Summary
Denne publikasjonen beskriver fabrikasjon av en organ-on-chip enhet med integrerte elektrodene for direkte kvantifisering av transendothelial motstand (TEER). For validering, blod - hjerne barrieren ble mimicked i microfluidic enheten og barriere funksjonen var overvåket. Metodene presentert for elektrode integrering og direkte TEER kvantifisering gjelder generelt.
Abstract
Organer-på-chips, i vitro modeller som involverer kultur (human) vev inni microfluidic enheter, er raskt voksende og løfte om å gi nyttig forskning verktøy for å studere helse og sykdom. Betegner barriere funksjonen celle lag kultivert inne organ-on-chip enheter, måles ofte transendothelial eller transepithelial motstand (TEER). Dette er elektrodene vanligvis integrert i chip micromachining metoder å gi mer stabil målinger enn oppnås med manuell innsetting av elektroder i viker på brikken. Men disse elektrodene ofte hemme visuell inspeksjon av studerte celle laget eller krever dyre renrom prosesser for fabrikasjon. For å overvinne disse begrensningene, inneholder enheten beskrevet her fire lett integrert elektroder som plasseres og fast utenfor området kultur gjør visuell inspeksjon mulig. Bruker disse fire elektroder motstanden av seks mål baner kan kvantifiseres, som TEER kan bli direkte isolert, uavhengig av motstanden av kultur medium-fylt microchannels. Blod - hjerne barrieren ble kopiert i denne enheten og dens TEER var overvåket for å vise enhet anvendbarhet. Denne brikken, de integrerte elektrodene og TEER besluttsomhet metoden gjelder generelt organer-på-sjetonger, både å etterligne andre organer eller kan legges inn i eksisterende systemer for orgel-on-chip.
Introduction
Organer-på-chips er raskt fremstår som en ny og lovende klasse av in vitro vev modeller. 1 i disse modellene kultivert celler inne microfluidic enheter som er konstruert slik at de etterligner den fysiologiske microenvironment i disse cellene. 1 , 2 dette resulterer i mer realistisk fysiologiske eller patologisk atferd i disse cellene enn man kan forvente fra konvensjonelle i vitro modeller med enkel design og grunnleggende funksjon. 3 , 5 , 6 i tillegg organer-på-chips gi et bedre kontrollerbar miljø enn i vivo modeller og kan innlemme både friske og syke vev fra menneskelige opprinnelse trofast gjenskape både menneskelige fysiologi og patologi. Nylig oppsummerte fremskritt i utviklingen av blod - hjerne barrierer sjetonger (BBBs-på-chips) viser at feltet er raskt beveger seg fremover. 7
En annen fordel med organer-på-chips er at de aktiverer sanntid og kontinuerlig overvåking av vev kultivert inne i enheten mikroskopi, on-line biokjemiske analyser og integrerte sensorer. 1 , 2 For eksempel måle transendothelial eller transepithelial motstand (TEER) er en kraftig metode for overvåking ikke-invasively utvikling og avbrudd i barriere-forming vev. 8 , 9 , 10 TEER er elektrisk motstand over en mobilnettet barriere og er derfor om barriere integritet og permeabilitet. 10 organer på sjetonger, mobilnettet barrierer er generelt kultivert på en membran som skiller to fluidic kanaler, som representerer den apikale og basolateral deler av at barrier vev. I slike brikker, kan TEER målinger enkelt utføres med elektroder i inn- og utløp av de to kanalene. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 men manuell innsetting og gjeninnsetting av elektrodene kan lett føre plassering feil og dermed variasjoner i målt motstanden som f.eks forskjellene i motstand av lengre eller kortere stier gjennom microchannels betydelig er enn cellen barriere motstanden. 16 for å eliminere gjeninnsette feil, enheter med integrerte elektrodene er foreslått. Men de fleste av disse integrerte elektrodene blokkere visning når inspisere vev kultur17,18,19,20,21 , og spesialiserte renrom prosesser for fabrikasjon. 17 , 22
