRNA-baseret flydende biopsi og potentielle anvendelse
Plasma-baserede MSC er en molekylær non-invasiv test undersøgt for tidlig diagnosticering af lungekræft i storrygere. MSC test kan identificere mellemliggende eller højrisiko emner før lunge kræft opdagelse af LDCT, med høj følsomhed (sø, 87%) og negative prædiktive værdi (NPV, 99%). Specifikt, kunne MSC gennemføre LDCT screening ved at reducere falsk-positive resultater til 3,7%, fra 19,7% til LDCT alene29. MSC test har også vist sig for at have en god prognostiske ydeevne, når de overvejer kun lunge kræftpatienter, og kunne bruges som et overvågningsværktøj, alene eller i kombination med andre parametre for klinisk patologisk43,44. Potentielt, kan MSC test give større sammenhæng i lunge kræft diagnostiske algoritmer, dermed faldende screening omkostningseffektivitet.
Udover MSC, er andre ikke-invasiv test til tidlig lunge kræft opdagelse blevet rapporteret. Bianchi mfl. foreslået en cirkulerende miR-Test baseret på en 34-miRNA signatur45, så reducerede det til en 13 miRNA signatur42. Serum prøver fordiscovery og validering blev indhentet fra kontinuerlig Observation af rygning fag (KOSMOS) LDCT screening forsøg, udført på den Europæiske Institut for onkologi (IEO, Milano, Italien). MiR-Test viste 78% nøjagtighed for lunge kræft opdagelse i højrisiko frivillige. Mellem de 13 serum-miRNAs og 24 komponere MSC, kun 5 miRNAs overlappende (miR-92a, miR-30b, miR - 30c, miR-148a og miR-140-5 p). Dette kunne skyldes, at de forskellige slags start prøver (serum vs plasma) og data udarbejdelse. I virkeligheden, for miR-Test var de forfatterne valgte 6 miRNAs opfører sig som husholdning i serum, hvoraf 3 også blandt MSC miRNA nøgletal (miR-15b, miR-19b og miR-197). Ikke desto mindre, MSC i plasma og miR-Test i serumprøver mere dybt validere anvendelsen af miRNA-baseret flydende biopsi til påvisning af lungekræft.
MiRNAs profilering for identifikation af lunge kræft biomarkører har været udføres også på sputum prøver46. Spyt kan samles nemt og miRNA udtryk niveauer synes at være ekstremt stabil i det. Men, lunge cancer screening frivillige er ældre end 50-55 år og er storrygere med co-morbiditeter som KOL, hvorved sputum vanskeligt at opnå. Faktisk, blandt de forskellige kropsvæsker, plasma er et af de bedste alternativer til at undersøge den potentielle rolle af miRNAs som (men ikke begrænset til) lung cancer biomarkører.
Samlet set kan fremgangsmà ¥ den i det foreliggende papir være relevante i forbindelse med forskellige sygdomme, med ingen begrænsning i typen af patologi undersøgt (fra kræft til nervesystemet og hjerte-kar-sygdomme eller diabetes) og formålet med klinisk brug (en biomarkør for diagnose, prognose eller endda svar til behandling).
Disclosures
Gabriella Sozzi, Mattia Boeri og Ugo Pastorino er co opfinderne af tre patentansøgninger licens til Gensignia Life Sciences, vedrørende miRNA signatur offentliggjort i denne artikel. Alle resterende forfatterne erklære nogen interessekonflikter i forbindelse med det arbejde, der er indsendt.
