Summary
Detta protokoll studier effektivt däggdjur celldelning i 3D kollagen matriser genom att integrera synkronisering av celldelning, övervakning av division i 3D matriser använder live-cell bildteknik, tid-löst confocal speglar mikroskopi och kvantitativ bildanalys.
Abstract
Studiet av hur däggdjur celldelning är reglerad i en 3D miljö är fortfarande till stora delar outforskat trots dess fysiologiska relevans och terapeutisk betydelse. Möjliga orsaker till bristen på prospektering är experimentell begränsningar och tekniska utmaningar som göra studiet av celldelning i 3D kultur ineffektiva. Här beskriver vi ett imaging-baserad metod för att studera effektivt däggdjur celldelning och cell-matrix interaktioner i 3D kollagen matriser. Celler som är märkta med fluorescerande H2B synkroniseras med kombination av tymidin blockering och nocodazole behandling, följt av en mekanisk shake-off-teknik. Synkroniserade celler bäddas sedan in i en 3D kollagenmatrisen. Celldelning kontrolleras med hjälp av live-cell mikroskopi. Deformeringen av kollagenfibrer under och efter celldelning, vilket är en indikator på cell-matrix interaktion, kan övervakas och kvantifieras med hjälp av kvantitativa confocal speglar mikroskopi. Metoden ger ett effektivt och allmänt tillvägagångssätt för att studera däggdjur celldelning och cell-matrix interaktioner i en fysiologiskt relevanta 3D-miljö. Detta tillvägagångssätt inte bara ger nya insikter i den molekylära basen för utvecklingen av normal vävnad och sjukdomar, men också tillåter utformningen av nya diagnostiska och terapeutiska metoder.
Introduction
Cell Mitos är en kritisk händelse i cellulära liv, regleringen av som spelar avgörande roller i vävnads- och utveckling. Onormal Mitos är inblandad i naturliga genetiska variationer, människors åldrandeprocesser och utvecklingen av cancer1,2,3,4,5. Den ökade räntesatsen för spridning av tumörceller jämfört med normala celler är ett av kännetecknen för cancer, trots att cellen beteenden är ganska heterogen bland olika typer av tumörer och även bland patienter. Trots lovande prekliniska resultat, har vissa nyutvecklade Mitoshämmande läkemedel inte visat sig vara effektiva i kliniska prövningar6,7,8,9,10 ,11. Relevansen av experimentella och prekliniska modeller måste beaktas. Många typer av normala däggdjurs- och cancer celler delar i tredimensionella (3D) matriser, såsom fibroblaster och fibrosarkom celler i kollagen-rik 3D bindväv och metastaserande cancerceller i 3D stromal extracellulär matrix (ECM). Men har de allra flesta däggdjur celldelning experiment och analyser utförts på celler odlade på tvådimensionell (2D) substrat. En konstruerad 3D matrix kunde bättre sammanfatta den mikrostruktur, mekaniska egenskaper och biokemiska signaler av 3D ECM både normal och patologisk vävnad12,13,14, 15,16,17.
Studiet av hur däggdjur celldelning är reglerad i 3D miljöer är fortfarande till stora delar outforskat trots både fysiologiska relevansen och terapeutisk betydelse18,19. Möjliga orsaker inkluderar tekniska svårigheter och experimentella utmaningar i samband med att studera celldelning i 3D matriser. Cell Mitos utgör en temporal bråkdel i hela cellcykeln20. Tidigare arbete har visat att andelen spridning av många däggdjurs-celler, såsom mänskliga bröstcancer adenocarcinom MCF-7, mänskliga osteosarkom U2OS och mänskliga levern HepG2, är mycket lägre i 3D matriser jämfört med sina motsvarigheter på 2D substrat21, 22. Dessutom flytta celler inbäddade i 3D matriser och ur fokus under live-cell imaging. Alla dessa faktorer bidrar till extremt låga effektivitet fånga celldelning händelser i 3D kultur använder avbildningstekniker.
Interaktioner mellan ECM och celler spelar avgörande roller i regleringen av celldelningar. Här, beskriver vi en strategi för att effektivt studera däggdjur celldelning i 3D kollagen matriser. Metoden omfattar införlivandet av mitotiska markörer till cellerna, synkronisering av celldelning, samt övervakning av division händelser i 3D matriser med hjälp av live-cell bildteknik, tid-löst confocal speglar mikroskopi, och kvantitativ bildanalys. Fluorescens-märkt Histon protein H2B introduceras först in i cellerna som en markör för att skilja mitotiska och interphase celler. Då synkroniseras cellerna med kombination av tymidin blockering och nocodazole behandling, följt av en mekanisk shake-off-teknik. Synkroniserade celler kapslas sedan direkt in i 3D kollagen matriser. Celldelning händelserna i flera celler övervakas effektivt med hjälp av låg förstoring time-lapse live-cell imaging. Deformeringen av kollagenfibrer, som är en indikator på cell-matrix interaktion, övervakas med confocal speglar mikroskopi vid hög förstoring.