Orgel-on-chip-enhet som er beskrevet i denne publikasjonen, først brukt i en tidligere publikasjon,16 kombinerer stabiliteten av integrerte elektrodene med synlighet på målt celle laget og lett fabrikasjon. Design og fabrikasjon av denne brikken er avbildet i figur 1. Kort sagt, denne enheten består av to polydimethylsiloxane (PDMS) deler med kanal forlagene som er limt sammen Lekkasje-fri med en polykarbonat membran med 0,4 µm porene i mellom. Fire platina wire elektroder satt inn og fast på plass med en photocurable lim også utenfor området kultur. Alle disse fabrikasjon trinnene kan utføres med generelle laboratorieutstyr og uten behov for et renrom miljø. På toppen av dette, seks impedans målinger kan gjøres ved hjelp av disse fire elektroder, og dermed tillater direkte isolering av den målte TEER, uavhengig av motstanden av microchannels frem til tverrsnittet og dermed minimalisere påvirkning av ikke-biologiske variasjoner i systemet som (re) innsetting feil. 16
Viser anvendelse av denne enheten og direkte TEER målingene, blod - hjerne barrieren (BBB) ble replikert i denne brikken. Denne biologiske barrieren består av spesialiserte endotelceller og regulerer transport mellom blod og hjernen til å gi hjernen homeostase. 23 , 24 for å etterligne BBB, topp kanalen microfluidic enheten ble foret med menneskelige hjerne mikrovaskulær endotelceller fra hCMEC/D3 cellen linje (vennlig levert av Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, Frankrike). 25 metoden presentert, men mer generelt gjelder alle orgel-on-chip enheter med to avdelinger, aktivere direkte TEER besluttsomhet bruke enkelt integrert elektroder.
I dette manuskriptet er først fabrikasjon prosessen med enheten organ-on-chip med integrerte elektrodene beskrevet. Neste, seeding prosedyre og kultur av hjernen endotelceller inne i enheten er forklart, samt på prosessoren TEER målinger. I delen resultater representant TEER målinger vises og databehandling er avklart. Til slutt, barriere funksjon av BBB-on-chip, overvåket i 3 dager, presenteres, viser anvendelse av den presenteres apparat og metoder for å overvåke TEER.
Protocol
1. fabrikasjon av orgel-on-chip enheten
- gjør en PDMS kopi av en mold med kanal design, fabrikasjon benytter standard klima og jordsmonn teknikker, og få de PDMS delene av microfluidic chip.
- Veie ca 27 g PDMS basere agent og 2,7 g herding agent, masse forholdet må være 10:1. Dette er bra for en 3 mm tykk PDMS plate på en mold med 130 mm (5 tommer) diameter. Bland disse komponentene godt.
- Degas blandingen i en desiccator i ca 45 minutter å fjerne luftbobler.
- i mellomtiden, forberede mold flytende PDMS blandingen ved å stikke klart bånd rundt mold eller sett mugg i egnet wafer innehaver.
- Hell degassed PDMS blandingen på mold. Hvis noen luft bobler forble i PDMS blandingen eller på mold overflaten, degas det igjen i ca 30 min.
- Kurere PDMS blandingen i en ovn ved 60 ° C i 4 h. Tillat avkjølt.
- i kryss-flow hette, trekke den herdet PDMS fra formen, mold kan brukes umiddelbart for å lage flere PDMS replikaer.
- Skjær PDMS kopi i separate toppen og bunnen chip deler med skjæring linjer i PDMS.
- Fire hull i de øverste delene med en skarp biopsi punch med 1 mm diameter til skjemaet innganger og utganger. Punch fra innsiden til utsiden hindre PDMS rusk i å samle i brikken. Dekke chip deler med klart tape for å beskytte dem mot støv.
- Kuttet polykarbonat membraner fra Transwell innstikk i rutene ca 3 × 3 mm 2.
