Summary
Denne protokollen beskriver teknikker for å vurdere kjemiske cross-linking av kanin sclera bruker andre harmonisk generasjon bildebehandling og differensial skanning calorimetry.
Abstract
Metoder for å styrke vev ved å innføre kjemisk obligasjoner (ikke-enzymatisk cross-linking) i strukturelle proteiner (fibrillar collagens) for terapi inkluderer fotokjemisk cross-linking og vev cross-linking (TXL) metoder. Slike metoder for å indusere mekanisk vev endringer er blir ansatt å hornhinnen i hornhinnen tynning (mekanisk svekket) lidelser som keratokonus samt sclera i progressiv myopi, tynt og svekkelsen av bakre sclera oppstår og trolig bidrar til aksial forlengelse. De primære målet proteinene for slike vev styrke er fibrillar collagens som utgjør majoriteten av tørrvekt proteiner i hornhinnen og sclera. Tilfeldig, er fibrillar collagens den viktigste kilden til andre harmonisk generasjon signaler i vev ekstracellulære plass. Derfor kan modifikasjoner av kollagen proteiner, slik som indusert gjennom cross-linking terapier, potensielt oppdages og quantitated ved hjelp av andre harmonisk generasjon mikroskopi (SHGM). Overvåking SHGM signaler ved hjelp av en laser skanning mikroskopi systemet kombinert med excitation infrarødt lys er en spennende moderne bildebehandling metode som nyter utstrakt bruk i biomedisinsk vitenskapene. Derfor studien ble gjennomført for å vurdere bruken av SHGM mikroskopi som et middel til å måle indusert cross-linking effekter i ex vivo kanin sclera, etter injeksjon av en kjemisk cross-linking agent i sub-Tenon plass (sT), en injeksjon tilnærming som er vanlig praksis for forårsaker okulær anestesi under ophthalmologic kliniske prosedyrer. Kjemisk cross-linking agent, er natrium hydroxymethylglycinate (SMG), en klasse av kosmetiske konserveringsmidler kjent som formaldehyd slippe agenter (FARs). Innbukking endringer etter reaksjon med SMG resulterte i en økning i SHG signaler og korrelert med endringer i termisk rødsprit temperatur, en standardmetode for å vurdere indusert vev cross-linking effekter.
Introduction
Progressiv myopi er postulert skal behandles gjennom ikke-enzymatisk Innbukking cross-linking (fotokjemisk og/eller kjemisk), som er fornuftig gitt at blokkerer kollagen enzymatisk cross-linking kan øke eksperimentelle skjemaet deprivasjon (FD)-indusert nærsynthet1. Elsheikh og Phillips2 nylig diskutert gjennomførbarhet og potensialet for å bruke standard UV-A bestråling (UVA)-riboflavin mediert fotokjemisk cross-linking (også kjent som Dresden protocol), forkortet som (riboflavin CXL) for bakre Innbukking stabilisering å stanse aksial forlengelse i myopi. Denne fotokjemisk metoden har blitt brukt til behandling av destabilisering av fremre verden overflaten (dvs., svulmende hornhinnen) sett i keratoconus og stolpe-LASIK keratectasia. Men hindret anvendelsen av denne CXL protokollen for sclera av spørsmål knyttet til vanskeligheter med tilgang til bakre sclera med en ultrafiolett (UV) lys kilde, samt behovet for å endre en mye større vev areal. Som blir sagt, CXL tilnærmingen er brukt til å stoppe aksial forlengelse i visuelt skjemaet fratatt kanin (av tarsorrhaphy), selv om flere områder av bakre sclera kreves flere separate bestråling soner i at studien3. Derimot kan injeksjon av en stabiliserende kjemiske middel (dvs., cross-linking agent) via sT plassen representere en enklere måte endre bakre sclera, unngå behovet for å innføre en UV lyskilde. Denne injeksjon teknikken er kjent som en nyttig måte å indusere okulær anestesi under ophthalmologic prosedyrer som cataract kirurgi4,5,6. Wollensak7 har beskrevet tidligere bruk av sT injeksjon med glyceraldehyde (en kjemisk cross-linking agent lignende i konsept til formaldehyd slippe agenter (FARs) beskrevet i denne studien) til stive kanin sclera og genipin vist seg å begrense aksial lengde i FD marsvin8,9. Disse etterforskere har vist en klar fordel av benytter en løselig kjemiske middel over fotokjemisk CXL teknikken. Dermed Innbukking cross-linking bruker en injiserbare kjemiske middel av noen type, inkludert FARs (dvs., TXL)10, kan gi en mulig behandlingsmetode å stoppe utviklingen av Innbukking forlengelse sett i myopi.
I protokollene som presenteres her, bruker vi en kjemisk cross-linking løsning av natrium hydroxymethylglycinate (SMG), levert via sT injeksjon til sclera cadaveric kanin øyne. Vi har implementert lignende protokollene tidligere for aktuell kjemiske cross-linking i hornhinnen. Spesielt i de tidligere rapportert studiene, kan konsentrasjon avhengige cross-linking effekter oppnås ved hjelp av SMG, med en effekt rekkevidde som spenner over som oppnåelig med fotokjemisk CXL som termisk rødsprit analyse11 .
Her beskriver vi for å vurdere cross-linking effekten av SMG levert via sT injeksjoner til Innbukking vev, termisk rødsprit differensial skanning Calorimetry (DSC) og andre harmonisk generasjon mikroskopi (SHGM).