Vi har tidigare använt denna teknik för att övervaka och kvantifiera cell-matrix interaktion före, under och efter Mitosen av två metastaserande cancer cellinjer, mänskliga invasiv duktal cancer MDA-MB-231 och mänskliga fibrosarkom HT1080 celler, i 3D kollagen matriser19. De metoderna som presenteras här ger ett effektivt och allmänt tillvägagångssätt för att studera båda däggdjur celldelning i en 3D miljö och cell-matrix interaktioner. MDA-MB-231 cell linjen används som exempel i hela papperet. Detta protokoll ger nya insikter i den molekylära basen för utvecklingen av normal vävnad och sjukdomar och möjliggör även för utformningen av nya diagnostiska och terapeutiska metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet som följer riktlinjerna för The Homewood institutionella i styrelsen (HIRB).
1. stabil uttryck för H2B-mCherry som en markör för Cell Mitos
-
Generation av lentiviral partiklar från mänskliga embryonala njure 293T (HEK 293T) celler
- Tavla HEK 293T cellerna på en 10 cm cell kultur maträtt på tätheten av 5 x 106 celler/maträtt i cellodlingsmedium (Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) innehållande hög glukos (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% fetalt bovint Serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin (penna/Strep)). Inkubera under 24 timmar vid 37 ° C och 5% koldioxid (CO2). Den önskade konfluens dagen för transfection celler är ungefär 70-80%.
Obs: HEK 293T celler används här att producera viruspartiklar, som kommer att användas senare till transduce MDA-MB-231 celler för att generera en cellinje stabilt uttrycker H2B-mCherry. Se till att celler jämnt fördelade över plattan. Tillägg av cellerna släppa klokt att plattan, och försiktigt flytta plattan fram och tillbaka kan stöd i jämn fördelning. Cellerna kan också vara seedad i plattor eller flaskor i andra storlekar, som kommer att resultera i samlingen av olika volymer av viruspartiklar. - Transfect HEK 293T cellerna med en transfection reagens med tre plasmider (lentiviral vector, CMV ΔR 8,91 och pMDG-VSVG). Plasmiden kodning H2B-mCherry är klonade i en lentiviral vector med phosphoglycerate kinase arrangören (PGK). CMV ΔR 8,91 innehåller tre obligatoriska HIV gener, gag, poloch rev. pMDG-VSVG innehåller VSV-G kuvert genen.
Obs: Det finns flera transfection agenter att välja från.- Låt injektionsflaskan nå rumstemperatur (RT) reagens på transfection före användning. Invertera eller virvel injektionsflaskan med kort.
- Mix 16 µg av DNA, som består av 6 µg H2B-mCherry plasmid, 8 µg av CMV ΔR 8,91 och 2 µg av pMDG-VSVG, i 1 mL minskade serum media. Inkubera vid RT i 5 min.
Obs: Mängden och förhållandet mellan de tre vektorerna är varierade och optimerad för olika lentiviral överföring vektorer. - Tillsätt 48 µL (Använd 1:3 förhållandet mellan DNA: transfection reagens) av transfection reagens i ovanstående DNA lösningen, och sedan odla i RT i minst 15 minuter.
Obs: Förhållandet mellan DNA vs. transfection reagens är varierade och optimerad för olika lentiviral överföring vektorer. Kontrollera att transfection reagens inte kontakta sidan av det 1,5 mL centrifugröret. - Lägg till den DNA-lipid komplex lösning gjorde i steg 1.1.2.3 drop-wise till cellerna. Snurra försiktigt på plattan för att säkerställa en jämn fördelning av anläggningen i plattan.
- Ungefär 6 h efter transfection, aspirera på medellång och lägga till färska cellodlingsmedium (DMEM med hög glukos (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% FBS och 1% penna/Strep).
- Skörda den supernatant 24, 48 och 72 h efter transfection. Ersätta mediet efter varje skörd (DMEM, 4,5 g/L glukos, natrium pyruvat, med 10% FBS och 1% penna/Strep).
- Filtrera lentiviral partiklarna genom ett 0,45 µm filter att ta bort det cellulära skräpet. Alternativt, snurra ner supernatanten att skilja ut cellfragment. Supernatanten kan användas för transduktion direkt, eller kan lagras vid-80 ° C.
- Tavla HEK 293T cellerna på en 10 cm cell kultur maträtt på tätheten av 5 x 106 celler/maträtt i cellodlingsmedium (Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) innehållande hög glukos (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% fetalt bovint Serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin (penna/Strep)). Inkubera under 24 timmar vid 37 ° C och 5% koldioxid (CO2). Den önskade konfluens dagen för transfection celler är ungefär 70-80%.
-
Generation av cell linjer stabilt uttrycker H2B-mCherry
Obs: Detta protokoll beskrivs i detalj för MDA-MB-231 celler. Före användning i experimentet, mänskliga bröstcancer carcinom celler MDA-MB-231 (Physical Sciences onkologi Center, NIH) odlas i DMEM som innehåller hög glukos (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% FBS och 1% penna/Strep.- Tallrik MDA-MB-231 cellerna på tätheten av 1 x 105 celler i en 35 mm kultur maträtt.