- Sette en porøs membran lekkasje-fri mellom to PDMS deler for å sette sammen en to-lags enhet tilkobles med en porøs membran.
Merk: Denne protokollen er tilpasset fra Griep et al. 19 og Chueh et al. 26- forberede en PDMS/toluen mørtel med 0,7 g PDMS base agent, 0,07 g herding agent og 540 µL av toluen, noe som resulterer i en 5:3 vekt forhold. Vortex mørtelen grundig.
- Spin-coat 200 µL av mørtel på et glass dekkglassvæske på 1500 rpm for 60 s (ramped på 1000 rpm/s) å erverve en tynn, uniform lag mørtel.
- Overføre et tynt lag med mørtel fra dekkglassvæske på en nederst og en øverste del av chip med en blekk roller. Sette nederst i en ovn-pengeskap fat.
- Med en pinsett, dyppe kantene av en membran i spin-belagt mørtelen og plassere den nøye i den nederste delen
- Forsiktig plassere den øverste delen i den nederste delen mens betalende oppmerksomhet til justeringen.
Merk: Ikke utøve press på brikken og ikke Skyv den øverste delen over nederst å hindre mørtel fra inn kanalene og tilstopping membranen. - Dekke chips viker med klart tape for å hindre støv å chip og stek dem ved 60 ° C i 3 h.
- Integrere elektrodene i siden kanalene.
Merk: Denne protokollen er tilpasset fra Griep et al. 19 og Douville et al. 18- cut platinum wire i biter på ca 2 cm. Rengjør ved submerging dem i aceton for 30 min. skylling med vann og etanol og la det tørke.
- i kryss-flow hette, sette en chip på en plast rett. Fire platina ledninger inn elektrode kanaler for en chip med en pinsett og bøy dem ned på plast parabolen aktivere fiksering på maten i et senere trinn. Sett inn ledningene 0,7-1 mm i kultur kanalen, forbi T-formet kanalen krysset.
- Legge UV-helbredelig lim på elektroden kanal inngangen og tillate lim fylle kanalen rundt elektroden ved kapillære krefter å.
- Slå på UV og kur limet når slutten av elektroden kanalen.
Forsiktig: Se ikke UV lyskilden som dette kan skade øynene. - Fixate fire integrerte elektrodene på plast maten med en to-komponent epoxy lim. Dette gir enklere håndtering av elektrodene under mål uten risiko for trekke elektrodene fra brikken.
- Dekker chips med klart bånd og stek dem ved 60 ° C i 2 h. Tillat avkjøles og lagre støvfritt før bruk. På denne måten kan de være trygt lagret for opptil en måned.
2. Kultur av hjerne-avledet endotelceller på prosessoren
- Coat chips for å fremme cellen vedlegg.
- Fylle begge kanaler med fosfat bufret saltvann (PBS) våt dem før innføring av reagenser. Sjekk under et mikroskop hvis det er noen luftbobler i kanaler. Eventuelt fjerne dem ved rødme med ekstra PBS.
- Fyller begge kanaler med 30 µL av 20 µg/mL menneskelige fibronectin i PBS. Ruge på 37 ° C i 3 timer. Sjekk for luftbobler og, hvis nødvendig, tømme kanaler med PBS og påfyll med fibronectin løsning.
- Rødme chips med endotelial oppblomstringen medium og ruge på 37 ° C og 5% CO 2 i en inkubator for 2 h.
- Måle TEER tom sjetongene som beskrevet i trinn 3 å sikre at alle elektrodene er i direkte kontakt med væske i kanaler. Tom sjetonger, vanlige TEER verdier er 0-1 Ω cm 2.
- Frø celler i øvre kanalen.
- Fjerne kultur medium fra en kultur kolbe (75 cm 2 kultur område) med en confluent monolayer av menneskelige hjerne mikrovaskulær endotelceller (hCMEC/D3).