Ved hjelp av differensial skanning calorimetry (DSC), også kjent som termisk analyse, er en termisk rødsprit overgang målt, som for Innbukking vev er hovedsakelig guidet av egenskapene til de fibrillar collagens, siden de utgjør flertallet bulk protein. Denne metoden evaluerer stabiliteten av kollagen molekylær struktur og krysskoblet obligasjoner som stabiliserer kollagen fibrils, den fremste tertiære protein-strukturen. Under oppvarming i DSC, er en kritisk overgang temperatur oppnådd som resulterer i denaturering av kollagen molekylet, noe som resulterer i uncoiling av trippel helix, en prosess som det er kjent som gelatin. Dette termiske rødsprit forstyrrer hydrogenbindinger langs kollagen molekylet og kan bli forskjøvet til høyere temperaturer gjennom indusert cross-linking metoder12,13. Denne metoden er brukt i mange tiår, spesielt i industrien for biologisk materiale og prosesser som inkluderer skinn-making. Men denne metoden krever utvinning av sclera vev og derfor kan bare være nyttig som en ex vivo teknikk.
Andre-harmoniske generasjon mikroskopi (SHGM) er basert på den ikke-lineære optiske egenskapene av bestemt materiale, med ikke-centrosymmetric molekylær miljøer. Slike materialene intens lys, for eksempel lys produsert av lasere, genererer SHG signaler, der det innfallende lyset er doblet i frekvens. Biologisk materiale som kan opprette SHG signaler er kollagen, piskehale som henger og muskel myosin. For eksempel vil kollagen spent med et infrarødt lys av 860 nm bølgelengde avgi en SHG signalet i det synlige området med 430 nm bølgelengde. Andre harmonisk generasjon (SHG) signal imaging er en lovende metode for å vurdere terapeutiske kollagen cross-linking. Det har vært kjent i over 30 år at kollagen fibrils vev avgir SHG signaler14. Men kan bare nylig Høyoppløslige bilder hentes15 ulike vev, inkludert sene16, hud, brusk17, blodkar18, og kollagen gels19.
Basert på denne kunnskapen, evaluerer denne studien SHG signal endringene indusert i sklera gjennom SMG kjemisk indusert cross-linking av kollagen. Resultatene tyder på at SMG endring av sclera øker SHG signalene produsert fra vev kollagen fiber bunter (høyere orden kvartær strukturen består av kollagen fibrils) og produserer også en strukturell morfologiske endring i kollagen nettverk, gjenspeiles i fiber bunt "rette."
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som ble utført med cadaveric kaninøyne innen intakt outbred kanin hoder. Alle Institutional og nasjonale retningslinjer og bruk av forsøksdyr ble fulgt.
1. forberedelse av løsninger
- SMG forberedelse til TXL:
- Forberede 1 mL av 0,2 M konsentrasjon av natrium bikarbonat løsning (NaHCO3) løsning med 0.0165 g NaHCO3 pulver oppløst i 1 mL destillert vann.
- Oppløse 0.1016 mg av pulverisert natrium hydroxymethylglycinate (SMG) i 1 mL destillert vann å få en endelig konsentrasjon av 800 mM SMG. Justere natriumbikarbonat løsning på en siste konsentrasjon av 0.1 M NaHCO3 og 400 mM SMG. Konsentrasjoner av SMG avhengig av cross-linking effekten ønsket. I protokollen beskrevet her brukte vi 40, 100 og 400 mM SMG.
2. subTenon injeksjon for TXL bruker SMG
- Fylle to 1 mL insulin sprøyter (25G nåler) med 400 µL kontroll og SMG løsning, henholdsvis.
- Plass kaninens i en profil fly ved hjelp av en pute. Styrofoam eller en papirbunke kan brukes å fikse hodet i en optimal posisjon.
- Trekke øyelokkene med en pediatrisk øye spekulum.
- Måle det første intraokulært trykket (IOP) bruker en applanation tonometry enhet.
- Merke tiltenkte injeksjonsstedet på den øvre midtre delen av limbus med merketråd vev.
- Trekke Konjunktiva rundt injeksjonsstedet med en conjunctival tang (eller noen tang med taggete runde spissen) og sett inn nålen gjennom Konjunktiva, inn Tenon's capsule litt utenfor merket limbal området (dvs.2-3 mm fra limbus). Et lite innsnitt i Konjunktiva kan også gjøres med iris saks for å lette passering av nålen gjennom Tenon's capsule.
- En gang innenfor Tenon's capsule, kontrollerer du at nålen er fritt mobile ved å flytte den til siden. Samtidig bør verden ikke flytte. Dette bekrefter riktig plassering av nålen over sclera i den sub-Tenon's (sT) plass.
- Injisere løsningen fra sprøyten og kaste nålen. Umiddelbart etter injeksjon, væsken vil akkumuleres i sT rommet skaper en fremre bule sett gjennom Konjunktiva (dvs., chemosis).
- Gjenta IOP måling for å bekrefte at det ikke endre på grunn av et utilsiktet perforering av verden.
- Fjern lokket spekulum, og utføre digitale massasje gjennom de lukkede øyelokkene i ca 2-3 min.
- La hodet for en inkubasjonsperiode på 3,5 t (romtemperatur = 18 ° C), tidligere å flytte til neste trinn.
3. vev forberedelse
- Trekke øyelokkene med øyelokket spekulum for å optimalisere tilgang til verden. Velg optimal størrelse spekulum avhengig av øyet.
- Skille Konjunktiva rundt på limbus. Hvis det har allerede blitt en avbildning i nærheten injeksjonsstedet, circumferentially utvide grenser så den vil inneholde en inoculum størrelsen på ca 1 x 1 cm.
- Kuttet ekstra okulær musklene på sine områder av Innbukking innsetting.
- Heve øyeeplet med tang, skyve den fra den bakre siden. Dette gir tilgang til bakre verden vil lette kutting av synsnerven med ophthalmica arterien og venen ligger nær den bakre Polen på kloden.
- Kuttet ut corneoscleral komplekset, med den ytre kantlinjen inkludert merket innsprøytingen sted. Flekken skal fortsatt være synlig på den gjenværende delen av sclera.
- Fjern corpus vitreus og alle lag festet til innsiden av sclera ved å bruke trekkraft med tissue tang.
Merk: Ytterligere skritt er avhengig av følgende fremgangsmåter utføres: 4. - DSC analyse, 5. - SHG mikroskopi.