Acknowledgments
Forfatterne takke Paola Suatoni, Elena Bertocchi, Carolina Ninni, Annamaria Calanca, og Chiara Banfi for håndtering frivillige i forsøgene og for administrativ bistand; og Claudio Jacomelli og Claudio Citterio for data management. Arbejdet var støttet af den italienske sammenslutning for kræftforskning [investigators Grants No. 15928 at op, 14318 GS, og 12162 (særligt Program "Innovative værktøjer til vurdering af kræft og tidlig diagnose", 5 x 1000)]; det italienske sundhedsministerium [Grant nr. RF-2010]; Grant UO1 CA166905 fra National Cancer Institute (USA). MB blev støttet af en Fondazione Pezcoller Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Lonza | BE-17-516 | |
| 20xTE Buffer, pH 8.0 | Molecular probe | T11493 | Dilute the 20X stock solution to have the final concentration of 0,1X in Nuclease-free water |
| Nuclease-free water | |||
| Maxwell RSC miRNA Tissue Kit | Promega | AS1460 | The kit contains Homogenization Solution, DNase I, Proteinase K, Lysis Buffer and cartridges. For 1-Thioglycerol, inhalation and contact with skin and eyes should be avoided. Use it under a Fume Cabinet. |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | 4366596 | |
| Custom TaqMan RT Primer Pool | Thermo Fisher | 4459649 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix 2X | Thermo Fisher | 4391128 | |
| Custom TaqMan PreAmp pool | Thermo Fisher | 4459657 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, No UNG 2x | Thermo Fisher | 4440048 | |
| Custom TaqMan Array MicroRNA Cards | Thermo Fisher | 4449137 | Bring the Custom TaqMan Array MicroRNA Cards to room temperature before to load samples |
| Vacutainer Safety-Lock Blood Collection Set | Becton Dickinson | 367286-364815 | |
| Vacutainer plastic spray-coated K2EDTA tube. | Becton Dickinson | 366643 | Lavender BD Hemogard closure |
| Cuvette PS semi-micro | VWR/PBI | 643-0326 | Light path 10 mm |
| NanoDrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer | Thermo Fisher | ||
| Cryogenic vials 1.5 ml | Sigma-Aldrich | Z359033 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | Bring the centrifuge to 4 °C before starting plasma collection | |
| Heraeus Multifuge 3S+ Centrifuge | Thermo Fisher | D-37520 | |
| Vortex Mixer | Velp Scientifica | F202A0173 | |
| ThermoMixer T- shaker | Euroclone | A00564 | Bring the Thermo Mixer to 37 °C before starting RNA extraction |
| Maxwell RSC Instrument | Promega | AS4500 | |
| GeneAmp PCR System 9700 thermo-cycler | Thermo Fisher | ||
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher | ||
| ViiA 7 RUO software | Thermo Fisher | ||
| Arrey Card Staker/Sealer | Thermo Fisher | 4331770 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
- Malvezzi, M., et al. European cancer mortality predictions for the year 2017, with focus on lung cancer. Ann Oncol. , 10 (2017).
- Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (4), 271-289 (2016).
- Kanne, J. P. Screening for lung cancer: what have we learned. AJR Am. J Roentgenol. 202 (3), 530-535 (2014).
- Aberle, D. R., et al. Reduced lung-cancer mortality with low-dose computed tomographic screening. N Engl J Med. 365 (5), 395-409 (2011).
- Wender, R., et al. American Cancer Society lung cancer screening guidelines. CA Cancer J Clin. 63 (2), 107-117 (2013).
- Molina-Vila, M. A., et al. Liquid Biopsy in Non-Small Cell Lung Cancer. Front Med (Lausanne). , 69 (2016).
- Sozzi, G., Boeri, M. Potential biomarkers for lung cancer screening. Transl Lung Cancer Res. 3 (3), 139-148 (2014).
- Shepherd, F. A., Douillard, J. Y., Blumenschein, G. R. Immunotherapy for non-small cell lung cancer: novel approaches to improve patient outcome. J Thorac Oncol. 6 (10), 1763-1773 (2011).
- Ajona, D., et al. Investigation of complement activation product c4d as a diagnostic and prognostic biomarker for lung cancer. J Natl Cancer Inst. 105 (18), 1385-1393 (2013).
- Boyle, P., et al. Clinical validation of an autoantibody test for lung cancer. Ann Oncol. 22 (2), 383-389 (2011).
- Hayes, J., Peruzzi, P. P., Lawler, S. MicroRNAs in cancer: biomarkers, functions and therapy. Trends Mol Med. , (2014).
- Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat Rev Genet. 10 (10), 704-714 (2009).
- Iorio, M. V., Croce, C. M. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review. EMBO Mol Med. 4 (3), 143-159 (2012).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 145-156 (2014).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (30), 10513-10518 (2008).
- Hanke, M., et al. A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker: microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancer. Urol Oncol. 28 (6), 655-661 (2010).