- Vask cellene med PBS. Legg 2 mL 0,05% trypsin-EDTA og ruge på 37 ° C og 5% CO 2 i 2-5 minutter til cellene har løsrevet fra kultur kolbe.
- Deaktivere trypsin med kultur medium med 20% fosterets bovin serum (FBS). Telle celler og beregne antall celler i suspensjon.
- i mellomtiden sentrifuge hCMEC/D3 cellene 390 x g i 5 min og fjerne nedbryting.
- Resuspend celle pellet i riktige mengden endothelial oppblomstringen medium (EGF-2) ankommer en konsentrasjon av 5 x 10 6 celler/mL. Dette resulterer i en seeding tetthet av 2 x 10 5 celler/cm 2 i brikken.
- Sakte Pipetter 30 µL av godt mikset-celle suspensjon i øvre kanalen og fjerne pipette fra inntaket i en flytende bevegelse mens fortsatt øve press.
- Sjekk seeding tetthet under et mikroskop. En jevn fordeling av celler i hele øvre kanalen skal oppnås.
- Incubate chips på 37 ° C og 5% CO 2 for minst 1 h. skylle ut alle ikke-tilknyttede celler med endotelial kultur medium.
- Opprettholde på prosessoren endothelial kulturen.
- To ganger per dag, sett inn kultur medium-fylt pipette-spisser som reservoarer i viker og erstatte mediet inne i brikken av gravitasjon-drevet flyt.
Merk: For å unngå luftbobler fra inn i microchannels og ødelegge celle laget, pass på å gjøre væske-væske kontakt mellom pipette spissen og væske på brikken før du setter spissen i en vik. Dette kan ordnes ved å legge en liten dråpe på den i / uttak før pipette innsetting. - Også legge pipette tips reservoarer i butikkene å hindre kanalene tørker.
- Ruge chips på 37 ° C og 5% CO 2.
- To ganger per dag, sett inn kultur medium-fylt pipette-spisser som reservoarer i viker og erstatte mediet inne i brikken av gravitasjon-drevet flyt.
3. TEER målene på chip
- satt opp the TEER måling apparater, bestående av en bindingstid forsterker og en sonde kabel krets som er angitt i Van der roret et al. 16 eventuelt potentiostats eller impedans analyserer er også egnet for disse impedans-baserte TEER målinger.
- Ta chip settefiskanlegg og la det til nå romtemperatur for minst 10 min. Fjern alle væske fra plast rett rundt elektrodene for å hindre elektrode bro utenfor chip.
- Ta impedans spekteret fra 200 Hz til 1 MHz for hver kombinasjon av to elektroder, noe som resulterer i 6 impedans spectra per brikke i bare 5-10 min. sjekk hvis til impedans spectra har forventede størrelser og former å validere TEER måling, som er beskrevet i resultatinndelingen.
- Sette chip tilbake i inkubator på 37 ° C og 5% CO 2 etter måling.
- Behandle til innhentet impedans spectra ankomme en normalisert TEER verdi.
- Få den målte motstand
mellom elektrodene 
og 
, som vises i figur 2B og D fra resistiv platået på 10 kHz i de tilsvarende impedans spectra. - Beregn TEER med seks målt autentiske tilsvarer en samtidig punkt ved hjelp av ligningen av figur 2 g 16:
i denne ligningen,
kultur området der motstanden ble målt, < img-alt = " Ligning 5"src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg "/ > er motstanden av mobilnettet barrieren og membranen, 
, 
, 
og 
er motstanden verdier målt gjennom mobilnettet barriere og 
og 
måles motstand verdiene i den rett kanalene. 16 ligningen er avledet fra tilsvarende krets illustrert i figur 2C.