4. for Regional DSC-analyse
-
For behandlede øyet: kuttet ut fire Innbukking sektorer fra gjenværende Innbukking cup med saksen på injeksjonsstedet ligger i øvre sektor og justert sentralt. Kuttet de resterende 3 sektorene fra begge lateral sider (dvs., nese og tidsmessige), og bunnen.
Merk: nummereringen av sektorene (1-4) som er videre delt inn i ruter (1-16) er vist i figur 1A. - Skjær Innbukking sektorene (1-4) i mindre ruter (1-16) ca 4 x 4 mm hver. Sektor 1 skal deles inn i 9 firkanter (lage nøyaktige stedet for injeksjon en enkelt firkant [rute 2]). Dele sektorer 2 og 3 til 2 rutene (ruter 10-11 og 12-13) og sektor 4 i 3 ruter (ruter 14-16).
- Knytte et nummer til hvert kvadrat, som vist i figur 1A, for å lokalisere avstanden av analysert vev fra plasseringen av injisert området.
- For kontrollen øyet: etter dele vevet i fire Innbukking sektorer (lik behandlet vev) kuttet ut kvadrat biter av vev fra følgende steder: 3 ruter fra den øverste sektoren (sektor 1), 1 fra hver side (sektorer 2 og 3) og 1 fra den bunnen sektor (sektor 4).
- Skrape av gjenværende netthinnen og choroidal lag og vaske to ganger med frisk PBS hver gang forlate bitene neddykket i løsning for ca 10 s samtidig.
5. for SHG Imaging
- Klipp den øvre delen av sclera med saks for å lage en 1 x 1 cm området med injeksjonsstedet justert sentralt.
- Skrape av gjenværende netthinnen og choroid lag og vaske to ganger med frisk PBS hver gang forlate bitene i løsning for ca 10 s.
- Stedet vevet i 1 mL rør fylt med PBS løsning for transport til funksjonen tenkelig. Alle prosedyrer, etter inkubasjon tiden og begynner med Disseksjon av øyeeplet skal utføres innen en time.
6. mikroskopi-protokollen
Merk: Denne protokollen for bildebehandling tilbake-spredt SHG signalet fra kollagen av sclera vev er skreddersydd for laserskanning mikroskop.
-
Mikroskopi satt opp
- For å maksimere optimalisere signalet og oppløsning når utføre SHG mikroskopi bruker en linsen for å overføre infrarødt lys, og med en høy numeriske blenderåpning (NA). Vårt mål er Nikon Apo LWD 25 x / NA1.1 vann nedsenking.
- Justere korreksjon kragen på objektivet tilsvarer dybden i utvalget, i dette tilfellet som er tykkelsen på dekkglassvæske, 0,17 millimeter.
- Montere den 25 x linsen og legge til en generøs mengde smøring vannbasert gel å dekke tenkelig overflaten før montering prøven. Gel vannbasert ikke vil fordampe under eksperimentet, og dermed beholde bildekvalitet.
- Plass Innbukking vev fra en 1 mL tube med PBS uten å tørke mellom to 25 mm runde coverslips (episcleral side ned) gir maksimal kontakt mellom episclera og dekkglassvæske overflaten.
Merk: Vevet kan også plasseres avdekket på dekkglassvæske. En god mengde PBS bør holde vevet hydrert under bildebehandling. I dette tilfellet legge vev brikken og PBS etter montering av cellchamber. - Montere celle kammeret ved å plassere en 25 mm runde dekkglassvæske, enkelt eller i en sandwich teknikk, på den nederste delen av kammeret og skru den øverste delen ned for å skape en forseglet runde kammer. Ikke skru ned tett når en topp dekkglassvæske brukes, for å unngå sammenslåing av kunstig og skade vevet.
- Monter til celle kammeret vev prøven på mikroskopet scenen.
- Satt mikroskop for øye utsikt med lyset.
- Plasser scenen og justere høyden på målet slik at lavere overflaten av prøven er i fokus, som bestemmes av lyse feltet inspeksjon gjennom øyet.
- Slå av alle lys bortsett fra dataskjermen og blokkere så mye lys fra skjermen som mulig med aluminiumsfolie ark drapert på mikroskopet scenen. Minimere alle uønsket lys når detektorer sikrer lav støy oppkjøpet, som de GaAsP NDD detektorer har høy følsomhet.
- Kontroller at linsen definisjonen er riktig i Ti Pad-panelet av programvaren.
- I A1 kompakt GUI-panelet velge IR laser for bildebehandling, Velg NDD detektorer og velg DAPI kanalen som er utstyrt med en 400-450 nm Båndpassdesign filter.
- I A1 MP GUI-panelet angir bølgelengden til infrarød laser 860 nm og åpne skodde.
- Angi laserskanning forhold i A1 kompakt GUI panel som følger. Velg: (a) Galvano skanner, (b) enveis skanning, (c) Pixel bor tid 6.2 µs, (d) ramme størrelse 1024 x 1024 piksler (e) linje snitt 2 x
Merk: Galvano skanner og enveis skanning sikrer nøyaktig punkt til punkt-justering. En størrelse på 1024 x 1024 for hele synsfeltet oversettes til en pikselstørrelse på 0,5 μm /pixel. Linje snitt vil redusere skutt støy i bildet. - Angi imaging forhold i A1 kompakt GUI panel ved å justere laser makt og detektor gevinst. Åpne se opp tabell-panelet (LUTs) som viser et histogram for intensitet bildepunktverdiene i gjeldende bilde. Slå på live bildebehandling i "Finne"-modus og maksimere pixel oppdaget verdiområdet ved å justere laser makt og detektor gevinst. Unngå metning. Vanlige verdier er 2,5% laser makt, fra totalt 2,35 W på 860 nm og 100 HV (detektor gevinst).