- Park, N. J., et al. Salivary microRNA: discovery, characterization, and clinical utility for oral cancer detection. Clin Cancer Res. 15 (17), 5473-5477 (2009).
- Boeri, M., Pastorino, U., Sozzi, G. Role of microRNAs in lung cancer: microRNA signatures in cancer prognosis. Cancer J. 18 (3), 268-274 (2012).
- Castoldi, M., et al. A sensitive array for microRNA expression profiling (miChip) based on locked nucleic acids (LNA). RNA. 12 (5), 913-920 (2006).
- Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), 179 (2005).
- Schulte, J. H., et al. Deep sequencing reveals differential expression of microRNAs in favorable versus unfavorable neuroblastoma. Nucleic Acids Res. 38 (17), 5919-5928 (2010).
- Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. Biomed Res Int. , 731479 (2015).
- Boeri, M., et al. Recent advances of microRNA-based molecular diagnostics to reduce false-positive lung cancer imaging. Expert Rev Mol Diagn. 15 (6), 801-813 (2015).
- Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50 (4), 244-249 (2010).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Pastorino, U., et al. Early lung-cancer detection with spiral CT and positron emission tomography in heavy smokers: 2-year results. Lancet. 362 (9384), 593-597 (2003).
- Boeri, M., et al. MicroRNA signatures in tissues and plasma predict development and prognosis of computed tomography detected lung cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3713-3718 (2011).
- Sozzi, G., et al. Clinical Utility of a Plasma-Based miRNA Signature Classifier Within Computed Tomography Lung Cancer Screening: A Correlative MILD Trial Study. J Clin Oncol. 32 (8), 768-773 (2014).
- Pritchard, C. C., et al. Blood cell origin of circulating microRNAs: a cautionary note for cancer biomarker studies. Cancer Prev Res (Phila). 5 (3), 492-497 (2012).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6 (9), 24145 (2011).
- Kirschner, M. B., et al. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4 (94), (2013).
- Fortunato, O., et al. Assessment of circulating microRNAs in plasma of lung cancer patients. Molecules. 19 (3), 3038-3054 (2014).
- Appierto, V., et al. A lipemia-independent NanoDrop((R))-based score to identify hemolysis in plasma and serum samples. Bioanalysis. 6 (9), 1215-1226 (2014).
- Kim, D. J., et al. Plasma components affect accuracy of circulating cancer-related microRNA quantitation. J Mol Diagn. 14 (1), 71-80 (2012).
- Kulstein, G., Marienfeld, R., Miltner, E., Wiegand, P. Automation of DNA and miRNA co-extraction for miRNA-based identification of human body fluids and tissues. Electrophoresis. 37 (21), 2742-2750 (2016).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clin Chem. 61 (11), 1333-1342 (2015).
- Schlosser, K., McIntyre, L. A., White, R. J., Stewart, D. J. Customized Internal Reference Controls for Improved Assessment of Circulating MicroRNAs in Disease. PLoS ONE. 10 (5), 0127443 (2015).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
- Wang, K., et al. Comparing the MicroRNA spectrum between serum and plasma. PLoS One. 7 (7), 41561 (2012).
- Mestdagh, P., et al. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biol. 10 (6), 64 (2009).
- Montani, F., et al. miR-Test: A Blood Test for Lung Cancer Early Detection. J Natl Cancer Inst. 19 (6), 063 (2015).
- Sestini, S., et al. Circulating microRNA signature as liquid-biopsy to monitor lung cancer in low-dose computed tomography screening. Oncotarget. 20 (32), 32868-32877 (2015).
- Verri, C., et al. Mutational Profile from Targeted NGS Predicts Survival in LDCT Screening-Detected Lung Cancers. J Thorac. Oncol. (17), 10 (2017).
- Bianchi, F., et al. A serum circulating miRNA diagnostic test to identify asymptomatic high-risk individuals with early stage lung cancer. EMBO Mol Med. 3 (8), 495-503 (2011).
- Gyoba, J., Shan, S., Roa, W., Bedard, E. L. Diagnosing Lung Cancers through Examination of Micro-RNA Biomarkers in Blood, Plasma, Serum and Sputum: A Review and Summary of Current Literature. Int J Mol Sci. 17 (4), 494 (2016).