- Få den målte motstand
- Trekker den tomme TEER fra TEER på alle tidspunkt å få utviklingen av TEER tidsnok.
mellom elektrodene 
og 
, som vises i figur 2B og D fra resistiv platået på 10 kHz i de tilsvarende impedans spectra.
kultur området der motstanden ble målt, < img-alt = " Ligning 5"src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg "/ > er motstanden av mobilnettet barrieren og membranen, 
, 
, 
og 
er motstanden verdier målt gjennom mobilnettet barriere og 
og 
måles motstand verdiene i den rett kanalene. 16 ligningen er avledet fra tilsvarende krets illustrert i figur 2C.Representative Results
Skjematisk resultatene av elektriske impedans spektroskopi gjennom en chip uten celler (heltrukket linje) og en cellulær barriere (stiplet linje) er vist i figur 2A. Fire viktigste områder kan identifiseres, hver dominert av en bestemt elektrisk komponent. Under ca 1 kHz dominerer dobbelt lag kapasitans elektrode-kultur medium grensesnittet, preget av en negativ skråning impedans omfanget og en faseskift nærmer-90 °. Frekvensen som tolags kapasitans dominerer, er avhengig av elektrode området utsatt for kultur medium. Resistiv platået over 1 kHz (uten celler) eller 100 kHz (med celler) med en faseskift nær 0 °, tilsvarer motstanden av kultur medium innenfor microfluidic kanalene, avhengig av kanal lengde og tverrsnitt, og inne det membran, avhengig av porøsitet og tykkelse. Når du måler gjennom en mobilnettet barriere, vises en ekstra resistiv platå mellom 1 og 10 kHz og lokale maksimalt i fase diagrammet. Denne regionen er av avgjørende betydning for fastsettelse av TEER som en klar økning i impedans resultater når cellene i den målte banen, og derfor kalt "områder av interesse". Ekstra skråningen mellom 10 og 100 kHz tilsvarer celle barriere kapasitans, som oppstår fra elektrisk isolerende lipid bilayer membraner og er avhengig av det totale arealet av cellen laget. 27 grensene for disse områdene, samt impedans størrelsen avhenger av systemet blir studert og endre med, blant andre ting, kanal dimensjoner, kultur medium ledningsevne, elektrode posisjon og celle type. For videre lesing om teori og praksis av elektriske impedans spektroskopi på barriere-forming vev gjennomgang artikkel av Benson et al. anbefales. 28
Representant data av TEER målinger vises for både en tom chip og en brikke med et hCMEC/D3 hjernen endothelial celle i figur 2E og 2F, henholdsvis. Kort sagt, impedans spektroskopi ble utført med seks mål med fire elektroder: to målinger gjennom celle kultur medium-fylt kanaler (heltrukket linje) og fire mål gjennom kanaler samt membranen og om stede - den mobilnettet barriere (stiplet linje). Disse seks mål banene kan identifiseres i tilsvarende resistiv krets av figur 2B, som er avledet fra skjematisk tverrsnitt (figur 2C) og ovenfra (figur 2D). Tom chip målinger (figur 2E) viser typisk form av impedans spectra uten celler, som vist i figur 2A. Målingene gjennom mobilnettet barriere (stiplet linje i figur 2F) ligner typiske impedans spectra med celler i figur 2A. Merk at både impedans omfanget og fasen skifte økning mot 1 MHz. Dette er den typiske responsen av målingen ved høye frekvenser er ikke eksperimentelle opprinnelsesland.
For å bestemme TEER bruker disse eksperimentelle impedans spectra, først målt chip motstanden blir bestemt, som er totalt motstanden av cellen lag, kanaler og membran. Dette en egnet avlesning frekvens i regionen rundt ble valgt, som er lokale nådd i fase plottet med celler og 0 ° faseskift uten celler: 10 kHz. Med seks målt autentiske ved 10 kHz, målt mellom fire elektrodene, beregnes TEER direkte ved hjelp av formelen i figur 2F.