- Merk: For dette oppsettet er laser makt målt med en intern strømmåleren 5.2 mW. Hver gang et eksperiment er utført, Juster ønsket laser slik at den interne ytelsesmåling er konstant på 5,2 mW mellom tenkelig økter. Forsiktighet bør utvises når laser makt. Chameleon II laseren er en 3 M laser på 800 nm og 10% eller høyere makt kan potensielt indusere vevsskader.
-
Bildeopptak
- I forhåndsvisningsmodus, skanne vevet området ved hjelp av verktøyet XYZ oversikt.
- Angi avbilding lavere oppløsning (256 x 256 piksler og ingen linje snitt) å fremskynde oppkjøpet av bildene i denne modusen.
- Fange 5 x 5, 3 x 3 eller enkelt synsfelt å dekke hele overflaten av vev. På hvert sted, før oversikt, slå på live "Scan"-modus og bringe vevet i fokus. Merk at forskjellige områder av vev vil ha litt forskjellige posisjoner i aksial retning.
- Finne et flatt område hvor kollagen fibrene er sett i hele synsfeltet, og dobbeltklikk den posisjonen i oversikt-verktøyet til å flytte scenen til det aktuelle stedet.
- Slå på live "Scan" modus, justere Z plasseringen av målet slik at bunnen flyet er i fokus, og i Ti puten, bruke Z stasjonen flytte optisk flyet 10-15 μm over denne nederste laget.
- Få et bilde med høy oppløsning med 1024 x 1024 piksler og 2 x gjennomsnitt, bruker "Kopier"-knappen.
- Lagre plassering i XYZ oversikten ved hjelp av knappen "+". Dette sikrer at det samme området av vev ikke er gjenerobret.
- For hver del av fange 10 bilder av ikke-overlappende synsfelt.
7. DSC-protokollen
Merk: Fortsett til dette trinnet snarest vev forberedelse er fullført, for regional DSC analyse, eller etter vev imaging når SHGM utføres.
- Forberede DSC panner, veid og merket.
Merk: Dette trinnet bør gjøres før vev disseksjon for å minimere vev uttørking. - Tørr hvert Innbukking kvadrat med en absorberende vev og legg den flatt på bunnen av en DSC panne med tenner tang.
- Veie kjelen med vev inni og lokk crimped og dekket å få vevet våt vekt (massen av prøvene skal være i størrelsesorden 5 til 11 mg).
Merk: Seal hver pan bruker crimper før du fortsetter til neste vev prøven. Pannene er hermetisk forseglet, forebygge vanntap før termisk analyse. - Når prøven er crimped, plassere den på den angitte plasseringen DSC-skuffen. Det bør være 6 utvalgene for kontroll og 16 for behandlet øyet.
- Opprette en metode som bruker instrumentet administrere programvare, angir vekten av vev, og kjøre den termisk analysen ved hjelp av følgende parametere: temperaturområde på-40 til 80 ° C, oppvarming rate: 1 ° C/min, varme flow: 17.37 mW, gasstrømmen (N2): 19,8 mL/min, Gass pressure: 2,2 bar.
- En gang fullført, analysere dataene for hvert utvalg av utdrager overgang temperatur toppen på som termisk rødsprit skjer ved hjelp av instrumentet administrere programvare.
8. bildeanalyser
-
SHG Signal
- Velg minst 5-10 mest representative bilder fra hver behandling og dens kontroll, slik at området av bildet er opptatt av det meste kollagen fibrene.
- Laste opp hvert bilde i ImageJ programvare og måle gjennomsnittlig pixel intensiteten ved å velge analyser > mål for det aktive bildet.
- Verdiene hentes rapporteres som mener pixel intensiteten og kan også vises ved å plotte histogrammet av innhold ved å velge fra menyen analyser > Histogram.
- Bruke en Excel-ark, lage en tabell til å dokumentere alle målt data følgelig eksempel ID.
- Beregn gjennomsnittet og standardavviket for pixel intensitet for hver behandling og kontroll tilstand.
- Ved hjelp av student t-test, sammenligne forskjellene for alle parvis sammenligninger av konsentrasjoner (dvs., 40 mM SMG vs 0 og 400 mM SMG vs 0). [P≤0.05].
-
Waviness
- Velg et bilde som viser kollagen fibrene. Minst 10 bilder per prøve skal analyseres (inkludert en kontroll prøven for hver konsentrasjon - minst 40 totalt).
- Åpne ImageJ > Plugins > NeuronJ. NeuronJ krever tidligere installasjon.
- Last opp alle imagesby å dra til et åpent NeuronJ vindu.
- Opprette sporing linjer langs fibrene, følger konturene av fibril med musen (penn tegnebrett kan brukes), klikk M å måle avstanden totale fiber lengde.
- Velg "Alternativet" tegne en tangentiell rett linje og koble begynnelsen og slutten av tidligere trukne fiber konturen. Klikk M måle ende-til-ende lengden.
- Gjenta samme på minst 10 fibrils per bilde.
- Samle de to målingene fra hver av 10 fibrils og legge inn data i et excel-regneark, uttrykke totale fiber lengde (konturer) og gjennomgående lengde (direkte koble linjen) som lengde [kurve] og lengde [lineær], henholdsvis.
- Beregne waviness indeksen (W) ved hjelp av formelen: W = lengde [kurve] / lengde [lineær].
- Beregne % av waviness sammenligne data fra bilder av behandles samples(SMG) med bilder fra kontroll prøver ved å bruke formelen: (W [SMG] - 1) / (W [kontroll] - 1)
- Utfør en parvis t-test waviness indeksen (W) for å finne statistiske forskjellen (p-verdier) av kollagen fiber morfologi forskjellsbehandling forhold og kontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Termisk rødsprit temperatur (Tm) som en analysen metode for å vurdere TXL cross-linking effekt: Totalt 16 par kaninøyne ble brukt i disse eksperimentene TXL fremgangsmåten. Som en første del av denne studien, ble lokalisering av cross-linking effekten indusert av en enkelt injeksjon SMG cross-linking agent via sT plass i cadaveric kanin hodet evaluert. Denne typen eksperiment har relevans til klinisk behandling av pasienter, siden injeksjoner i flere steder kan være nødvendig å stabilisere et ønsket område på sclera.