Obs: Tätheten av plätering för olika cellinjer bör optimeras, och därför kan skilja sig från den optimala tätheten av MDA-MB-231-celler. - 24 h efter plätering cellerna, tillsätt 1 mL av virus och 1 mL färsk medium (DMEM, hög glukos (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% FBS och 1% penna/Strep).
- Inkubera cellerna i en tidsperiod i 6 h till över natten.
Obs: Båda volymen av viruset och inkubationstiden behöver optimeras för olika cellinjer. Till exempel om cellerna inte ser frisk några timmar efter tillsats av viruset, Använd 1 mL av virus och 2 mL färsk medium (DMEM, hög glukos (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% FBS och 1% penna/Strep) för steg 1.2.2. Längden på inkubationstiden i steg 1.2.3 kan också minskas. - Aspirera på medellång och tillsätt 10 mL av färskt medium (DMEM, hög glukos (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% FBS och 1% penna/Strep). Inkubera i mellan 24 till 72 timmar vid 37 ° C och 5% CO2.
- Kontrollera uttrycket av H2B-mCherry i celler med ett epifluorescensmikroskop.
Obs: Om transduktion effektivitet är låg i celler, kommer volymen av virus i steg 2.2 och inkubationstiden i steg 2.3 kunde ökas.
- Tallrik MDA-MB-231 cellerna på tätheten av 1 x 105 celler i en 35 mm kultur maträtt.
2. synkronisering av de celler som uttrycker stabilt H2B-mCherry
- Platta celler på 50 till 60% confluency, dvs plattan 2 x 104 MDA-MB-231 celler i varje brunn 24-bra platta.
- Inkubera kulturen på 37 ° C och 5% CO2 för 24 h.
- Ersätta odlingsmedium med 0,5 mL av medium (DMEM, hög glukos (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% FBS och 1% penna/Strep) som innehåller 2 mM tymidin och lämna i inkubatorn för 24 h.
Obs: Celler utsätts för tymidin arresteras i fasen av celltillväxt (G1) / DNA syntesen (S) övergång och hela S-fas på grund av hämning av DNA-syntes. Längden på inkubationstiden bör vara varierad och optimerad för olika cellinjer. - Lossa cellerna från tymidin exponering genom att tvätta dem med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) tre gånger. Sedan, inkubera cellerna i normala cellodlingsmedium (DMEM, hög glukos (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% FBS och 1% penna/Strep) i 5 h.
Obs: Frigöraren av cellerna från tymidin exponeringen kan cellerna att utvecklas till celltillväxten (G2) / mitotiska (M) fas för celler tidigare gripits på den G1/S-fasen och till G1-fasen för celler som tidigare gripits på S fas. Release-tiden bör vara varierad och optimerad för olika cellinjer. - Blockera cellerna med 250 ng/mL nocodazole för 12 h.
Obs: Alla celler utsätts för nocodazole arresteras på G2/M fasen. Nocodazole är cytotoxiska. Långvarig exponering för nocodazole kan orsaka apoptos. Justera tid eller koncentration av exponering för olika cellinjer om cellen dödsfall observeras. Celler som synkroniseras framgångsrikt kommer att ställa ut en sfäriska morfologi. - Skaka cellerna för 45 s till 1 min med orbitalskak vid 150 till 200 rpm.
Obs: Mitotiska celler, som har lite vidhäftning till underlaget, kommer att skakas under processen. - Ta bort mediet för att extrahera celler, genom pipettering mediet i ett centrifugrör, och tillsätt därefter 0,5 mL färsk medium (DMEM, hög glukos (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% FBS och 1% penna/Strep) till varje brunn av plattan.
- Upprepa steg 2,6 och 2,7 tre gånger.
- Centrifugera insamlade mediet som innehåller mitotiska celler vid 800 x g i 3 min.
Obs: Detta steg används för att ta bort nocodazole från cell medlet.
3. införlivande av den synkroniserade celler i kollagen matriser
Obs: Typ I kollagen är det mest förekommande proteinet i människokroppen och i ECM av bindväv, och därmed ofta används för att undersöka hur eukaryot cell funktioner moduleras av en 3D-miljö17,23,24 . Kollagen är lösligt i ättiksyra. Efter neutraliserande och uppvärmningen kollagen lösningen till 20-37 ° C, polymerisera kollagen monomerer i en meshwork av kollagen fibriller.
- Bered den 10 x DMEM genom att lösa ett paket av DMEM pulver, 3,7 g natriumbikarbonat (NaHCO3) och 1 g 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES) i 50 mL destillerat vatten. Filtrera lösningen, och sedan förbereda 1 M natriumhydroxid (NaOH) genom upplösning 2 g NaOH pellets i 50 mL destillerat vatten. Filter och alikvot lösningen i 1,5 mL centrifugrör.