For å vise at den presenterte apparatet er egnet for å bestemme TEER i organer-på-chips, BBB ble replikert inne i brikken og dens TEER var overvåket under 3 dager med kultur. I figur 3A gjennomsnittlig TEER ± standardfeil av gjsnitt (SEM) vises for fire BBBs-på-chips, som resulterer i et platå av 22 ± 1.3 Ω cm2, som er sammenlignbare med TEER av denne cellen linjen som rapportert i litteraturen. 29 videre etter opphør av eksperimentet og fluorescens farging av kjerner, det kan sees at hjernen endotelet dannet en kontinuerlig monolayer inne i enheten (figur 3B). Immunofluorescence flekker tett krysset protein Zonula Occludens-1 (ZO-1) viste at hjernen endotelceller opprettholdt sin BBB-spesifikke fenotypen og dannet stram junctional komplekser.
Figur 1: Design og montering av orgel-on-chip enheten med integrerte elektrodene.
(A) oppbygning av microfluidic chip, som består av en topp PDMS del med topp kanalen (TC), en membran (M) og en bunn PDMS del med den nedre kanalen (F.Kr.). Fire platina wire elektroder (E1-4) er satt inn og fast i siden kanaler. I øvre kanalen og over membranen, ble hCMEC/D3 hjernen endotelceller kultivert for å gjenskape BBB. (B) samlet chip, fast til en plast rett. Opptrykk og tilpasset med tillatelse fra Elsevier. 16 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representant impedans data og fastsettelse av TEER.
(A) skjematisk impedans spectrum viser impedans omfanget (Ω) og faseskift (°) versus frekvens (Hz), typisk for elektriske impedans spektroskopi sjetonger uten celler (heltrukket linje) og celler (stiplet linje). Det er fire viktigste områder, hver dominert av: tolags kapasitans elektrodene, kultur medium motstanden, celle barriere motstand og cellemembranen kapasitans. "Områder av interesse" angir der bidrag av cellen laget kan være kvantifisert (rød pil). (B) tilsvarende krets resistiv av chip, viser den øverste kanal motstander R1 og R3, den nedre kanal motstander R2 og R4 og membran og EC barriere motstanden Rm. (C) viser endotelceller (EC) kultivert i øvre kanalen skjematisk tverrsnitt. (D) skjematisk ovenifra BBB chip viser konfigurasjonen av elektrodene og kultur på 0,25 mm2 som impedansen målt. (E) representant impedans spektra av en tom chip fylt med celle kultur medium. (F) representant impedans spektra av en chip i som hCMEC/D3 hjernen endotelceller var kultur i 3 dager. (G) formel for å beregne TEER fra målt autentiske mellom alle seks kombinasjoner av fire elektroder. Opptrykk og tilpasset med tillatelse fra Elsevier. 16 Klikk her for å vise en større version av denne figuren.
Figur 3: Representant TEER utvikling av BBB-on-chip.
(A) gjennomsnittlig TEER ± standardfeil av gjsnitt (SEM) fire BBBs-på-sjetonger i en kultur periode på tre dager, nå et platå på 22 ± 1.3 Ω cm2 (gjennomsnittlig ± SEM). Til sammenligning er data tom chips inkludert, viser marginale variasjon og avvik fra 0 Ω cm2 i samme periode forhold til variasjon og TEER verdi med celler. (B) fluorescens mikroskopi av farget kjerner avslørte en kontinuerlig monolayer av endothelium, både på PDMS og membranen på stedet angitt i rammemargen. (C) Immunofluorescence viste tilstedeværelse av tett krysset protein Zonula Occludens-1, som angir at BBB-spesifikke stramt veikryss mellom cellene gi opphav til den målte TEER. Opptrykk og tilpasset med tillatelse fra Elsevier. 16 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
I dette manuskriptet ble prosjektering av en organ-on-chip enhet og direkte fastsettelse av transendothelial-motstand (TEER) av en mobilnettet barriere kultivert enheten presentert. Presentert metoden å integrere elektroder uten renrom utstyr og direkte TEER fastsettelse bruker fire elektroder gjelder alle orgel-on-chip enheter med to microfluidic avdelinger. Chip oppsettet og geometri kan tilpasses tilfredsstiller de så for seg eksperimenter, som fire elektrodene er delt i to deler. Fire elektrodene kan med beleilig settes i viker av eksisterende chips, forutsatt at de er fiksert på plass for varigheten av seks målinger. Lekkasje-fri binding metoden kan optimaliseres for forskjellige membraner og kanal geometrier ved å endre PDMS/toluen forholdet. En høyere toluen innhold fører til et tynnere spin-belagt lag mørtel26 og kan være mer egnet for grunnere og smalere kanaler i PDMS deler. En lavere toluen innhold resulterer i en tykkere mørtel lag26 , og kan være bedre egnet til å omslutte tykkere membraner mellom PDMS deler.