Som ville bli spådd grunnleggende diffusivity prinsipper, var effekten størst på injeksjonsstedet med effekter indusert i tilstøtende områder, avhengig av konsentrasjonen av løsningene. Figur 1A representerer skjematisk plasseringen av Innbukking sektorer (1-4 i rødt hul tall) (videre inndelt i rutene (1-16 i svart tynn nummer skrift)) som gjennomgikk separate termisk rødsprit analyse etter en enkelt sT injeksjon med Fargeindeks for tilordning. Tabell 1 viser endringen i Tm verdier for hver nummererte sektor sammenlignet med tilsvarende kontrollen. Er inkludert for både 40 mM og 400 mM injeksjoner og inkluderer standard feil av gjsnitt beregnet for minst tre uavhengige bestemmelser.
Tallene 1B-C representerer resultatene med to ulike konsentrasjoner av SMG, 40 mM (figur 1B) og 400 mM (figur 1 c). I figur 1B, lavere konsentrasjon 40 mM prøven viste en mild Skift Tm som var kjent i rute 2 (injeksjonsstedet). Lignende Skift ble sett i tilstøtende firkantene 1 og 3 (lettere blå). Marginale Skift er sett i ruter 4 til 6 og 7 til 9 uten statistisk betydelige forskjeller mellom torget injisert. Ingen Tm Skift ble sett i de nederste rutene 14-16, som representerte den mest fjerntliggende sektoren fra injeksjonsstedet.
Som vist i figur 1 c, hadde høyere konsentrasjon (400 mM) en statistisk svært betydelig cross-linking effekt (angitt som nyanser av oransje). Et stort skifte i Tm med tilknyttede liten standardavvik og p < 0,05 ble observert, reflekterer en stor forskjell i effekten av 400 mM sammenlignet med lavere 40 mM konsentrasjon. De mest dramatiske effektene ble bemerket i sektor 1 i øvre verden. Med hensyn til de gjenværende sektorene, en mindre bevirke ble observert i ruter 10 og 14 (som kan ha vært på grunn av noen sporing cross-linking væske posteriorly) og ingen effekt ble observert i rutene 11, 12, 13, 15 og 16. Samlet cross-linking effektene var marginale innen 2 og 3 med ingen effekt i sektor 4 (dvs., det mest fjerntliggende stedet fra injeksjonsstedet) ligner på 40 mM prøven. Disse resultatene indikerte at det var en '' sone effekt '' og at denne typen mønster kan forventes etter en sT injeksjon av cross-linking agent. Dette kan indikere behov for injeksjon i flere steder for å indusere effekter over et stort område av vev.
Studie av cross-linking effekten indusert i intakt øynene vurdere TXL med to konsentrasjoner av SMG ble også fremført. Termisk rødsprit analyse av vev som gjennomgikk slike Innbukking cross-linking ble utført. Cross-Linking tid var 3,5 t for TXL bruker tre ulike konsentrasjoner, 40 (Tm = 1.11 +/-1.2), 100 (Tm = 5,12 +/-2.9), og 400 (Tm = 14.34 +/-1.1) mM SMG. Resultatene viste at det er en konsentrasjon avhengige effekt i SMG krysskoblet vev.
Andre harmonisk generasjon (SHG) imaging som metode for å vurdere TXL cross-linking effekt:
SHG mikroskopi bildene ble analysert både for pixel intensiteten av SHG signal og fiber bunt waviness. Et stort spenn av cross-linking konsentrasjoner (fra 40 til 400 mM) ble brukt for å utforske SHG signal endringene som kan oppstå over et bredt spekter av cross-linking effekter. Bruke histogrammet analyse evnen i Fiji bildebehandlingen programmet20, var det mulig å quantitate SHG signalet produsert i Innbukking vev av sT injeksjon, sammenligne effekten på 40 mM de indusert bruker 400 mM. Den gjennomsnittlige forskjellen i mener pixel intesities på 40 mM var 66.3 ± 27,7 sammenlignet 361.4 ± 28,3 for 400 mM prøvene, en nesten 6-fold økning. Dette samsvarer med en økning i vev cross-linking, siden tilsvarende økninger i Tm også ble registrert under disse forholdene. Figur 2 viser representant SHG bilder av sclera tatt fra kontroll (figur 2A), 40 mM (figur 2B) og 400 mM (figur 2C). Den medfølgende histogrammet analysen, inkludert mener lysstyrke (eller pixel intensitet) vises også. Totalt antall bilder analysert var: 120 for 40 mM og 98 for sin kontroll; 121 for 400 mM og 94 for sin egen kontroll. Dybden av vev imaging var 10 til 15 µm fra episcleral overflaten. Resultatene av histogrammet analyser, som involverte snitt av mange bildefelt, indikerte at høyere konsentrasjoner av cross-linking effekten (Figur 3) produsert større pixel intensiteter.
Som vist i Figur 4, ble en bildeanalyser også fremført med metoder adoptert fra hjerte blodkar litteratur, bruker ImageJ plugin ''Nevron J''21. Vi beregnet waviness faktoren W = lengde [kurve] / lengde [lineær] og vi observert at cross-linking resulterte i rette av fiber bunter som angitt av en redusert waviness % i 40 mM og 400 mM krysskoblet sclera versus ubehandlet kontroll scleri (W % = (W [ SMG]-1)/(W[Control]-1), tabell 2). Forskjellen i waviness mellom 40 og 400 mM SMG behandlet prøver var ikke statistisk signifikant.
Figur 1 : Lokalisering av TXL effekten via sT injeksjon bruker 40 og 400 mM SMG.