Obs: Normal DMEM lösning bör inte användas i det här steget. Tillägg av betydande volym av kollagen lösningen kommer att späda på medellång. Därför är koncentrerade DMEM lösningen beredd att se till att DMEM i kollagenmatrisen slutliga koncentration kommer att vara samma som den normala DMEM. - Fortsätta att arbeta med de celler som samlas in från steg 2,9. Aspirera på medellång, och resuspendera cellerna i ca 0,25 - 0,5 mL färsk cellodlingsmedium (DMEM, hög glukos (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% FBS och 1% penna/Strep).
Obs: För att nå en specifik cell densiteten i kollagenmatrisen, den ursprungliga tätheten av cellerna i suspensionen får inte vara för låg. Således, volymen av det medium som används för att resuspendera cellerna kommer att bero på det totala antalet tillgängliga cellerna. - Plats 10 µL av den åter svävande cell lösningen från steg 3,2 på en hemocytometer och räkna densiteten av cellerna i lösningen.
-
Fastställa vilka volymer som behövs för alla komponenter för att göra 3D collagen matrix. 500 µL av 2 µg/µL kollagen gel används här som ett exempel.
- Beräkna volymen av den cell-lösning som krävs för att få 40 000 celler/mL (eller 20 000 celler för de 500 µL av kollagen gel). Detta nummer i µL är X. 50 µL av 10 x DMEM kommer att behövas. 50 µL av FBS kommer att behövas.
- Beräkna volymen av kollagen som jag lager behövs. Koncentrationen av kollagen I är runt 4 µg/µL. Mängden kollagen som behövs i µL är Y.
- Beräkna volymen av natriumhydroxid måste neutralisera ättiksyra i kollagen lösningen: Y µL kollagen * 0.023 * 1000 = Z μl NaOH behövs.
- Bestäm volymen av filler lösningen: (500 µL totala gel - X µL celler - 50 µL 10 X DMEM - 50 µL av FBS - Y µL kollagen - Z μl NaOH) = R µL
Obs: Filler lösningen är destillerat vatten. Om den beräknade volymen av lösning som filler är ett negativt tal, är ursprungliga cell densiteten i cellsuspensionen för låg. Cellerna behöver snurrade ner igen och åter upphängd i en mindre volym av medium (DMEM, hög glukos (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% FBS och 1% penna/Strep).
- Lägga till komponenter i följande ordning till en ren 1,5 mL centrifugrör: celler i medium, 10 x DMEM, FBS, avjoniserat vatten (DI), kollagen, NaOH. Placera alla komponenter på is för att bromsa gelation av kollagen lösningen. Använda rätt pipettering tekniker för att förhindra bildandet av bubblor.
- Efter tillsats av NaOH, blanda lösningen noggrant med en 1 mL Pipettera.
Obs: Gelation av kollagen startar rätt omedelbart efter tillsats av NaOH. Blandning bör göras noggrant och snabbt. - När lösningen är väl blandade, tillsätt 500 µL av lösningen till varje brunn Skyltens 24 brunnar. Plats 24-väl plattan i 37 ° C inkubatorn. Placera färsk cellodlingsmedium i 37 ° C vattenbad.
Obs: Plast botten plattor används för låg-förstoring live-cell microcopy där arbetsavstånd av linsen är högre än 1 mm. glas botten plattor används för hög förstoring live-cell mikroskopi på grund av den korta arbetsavståndet av höga förstoring lins. - Tillsätt 500 µL av pre värmde medium (DMEM, hög glukos (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% FBS och 1% penna/Strep) till toppen av gelen 30 min efter steg 3,7.
4. levande Cell avbildning av cellerna att dela i 3D kollagen matriserna (låg förstoring)
Obs: Bilder av celler samlas i 2 min intervaller med hjälp av en kostnad kopplade enhet (CCD) kamera monterad på fas kontrast Mikroskop som är utrustat med ett 10 X-objektiv och styrs av bildhanteringsprogram.
- Slå på den levande cellen enhet monterad ovanpå objektivet. Vänta tills temperaturen stabiliserar vid 37 ° C, koncentrationen av CO2 är på 5% och luftfuktigheten är på 75%.
- Satte 24-väl plattan av geler i levande cell enheten på mikroskopet. Hitta längst ner på plattan och sedan flytta objektivet hittills mikroskopet fokuserar på ca 500 µm från botten av plattan.
Obs: Celler i kollagenmatrisen som är för nära botten av plattan inte är helt inbäddade i 3D matrix. Imaging celler som är 500 µm från botten av plattan kommer att se till att cellerna inte påverkas av kanteffekter16,17,25. - Flytta scenen runt för att hitta cellerna och välj flera positioner för avbildning.
- Ställa in time-lapse experimentet med 2 minuters mellanrum.
Obs: Det maximala antalet positioner som kan tas under 2 min intervall begränsas av motoriserad scenen flytta hastighet, och längden på exponeringstiden för att fånga bilder.
5. kollagen nätverk Deformation under celldelningen (hög förstoring Microscopy)
- Slå på den levande cellen enhet monterad ovanpå objektivet. Vänta tills temperaturen stabiliserar vid 37 ° C, koncentrationen av CO2 är på 5% och luftfuktigheten är på 75%.