Som kan sees i skjematisk impedans spectra i figur 2A og de eksperimentelle spektra i figur 2E og 2F, påvirkes impedans målinger av tolags kapasitans elektrode mellomstore grensesnittet. På grunn av den lille størrelsen på elektrodene inne microchannels, kan dobbelt lag kapasitans dominere over resistiv platået av mobilnettet barrieren i impedans spectra, kompliserer kvantifisering av TEER. Elektrodene kan settes for å overvinne dette, videre inn kultur kanalene før fiksering. Dette øker arealet av elektroden utsatt til kultur medium og med det tolags kapasitans øker også. Dette resulterer i et skifte av kapasitive skråningen til lavere frekvenser, slik at resistiv platået av mobilnettet barrieren kan lettere anerkjent og kvantifisert. Selv om motstanden av målt banen mellom to elektroder blir mindre, vil dette ikke påvirke TEER kvantifiseringen etter presentert metoden.
Mens måle gjennom mobilnettet barriere, er det mulig at ekstra resistiv platået ikke kan gjenkjennes. Dette kan være et resultat av en fluidic forbindelse mellom de to kanalene, for eksempel hvis membranen er dårlig omsluttet av mørtelen, fører til en målt bane rundt mobilnettet barrieren. I tillegg kan det være elektrisk bro utenfor chip hvis elektrodene er forbundet med en dråpe kultur medium. Dette er vanligvis kombinert med en lavere målt impedans kan løses ved å fjerne denne broen av kultur medium. Til slutt, hvis det er ingen resistiv platå og målt impedansen er flere størrelsesordener høyere enn forventet, kan det være en løs tilknytning i det elektriske ledningsnett eller strømkilden.
I fremtiden, kan fysiologiske relevansen av den gjeldende BBB-on-chip økes ved å utsette endotelceller hvis du vil skråstille stress på fysiologiske nivåer, som er rapportert å fremme BBB differensiering og øke barriere tetthet og er vanskelig å oppnå i konvensjonell i vitro modeller. 29 i tillegg den nedre kanalen den presenterte apparatet gir en egnet avlukke for hjerne-avledet celler til co kultivert med endotelet. Dette er også forventet å øke funksjonen barriere også muliggjør studiet av komplekse interaksjoner mellom relevante celletyper under patologiske forhold. 29
I konklusjonen, orgel-on-chip-enhet som er beskrevet i denne publikasjonen kan være fabrikasjon benytter standard laboratorieutstyr og vises å gi direkte TEER mål med fire integrerte elektrodene som ikke hindre visuell inspeksjon av studerte cellen lag. Anvendelsen av denne enheten i feltet organer-på-chips ble demonstrert av mimicking BBB i denne brikken og overvåking av TEER i kultur perioden. En rekke andre (barriere) organer kan bli etterlignet av inkludert andre relevante celletyper i denne brikken. I tillegg kan metode for å måle TEER enkelt brukes i andre to rom-baserte orgel-on-chip enheter ankommer reproduserbare og meningsfull TEER verdier som kan sammenlignes med over enheter og systemer.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi erkjenner takknemlig Johan Bomer fabrikasjon av mold og Mathijs Bronkhorst for fruktbart diskusjoner og hjelp med datarepresentasjon.