(A) skjematisk fremstilling av 4 Innbukking sektorer (tall 1-4 i store hul rødt), med sclera delt inn i ruter [tallene 1-16 i mindre svart tynn skrift] (ikke trukket skala) som gjennomgikk termisk analyse. Injeksjonsstedet tilsvarte det sentrale torget (rute 2) i sektor 1. Den termiske rødsprit cross-linking effekten av TXL med (1B) 40 mM SMG og (1 C) 400 mM SMG. (D) fargekodet temperatur skala forklaring for (B) og (C). Dette tallet er endret fra Zyablitskaya et al. med tillatelse22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representant bilder av konsentrasjon avhengige økninger i SHG signal lysstyrkenivåer produsert etter TXL bruker SMG via sT injeksjon av sclera ex vivo . Konsentrasjoner av SMG vises som (B) 40 mM og (C) 400 mM. Hvert bilde inneholder 50 µm skala bar (høyre nedre hjørne) og mener intensitet bildepunktverdi (øvre høyre hjørne) - absolutte verdier. Dette tallet er endret fra Zyablitskaya et al. med tillatelse22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Stolpediagram av endringen (Δ) av SHG signal pixel intensitet (sammenlignet med en sammenkoblet kontroll fra samme kanin hodet) i Innbukking intakt globes krysskoblet via sT injeksjon (TXL) med 40 og 400 mM SMG løsninger. Gjennomsnittlige verdiene med standard feil av gjsnitt var: 66 ± 27,7 for 40 mM og 361 ± 28,3 for 400 mM. Dette tallet er endret fra Zyablitskaya et al. med tillatelse22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Eksempel på fiber waviness analyse (som uttrykt av linearitet). Bilde av kontroll prøven for 40 mM SMG konsentrasjon med 50 µm skala bar (høyre nedre hjørne). Dette tallet er endret fra Zyablitskaya et al. med tillatelse22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Skjematisk fremstilling av sT injeksjon. Områder nummereres 1-3 tilsvarer områder i figur 1A. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| ±Δ Tm | ||
| området | 40mM | 400mM |
| 1 | 3.4 ±2.8 | 20.5 ±0.6 |
| 2 | 3.4 ±0.53 | 19.58 ±1.5 |
| 3 | 2.5 ±2.47 | 17.99 ±3.06 |
| 4 | 0,72 ±0.9 | 20.36 ±0.19 |
| 5 | 0,85 ±0.55 | 19.11 ±1.33 |
| 6 | 0.52 ±1.35 | 18.66 ±4.1 |
| 7 | 0.78 ±1.6 | 18.44 ±2.8 |
| 8 | 0.56 ±0.9 | 17.77 ±2.69 |
| 9 | 0.22 ±0.6 | 18.92 ±2.6 |
| 10 | 0,46 ±0 | 8.75 ±10.56 |
| 11 | 0.47 ±0.18 | 0.63 ±1.84 |
| 12 | 0,11 ±0.08 | 0,66 ±1.52 |
| 13 | 0,08 ±0.05 | 0.71 ±2.17 |
| 14 | 0.22 ±0.7 | 5.71 ±0.29 |
| 15 | 0.32 ±0.2 | 0.29 ±0.7 |
| 16 | 0,24 ±0.73 | 0,26 ±0.79 |
Tabell 1: DSC resultater for lokalisering av TXL effekt studie. Endringen i termisk smeltingen temperaturer (ΔTm) med standardfeil for hver samplet sektor er avbildet i figur 1A. Hver verdi er uttrykt som forskjellen i Tm ascompared sammenkoblet kontrollen og et gjennomsnitt av et minimum av 3 uavhengige bestemmelser.
| SMG, mM | Waviness | Waviness-% | t-test g. [0 mM SMG] |
| 0 | 1.106 ± 0.044 | 100 | |
| 40 | 1.067 ± 0.017 | 63 | p < 0,02 |
| 400 | 1.059 ± 0,009 | 55 | p < 0.003 |
| Lineær Fibre | 1.000 | 0 | |
| (Teoretisk) |
Tabell 2. Resultatene av fiber waviness analyse. SHG bilder fra området TXL injeksjon ble analysert for graden av fiber waviness bruker Nevron J programvare. Ti fibre ble valgt fra hvert bilde og totalt ca 100 fibre ble analysert grad av waviness. Gjennomsnittlige verdier med standard feil av gjsnitt er inkludert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utført eksperimenter har vist bevis som støtter bruk av SHG signal mikroskopi som en metode for evaluering av kollagen cross-linking effekter i sclera, øke fremtidige muligheten til å bruke denne teknikken som avlytting verktøyet for cross-linking behandlinger som mål kollagen proteiner. Av notatet er et instrument allerede i klinisk bruk som potensielt kan fange SHG signalet. Selv om dette instrumentet ble hovedsakelig utformet for imaging huden menneskelige dermis, er det brukt med hell bilde hornhinnen og sclera23.
Det er nødvendig for å opprettholde samme skanning og imaging forhold når man sammenligner kontroll og behandlet prøver. Andre harmonisk generasjon mikroskopi av kollagen i sclera vev krever fluorescens mikroskop kompatibel med flere Foton bildebehandling, en pulserende infrarød laser tunable i 800-900 nm bølgelengdeområde, og en svært følsom detektor som Amstel ikke-descanned (NDD) detektorer. Retningslinjene beskrevet i dette manuskriptet er et utgangspunkt. Betingelsene skal bestemmes spesielt for de nye eksperimentene eller for forskjellige systemer.