- För att visualisera kollagenfibrer i ofärgade 3D kollagen matriser, konfigurera confocal Mikroskop för att fånga endast reflekterade ljuset (488-nm) från 488-nm laser används för att belysa provet. Lasern använder en 60 X nedsänkning i vatten mål, NA = 1,2, WD = 200 µm, och styrs genom bildprogram.
- In enheten levande cell provet (celler i kollagen matriser). Hitta längst ner på plattan och sedan flytta objektivet hittills mikroskopet fokuserar på ca 100 µm från botten av plattan. Imaging celler som är 100 µm från botten av plattan kommer att se till att cellerna inte påverkas av kanteffekter.
Obs: Här en nedsänkning i vatten mål används istället för en Oljeimmer objektiv eftersom arbetsavstånd Oljeimmer linsen är bara ca 100 µm. Användningen av Oljeimmer linsen utgör ett problem som tjockleken på glaset på undersidan av plattan är normalt ca 100 µm. - Flytta scenen runt för att hitta cellerna och välj flera positioner för avbildning.
Obs: Konfokalmikroskopi avsnitt optiskt provet och endast fångar upp signaler från fokalplanet. Levande celler kan vara på väg in och ut ur fokus under time-lapse experimentet. För att aktivera den fånga cell bilder över långa tidsperioder, används Z-stack för att samla in bilder från successiva skivor 5 µm mellanrum. Totalt 5 skivor som spänner över 25 µm är avbildade. - Ställa in time-lapse experimentet med 5 minuters mellanrum.
Obs: 5 minuter används här som intervall i stället för 2 min används i avsnitt 4, eftersom flera skanningslägen, inklusive fluorescens skanning för H2B-mCherry, speglar skanning för kollagen och Z-stack skanning, tillämpas på varje position. Användning av flera skanningslägen minskar hastigheten på skanning en ställning jämfört med låg förstoring bildtagning. - Kvantifiera deformation av kollagen matris i närheten av en cell på grund av de krafter som utövas av cellen använder partikel imaging Velocimetri (PIV) med sub pixel upplösning20. Utföra denna analys på 2D-bilder möjliggör tydlig visualisering av båda signalerar av den H2B-mCherry och kollagenfibrer. Applicera den anisotropisk lågpass filtrering för att förbättra signalen av kollagen nätverk20.
- För att mäta den lokala förskjutningen av en sub bild region sevärdheter ligger på (x,y) från frame k frame k+ 1, extrahera ett regionala fönster 15 × 15 pixlar centrerad på (x,y) på frame k. Sedan identifiera den bästa matchningen platser (x,y) * genom de platser som har en maximal normaliserade cross-korrelationskoefficient i den bilden som erhålls vid frame k+ 1. Deformation vektorn beräknas som (x,y) *-(x,y).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med denna artikel är att presentera en tänkbar metod att studera däggdjur celldelning processer i 3D matriser och att kvantifiera samspelet mellan cellen och 3D extracellulärmatrix under och efter celldelning. För att underlätta bildtagning av cell Mitos, införlivas vi MDA-MB-231 celler med lentiviral transduktion H2B-mCherry. H2B konjugerat med fluorescerande proteiner används som mitotiska markör att skilja mitotiska celler från interphase celler, och att definiera olika stadier under cell Mitos19,20,26. Med den här metoden fick vi möjlighet att följa hela processen av MDA-MB-231-celler som uttrycker stabilt H2B-mCherry i 3D kollagen matriser (figur 1A). Mitotiska faser började med upplösningen av det nukleära membranet (profas, bildruta 1, figur 1A); ren-organization av kromosomerna (metafasen: Rama 2); anpassningen av kromosomerna mitt i cellkroppen (metafas, ram 3); separation av kromosomerna (anaphase ram 4); omorganiseringen av kromosomerna och nukleära membranet, och avskiljandet av kropparna av de två dottercellerna (Telophasen/cytokines, ram 5).
Spridning är celler i en 3D matrix oftast mycket lägre än sina motsvarigheter på ett 2D-substrat, som återger kontrollen av celldelning i 3D mindre effektiva19. För att effektivisera studera 3D celldelning, använde vi en metod som kombinerar tymidin, nocodazole och en shake-off-teknik för att synkronisera och välj MDA-MB-231 celler som är på den mitotiska fasen. Synkroniserade cellerna var sedan bäddas in i kollagen matriser. Division processen för flera celler var övervakas i realtid med hjälp av live-cell imaging vid 10 X förstoring. Cirka 70% av cellerna delade inom de första 2 h efter bildandet av kollagen matris (figur 2), vilket möjliggör effektiv övervakning av Mitos i 3D (figur 2).