Denne forskningen ble finansiert av: SRO biomedisinsk Micro Devices av Li Segerink, MIRA Institutt for Biomedical Engineering og tekniske medisin, Universitetet i Twente; SRO organer-på-Chips av ad van der Meer, MIRA Institutt for Biomedical Engineering og tekniske medisin, Universitetet i Twente; og VESCEL, ERC avansert tilskudd til A. van den Berg (grant nr. 669768).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | 1673921 | |
| Scotch Magic tape | 3M | ||
| Biopsy punch, 1.0 mm diameter | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size | Corning | 3401 | Cut from Transwell culture inserts |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Platinum wire, 200 µm diameter | Alfa Aesar | 10287 | |
| UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol | Henkel | 30673 | |
| hCMEC/D3 cells | Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Human plasma fibronectin, 20 µg/ml | Gibco | 33016015 | |
| Endothelial growth medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | Gibco | 15400-054 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Oven | Binder | 9010-0190 | |
| Spin coater: Spin 150 | Polos | SPIN150-NPP | |
| UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 | Manufactured in-house | ||
| Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Incubator | Binder | CB E2 150 | |
| Boxense | LocSense | Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements |
References
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
- Van der Meer, A. D., Van den Berg, A. Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse. Integr Biol. 4 (5), 461-470 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5 (9), 1130-1140 (2013).
- Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (4), 1357-1362 (2013).
- Van der Helm, M. W., Van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., Van den Berg, A., Segerink, L. I. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue barriers. 4 (1), e1142493 (2016).
- Abbott, N. J., Dolman, D. M., Yusof, S., Reichel, A. Chapter 6. Drug Delivery to the Brain Vol. 10 AAPS Advances in the Pharmaceutical Sciences Series. Hammarlund-Udenaes, M., de Lange, E., Thorne, R. G. , Springer. New York. 163-197 (2014).
- Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15 (3), 745-752 (2015).
- Srinivasan, B., et al. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Brown, J. A., et al. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9 (5), 054124 (2015).
- Deosarkar, S. P., et al. A Novel Dynamic Neonatal Blood-Brain Barrier on a Chip. PLoS ONE. 10 (11), e0142725 (2015).
- Ferrell, N., et al. A microfluidic bioreactor with integrated transepithelial electrical resistance (TEER) measurement electrodes for evaluation of renal epithelial cells. Biotechnol bioeng. 107 (4), 707-716 (2010).
- Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
- Partyka, P. P., et al. Mechanical stress regulates transport in a compliant 3D model of the blood-brain barrier. Biomaterials. 115, 30-39 (2017).
- Van der Helm, M. W., et al. Direct quantification of transendothelial electrical resistance in organs-on-chips. Biosens Bioelectr. 85, 924-929 (2016).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (mu BBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
- Douville, N. J., et al. Fabrication of two-layered channel system with embedded electrodes to measure resistance across epithelial and endothelial barriers. Anal chemi. 82 (6), 2505-2511 (2010).
- Griep, L. M., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnol Bioeng. , (2016).
- Wang, J. D., Khafagy, E. -S., Khanafer, K., Takayama, S., El Sayed, M. E. H. Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood–Brain Barrier. Mol Pharm. 13 (3), 895-906 (2016).
- Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sens Actuators B Chem. 222, 1209-1219 (2016).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
- Weksler, B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Chueh, B. -H., et al. Leakage-free bonding of porous membranes into layered microfluidic array systems. Anal chem. 79 (9), 3504-3508 (2007).
- Golowasch, J., Nadim, F. Encyclopedia of Computational Neuroscience. Jaeger, D., Jung, R. , Springer. New York. 555-558 (2015).
- Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids Barriers CNS. 10 (5), (2013).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. -O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