Hornhinnen og sclera har også blitt evaluert samtidig i studier med denne teknikken24,25,26,27. Å vite at SHG signalet overføres i både fremover og bakover retninger, har flere studier undersøkt hornhinnen tissue uavhengig i sin opprinnelige tilstand28,29,30,31, 32,33,34 og i keratokonus35,36 og etter CXL (som omtalt under). Resultatene av disse studiene viser at hornhinnen signalet er optimalisert de spredte fremover, som er fornuftig gitt hornhinnens åpenhet og det faktum at lyset går gjennom vev å slå en skjerm i fremover spredte systemer. Vanligvis SHG signalet er i det blå synlige området og vil bli sterkt redusert når du går gjennom en svært spredning vev som øyet sclera. Resultatet ville gjenkjenning av fremover spredte SHG kreve en tynn del av vev av 50 μm eller mindre i tykkelse, samt en spesiell optisk oppsett. Derimot tilbake-spredt signalet kan hentes gjennom vanlig lys banen til fluorescens mikroskop uten vev snitting og derfor denne modusen er foretrukket når imaging kollagen i intakt sclera vev til et dyp på 30-40 μm. I denne studien bemerket vi en konsentrasjon avhengige økning i signal tetthet. Det er fullt mulig, men at TXL kan ha hatt flere og lignende effekter på dypere lag av sclera, og at effekten kan være mer uttalt og utvide til dypere lag spesielt med høyere konsentrasjon. Men på grunn av den begrensede SHG signal gjennomtrengning i sklera og i forbindelse med denne innledende studie valgte vi å arbeide med de beste kvalitet bildene, som ble Hentet fra mest overfladiske sclera (15 µm dybde). I fremtidige studier, vil vi vurdere dybde avhengige effekter følge TXL metoder som dette gir viktig tilleggsinformasjon om hvorfor selv større forskjellene var ikke observert mellom 40 og 400 mM behandlet prøvene.
Videre om bruk av SHG for evaluering riboflavin CXL indusert vev cross-linking, SHG mikroskopi tenkelig følgende riboflavin CXL av hornhinnen har blitt rapportert av flere grupper37,38,39 , 40 , 41. i en studie av Steven et al. 37, hornhinnen stabilisering ved hjelp av CXL teknikken resulterte i en '' homogenisering '' signal og tap av vev '' folder '' eller '' undulations'' sett i ikke-krysskoblet prøver. Disse endringstypene, men ble også nevnt i en studie evaluere effekten av endringer i IOP på hornhinnen SHG signaler, øke muligheten for teknisk gjenstander. Organisasjonsmessig fra fibril samt høyere orden fiber bunt/lamellær organisasjon standpunkt, sclera og hornhinnen er helt annerledes og mye er kjent om slike forskjeller fra elektronmikroskop studier. To vev forskjellige fibril pakking, som inkluderer fibril diameter distribusjon (liten uniform fibrils for hornhinnen og variabel diameter fibrils for sclera) og mellom fibril avstand (uniform for hornhinnen og variabel for sclera). Også, er høyere rekkefølgen organisasjonen i lamellær ark (hornhinne) versus fiber bunter (sclera) ganske annerledes. Slike strukturelle forskjeller gjenspeiles i SHG signalene produsert av disse to vev. Dermed kan forandringer indusert av cross-linking endre SHG signalet i forskjellige men parallelle måter. Med andre ord, var den "rette '' av fibrene i sklera observert i denne studien, og '' homogenisering '' signal i hornhinnen rapportert i litteraturen, begge resultatet av kollagen cross-linking modifisering. Dermed kunne '' homogenisering '' effekten i hornhinnen på noen måte analogt til '' rette '' effekten av sclera som er rapportert her.
Mekanismene som resulterer i denne rette effekten produsert av TXL er uklart basert på denne studien. En mulighet kan være at vevet ble liksom '' fast '' i mekanisk '' lastet '' posisjon. Dette ville støtte ideen om at indusert '' fibril og fiber stabilisering '' hadde skjedd. Endringer i intraokulært trykk sannsynlig bidra ikke til denne effekten siden IOP var overvåket før og etter sT injeksjon og stabilt. Samlet betydningen av disse observasjonene er uklare og videre studier vil være nødvendig. Merke, separate imaging teknikker som Brillouin mikroskopi42, som har vist seg å gi kvantitative tiltak av cross-linking (som bestemmes av skjær modulus) etter CXL fotokjemi kan være nyttig i å bekrefte funnene med SHG bildebehandling i denne studien. Det bør imidlertid bemerkes at bruken med høyt spredning vev som sclera43, krever tekniske endringer og har ikke blitt validert med krysskoblet Innbukking vev.
Laser polarisering og SHG mikroskopi er en viktig sak. Laserlys er lineært polarisert og orientert vinkelrett retning av SHG signal forplantning og på noen vinkel i xy-flyet til hver kollagen fiber. Dermed fibre i xy-flyet som er godt justert og nøyaktig vinkelrett polarisert laserlys vil produsere et høyere SHG signal enn de i andre vinkler, inkludert de parallell til det innfallende lyset (dvs., z-fly), som vil produsere den laveste SHG tapsfrie (destruktiv interferens). Med hensyn til sclera vev basert kollagen fibrene er orientert i forskjellige vinkler på et mikroskopisk nivå, selv om kjente foretrukne anatomiske fiber orientering på kloden plassering. Dermed siden SHG signalet produsert vil variere avhengig av xy-plane vinkelen av hver fiber, vil totale signalet være mindre enn det som ville bli produsert om alle kollagen fibrene var nøyaktig justert i samme vinkel (i en vev som en sene for eksempel). Derfor i denne studien, på grunn av prøven blir fotografert, retning av polarisering vilje ikke ble fastsatt men ble holdt konsekvent gjennom hele studiet. Videre vi sørget for å få vev fra behandlet og kontrollere globes fra identiske Innbukking regioner, minimere eventuelle forskjeller i fiber retning mellom eksempler. Til slutt, vi analysert over 100 bilder per prøve for å få intensitetsverdiene. Denne omfattende evalueringen skal ha normalisert noen avvikende SHG signaler som kan ha blitt registrert. Som blir sagt, er det mulig at som følge av "fiber rette" som vi observerte i krysskoblede utvalgene (beskrevet ovenfor), en større andel av «i fokalplanet"fiber kunne bidratt til økningen i SHG signal, samt økt SHG signaler fra større xy-plane justering. Begge disse mulighetene ville være manifestasjoner av indusert cross-linking effekter.