För att övervaka samspelet mellan celler och deras omgivande kollagen matriser, kombinerade vi confocal speglar mikroskopi till bild kollagenfibrer och fluorescensmikroskopi till bild cellerna. En 60 X objektiv tillåter för fångst av högkvalitativa bilder av kollagenfibrer. Imaging använder en hög förstoring lins, som fångar färre celler i varje synfält, är mycket lägre kapacitet jämfört med användning av låg-förstoring på 10 X eller 20 X. Lyckad synkronisering av cellerna förbättrar effektiviteten och genomströmning av sådant experiment, eftersom de flesta av de synkronisera cellerna dela upp inom de första 2 h efter bildandet av kollagen matris. Matrix deformationen under och efter celldelningen är visualiseras (representant ögonblicksbilder visas i figur 1B) och kvantifieras med hjälp av en anpassad PIV-programvara. Vi kvantifieras och jämförde matrix deformation under interfasen och mitotiska fas för celler som synkroniseras till den mitotiska fasen. Vi observerade att matrix deformation förändrats mycket lite under den mitotiska fas (figur 3A) och är mindre än deformation iakttas i efter mitotiska faser (figur 3B). Detta resultat visar att däggdjursceller har minimal fastsättning och interaktion med den omgivande matrisen medan de är i den mitotiska fasen.
Figur 1: representativa micrographs erhålls från en hög förstoring live-cell imaging video av en MDA-MB-231 cell inbäddade i en kollagenmatrisen som stabilt uttrycker H2B-mCherry. (A) olika faser av den mitotiska progressionen av MDA-MB-231 cellen definieras av H2B-mCherry som märkt i rött. (B) kollagenfibrer (vit) under mitotiska processen visualiseras av tidsberoende confocal speglar mikroskopi. Skalstapeln = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: Division av synkroniserade cellerna i 3D kollagen matriser. Cellerna var synkroniseras till G2/M fas och inbäddade i en kollagenmatrisen. Cirka 70% av synkroniserade celler delar inom de första 2 h, medan kontrollen celler utan synkronisering klyftan slumpmässigt. Felstapel = SEM (standardfelet för medelvärdet). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: kvantifiering av matrix deformation för MDA-MB-231 celler under interfasen och Mitos. (A) ändringen i omfattningen av matrix deformation för matrix-embedded MDA-MB-231 celler. Den gröna pilen anger profas och röda pilen anger Telophasen. (B) kvantifiering av matrix deformation för MDA-MB-231 celler under interfasen och mitotiska fas, vilket indikerar att matrix deformation är minimal under celldelningen. Felstapel = SEM (standardfelet för medelvärdet). * p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidigare studier av celldelning i 3D var inte effektiv på grund av experimentella begränsningar och tekniska utmaningar18,19. De kritiska steg för effektiv studie av däggdjur celldelning i 3D kollagen matriser är: (1) införlivandet av fluorescens-märkt mitotiska markörer i cellerna; (2) synkronisering av celldelning; och (3) övervakningen av division händelser i 3D matriser använder live-cell bildteknik, tid-löst confocal speglar mikroskopi och kvantitativ bildanalys.
Mitotiska celler på 2D substrat kan särskiljas från de interphase celler baserat på deras morfologi, dvs mitotiska celler är runda och knappt koppla till substratet medan interphase celler utspridda och fäst ordentligt till substratet. I 3D matriser, dock i cellmorfologi är inte en tillförlitlig markör för mitotiska celler eftersom vissa celler som knappt utspridda och förbli runda i matrix27,28. Därför är det viktigt att införa en mitotiska markör till cellerna för studiet av celldelning i 3D matriser. Vi uttryckte stabilt H2B-mCherry i MDA-MB-231 celler, som tjänade som en pålitlig markör för olika mitotiska faser inklusive profas, metafasen, metafas, Anaphasen och Telophasen/cytokines. Vi har tidigare använt denna metod för att skilja mitotiska celler från interphase celler i 3D matriser. Med hjälp av denna markör har vi också kunnat mäta längden på den mitotiska fasen för en annan cell linje, HT1080 celler, att dela på substrat för 2D och 3D matriser19.
I området i närheten finns det flera sätt att synkronisera celler, inklusive serum svält29, mitotiska shake-off30,31, dubbel tymidin blockerar32, och nocodazole32. Vi kombinerade tymidin behandling och nocodazole behandling effektivt synkronisera MDA-MB-231 celler till fasen G2/M. Celler utsätts för tymidin arresteras på G1/S övergången och hela S fas på grund av hämning av DNA-syntes av tymidin. Frisättningen av cellerna från tymidin exponeringen låt celler framsteg till G2/M fas för celler som gripits på G1/S fas, och till G1 för celler som gripits på S fas. Alla celler utsätts för nocodazole arresteras på G2/M fasen. Rundade upp cellerna in mitotiska fas var sedan skakas ut från plattan och direkt inkapslade i kollagen matriserna. Vi visade att cirka 70% av cellerna delar inom 2 h efter de införlivas i kollagen matriserna (figur 2). Alternativt, celler kunde bäddas in i kollagen matriser före synkroniseringen, dock tvärbunden nätverket av kollagen matris presenterar en fysisk barriär och minskar andelen Biomolekylär diffusion och konvektion33, 34. faktiskt, vi försökte synkronisera celler i kollagen matriser använder tymidin och nocodazole, men misslyckades att få effektiv synkronisering. Detta resultat kan bero på den ineffektiva diffusion och konvektion av droger genom kollagenmatrisen.
Reflektion är en inneboende optiska egenskapen hos många biopolymerer, inklusive kollagen. Confocal speglar mikroskopi tekniken visualiserar och quantitates microtopography porösa biomaterial beredd från syntetiska polymerer och 3D kollagen matriser23,24,35,36 ,37. I vårt labb har vi tekniker för att övervaka förändringar i kollagen fiber polaritet som koncentrationen av kollagen varierar38. Här beskriver vi metoden för att övervaka deformeringen av kollagenfibrer baserat på time-lapse video av reflekterande confocal bilderna att beteckna cell-matrix interaktionen. De representativa resultat som presenteras här visar att matrix deformation för de mitotiska MDA-MB-231-cellerna är betydligt mindre än de cellerna i interphasen, vilket tyder på att däggdjursceller har minimal fastsättning och interaktioner med den omgivande matrix när de anger mitotiska fas19.
Tidigare använde vi confocal speglar mikroskopi att övervaka och kvantifiera cell-matrix interaktion före, under och efter Mitosen av HT1080 celler. Vi har också övervakat matrix deformation av β1-integrin knock-down HT1080 celler under både interphase och mitotiska fas. Bryter ned ozonskiktet β1-integrin avsevärt minskar matrix deformation av cellen under interfasen. Det finns dock ingen skillnad i matrix deformation under den mitotiska fasen av runda β1-integrin knockdown (KD) cellerna och HT1080 vildtyp celler19.
En alternativ metod att visualisera kollagenfibrer är att anställa fluorescens-konjugerad typ I-kollagen. Vi har tidigare använt detta förhållningssätt till bild spår i kollagen matriserna genereras av celler19. Detta tillvägagångssätt, men kräver märkning av kollagen med fluorescerande färg såsom fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC), som är både tidskrävande och mindre effektiv. Däremot, kan confocal speglar mikroskopi tillämpas direkt på oförändrad kollagen att spara tid och resurser, och utesluta de frågor som är associerad med fluorescens fotoblekning. Dessutom denna metod kräver inte en enskild fluorescerande kanal, och därför är kompatibel med alla fluorescerande färgämnen.
Metoden presenteras i denna uppsats kan potentiellt användas till någon typ av däggdjursceller som delar i en 3D kollagenmatrisen. Införlivandet av den H2B-mCherry markören i andra däggdjursceller genom lentiviral transduktion kommer att följa exakt samma förfaranden som beskrivs i uppsatsen, även om olika typer av celler kan ha varierat effektivitetsvinster för transduktion av lentivirus 39. både tätheten av cellerna vid transduktion och antikroppnivåns på viruset kunde optimeras för effektivitet. Om hög transduktion effektivitet inte kan uppnås, kan celler väljas av fluorescens assisterad cell sortering (FACS). Tymidin blockering och nocodazole används för att framgångsrikt Synkronisera flera andra typer av däggdjursceller, såsom HeLa40. Mekanisk shake-off skulle kunna tillämpas på alla celltyper som runda upp och knappt fästa vid underlaget under mitotiska fas30,31. Dessutom kan bildtagning av kollagenfibrer som använder confocal speglar mikroskopi och kvantifiering av matrix deformation tillämpas direkt på alla andra typer av dividera däggdjursceller.
Metoden presenteras här är ett effektivt och allmänt förhållningssätt att studera däggdjur celldelning och cell-matrix interaktioner i en 3D-miljö. Metoden underlättar vår sond in i den molekylära basen för utvecklingen av normal vävnad och sjukdomar, och förstärker designen av nya diagnostiska och terapeutiska metoder i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH grants R01CA174388 och U54CA143868. Författarna vill erkänna PURA tilldelning från Johns Hopkins University för stöd av Wei-tong Chen. Detta material bygger på arbete stöds av National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant nr 1232825.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human embryonic kidney 293T | ATCC | ||
| MDA-MB-231 | Physical Sciences Oncology Center, NIH | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM powder | ThermoFisher Scientific | 12100-046 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin-Streptomycin 100X | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Lipofectamine 2000 | Life technologies | 11668-07 | |
| Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector | Addgene | plasmid 21217 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Sodium bicarbonate | GibcoBRL | 11810-025 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 113375-100 | |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| NaOH | J.T. Bake | 3722-01 | |
| Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm | Millipore | SLHVM33RS | |
| Nikon TE2000E epifluorescence microscope | Nikon | TE2000E | |
| Cascade 1K CCD camera | Roper Scientific | ||
| NIS-Elements AR imaging software | Nikon | ||
| Nikon A1 confocal microscope | Nikon | A1 |
References
- Ly, D. H., Lockhart, D. J., Lerner, R. A., Schultz, P. G. Mitotic misregulation and human aging. Science. 287 (5462), 2486-2492 (2000).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
- Brinkley, B. R. Managing the centrosome numbers game: from chaos to stability in cancer cell division. Trends Cell Biol. 11 (1), 18-21 (2001).
- Phillip, J. M., Aifuwa, I., Walston, J., Wirtz, D. The Mechanobiology of Aging. Annu Rev Biomed Eng. 17, 113-141 (2015).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Martin, M. D., et al. Effect of ablation or inhibition of stromal matrix metalloproteinase-9 on lung metastasis in a breast cancer model is dependent on genetic background. Cancer Res. 68 (15), 6251-6259 (2008).
- Knox, J. J., Hotte, S. J., Kollmannsberger, C., Winquist, E., Fisher, B., Eisenhauer, E. A. Phase II study of Triapine in patients with metastatic renal cell carcinoma: a trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group (NCIC IND.161). Invest New Drugs. 25 (5), 471-477 (2007).
- Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D. L., Fojo, A. T. Inhibitors targeting mitosis: tales of how great drugs against a promising target were brought down by a flawed rationale. Clin Cancer Res. 18 (1), 51-63 (2012).
- Tong, W. G., et al. Phase I and pharmacologic study of SNS-032, a potent and selective Cdk2, 7, and 9 inhibitor, in patients with advanced chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma. J Clin Oncol. 28 (18), 3015-3022 (2010).
- Matulonis, U. A., et al. Phase II study of MLN8237 (alisertib), an investigational Aurora A kinase inhibitor, in patients with platinum-resistant or -refractory epithelial ovarian, fallopian tube, or primary peritoneal carcinoma. Gynecol Oncol. 127 (1), 63-69 (2012).
- Boss, D. S., et al. Clinical evaluation of AZD1152, an i.v. inhibitor of Aurora B kinase, in patients with solid malignant tumors. Ann Oncol. 22 (2), 431-437 (2011).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 211-224 (2006).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).
- Giri, A., et al. The Arp2/3 complex mediates multigeneration dendritic protrusions for efficient 3-dimensional cancer cell migration. FASEB J. 27 (10), 4089-4099 (2013).
- Fraley, S. I., Feng, Y., Giri, A., Longmore, G. D., Wirtz, D. Dimensional and temporal controls of three-dimensional cell migration by zyxin and binding partners. Nat Commun. 3, 719 (2012).
- Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
- Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. J Cell Biol. 205 (2), 155-162 (2014).
- He, L., et al. Local 3D matrix confinement determines division axis through cell shape. Oncotarget. 7 (6), 6994-7011 (2016).
- Held, M., et al. CellCognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7 (9), 747-754 (2010).
- Fallica, B., Maffei, J. S., Makin, G., Zaman, M. Alteration of cellular behavior and response to PI3K pathway inhibition by culture in 3D collagen gels. PLoS One. 7 (10), e48024 (2012).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-20 (2010).
- Gunzer, M., Kampgen, E., Brocker, E. B., Zanker, K. S., Friedl, P. Migration of dendritic cells in 3D-collagen lattices. Visualisation of dynamic interactions with the substratum and the distribution of surface structures via a novel confocal reflection imaging technique. Adv Exp Med Biol. 417, 97-103 (1997).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. J Vis Exp. (80), e50763 (2013).
- Lleres, D., James, J., Swift, S., Norman, D. G., Lamond, A. I. Quantitative analysis of chromatin compaction in living cells using FLIM-FRET. J Cell Biol. 187 (4), 481-496 (2009).
- Poincloux, R., et al. Contractility of the cell rear drives invasion of breast tumor cells in 3D Matrigel. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (5), 1943-1948 (2011).
- Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
- Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods Mol Biol. 761, 75-83 (2011).
- Jackman, J., O'Connor, P. M. Methods for synchronizing cells at specific stages of the cell cycle. Curr Protoc Cell Biol. 8, (2001).
- Zwanenburg, T. S. Standardized shake-off to synchronize cultured CHO cells. Mutat Res. 120 (2-3), 151-159 (1983).
- Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol Biol. 296, 157-166 (2005).
- Kihara, T., Ito, J., Miyake, J. Measurement of biomolecular diffusion in extracellular matrix condensed by fibroblasts using fluorescence correlation spectroscopy. PLoS One. 8 (11), e82382 (2013).
- Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys J. 83 (3), 1650-1660 (2002).
- Harjanto, D., Maffei, J. S., Zaman, M. H. Quantitative analysis of the effect of cancer invasiveness and collagen concentration on 3D matrix remodeling. PLoS One. 6 (9), e24891 (2011).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).
- Petroll, W. M. Differential interference contrast and confocal reflectance imaging of collagen organization in three-dimensional matrices. Scanning. 28 (6), 305-310 (2006).
- Fraley, S. I., et al. Three-dimensional matrix fiber alignment modulates cell migration and MT1-MMP utility by spatially and temporally directing protrusions. Sci Rep. 5, 14580 (2015).
- Ikeda, Y., Collins, M. K., Radcliffe, P. A., Mitrophanous, K. A., Takeuchi, Y. Gene transduction efficiency in cells of different species by HIV and EIAV vectors. Gene Ther. 9 (14), 932-938 (2002).
- Ma, H. T., Poon, R. Y. Synchronization of HeLa cells. Methods Mol Biol. 761, 151-161 (2011).