En regional analyse av cross-linking endringer (av Tm) av en sT injeksjon av SMG ble utført. Som forventet, var hvilket cross-linking effekten konsentrert i området av injeksjon. Lite eller ingen cross-linking effekt ble notert i regionen midt imot (lengst unna) fra injeksjon, samsvarer med det som er kjent om lokalisering av effekt etter sT injeksjon som vist ved ultralyd lokalisering44, 45 og beregnet tomografi46.
Til slutt, om cross-linking terapi og myopi, kollagen cross-linking av hornhinnen er å finne utbredt bruk i behandling av hornhinnen destabilisering inkludert keratokonus, innlegget LASIK keratectasias, pellucid marginale degenerasjon (PMD), og som en supplement til refraktiv kirurgiske prosedyrer47. Suksessen til behandling av hornhinnen sykdom med cross-linking har ført til utforskning av å bruke denne behandlingstilnærming til baksiden av øyet og, spesielt, sclera, begrenser aksial forlengelse i høy myopi2, et konsept som går tilbake til den aller tidligste stadiene av den terapeutiske cross-linking konseptet48,49.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Tongalp Tezel, MD, for konsultasjon om sT injeksjon; Theresa Swayne, PhD, for konsultasjon om SHG mikroskopi; og Jimmy Duong fra Design og biostatistikk ressurs og funksjonen Biostatistical kjernen av Irving Institute ved Columbia University Medical Center.
Støttes delvis ved forskning for å hindre blindhet og nasjonale institutter for helse tilskudd NCRR UL1RR024156, NEI P30 EY019007, NCI P30 CA013696 og NEI R01EY020495 (DCP). Columbia University eier relaterte immaterielle: amerikanske utstedte patenter no: 8,466,203 og ingen: 9,125,856. International patentanmeldt: PCT/US2015/020276.
Bildene ble samlet i Confocal og spesialisert mikroskopi delt ressurs av Herbert Irving Comprehensive Cancer Center ved Columbia University, støttet av NIH gi #P30 CA013696 (National Cancer Institute). AC confocal mikroskop ble kjøpt med NIH gi #S10 RR025686.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V | EMD Millipore, Massachusetts, USA | Double distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1 | |
| Sodium hydroxymethylglycinate | Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA | Crosslinking reagent - protocol step 1.1.2 | |
| Injection needle with luer-lock syringe | BD Eclipse, NJ, USA | Syringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1 | |
| Rabbit head | La Granja poultry | Outbred | Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2 |
| Tono-pen | Reichter Technologies Depew, NY | IOP measurements - protocol step 2.4 | |
| DSC 6000 Autosampler | Perkin-Elmer Waltham, MA, USA | Thermal denaturation analyzer - protocol step 7.4 | |
| Pyris software | Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA | Ver 11.0 | protocol step 7.5 |
| CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1. | |
| GenTeal | Alcon, Fort Worth, TX | B000URVDQ8 | Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1 |
| Chameleon Vision II | Coherent, Santa Clara,CA, USA | Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11 | |
| AttoFluor cell chamber | Thermo Fisher Scientific Inc | A7816 | Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3 |
| 25-mm round coverslips, #1.5 | Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA | GG-25-1.5 | protocol step 8.1.3 |
| Eclipse Ti-E | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | protocol step 8.1.4. | |
| Non-descanned (NDD) GaAsP detector | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Equipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7 | |
| A1R-MP laser scanning system | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8 | |
| NIS Elements software | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Ver 4.3 | refered to as "software" in the text - protocol step 8.1.9 |
| Fiji/ImageJ | National Institute of Health | protocol step 9.1.2 | |
| NeuronJ | Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands | https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | Ver 14 | protocol step 9.2.8 |
References
- McBrien, N. A., Norton, T. T. Prevention of collagen crosslinking increases form-deprivation myopia in tree shrew. Exp Eye Res. 59 (4), 475-486 (1994).
- Elsheikh, A., Phillips, J. R. Is scleral cross-linking a feasible treatment for myopia control? Ophthalmic Physiol Opt. 33 (3), 385-389 (2013).
- Dotan, A., et al. Scleral cross-linking using riboflavin and ultraviolet-a radiation for prevention of progressive myopia in a rabbit model. Exp Eye Res. 127, 190-195 (2014).
- Canavan, K. S., Dark, A., Garrioch, M. A. Sub-Tenon's administration of local anaesthetic: a review of the technique. Br J Anaesth. 90 (6), 787-793 (2003).
- Guise, P. Sub-Tenon's anesthesia: an update. Local Reg Anesth. 5, 35-46 (2012).
- Ahn, J. S., et al. A sub-Tenon's capsule injection of lidocaine induces extraocular muscle akinesia and mydriasis in dogs. Vet J. 196 (1), 103-108 (2013).
- Wollensak, G., Redl, B. Gel electrophoretic analysis of corneal collagen after photodynamic cross-linking treatment. Cornea. 27 (3), 353-356 (2008).
- Liu, T. X., Wang, Z. Collagen crosslinking of porcine sclera using genipin. Acta Ophthalmol. 91 (4), e253-e257 (2013).
- Wang, M., Corpuz, C. C. Effects of scleral cross-linking using genipin on the process of form-deprivation myopia in the guinea pig: a randomized controlled experimental study. BMC Ophthalmol. 15, 89 (2015).
- Babar, N., et al. Cosmetic preservatives as therapeutic corneal and scleral tissue cross-linking agents. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1274-1282 (2015).
- Kim, S. Y., et al. Evaluating the Toxicity/Fixation Balance for Corneal Cross-Linking With Sodium Hydroxymethylglycinate (SMG) and Riboflavin-UVA (CXL) in an Ex Vivo Rabbit Model Using Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Cornea. 35 (4), 550-556 (2016).
- da Cruz, L. G., Moraes, G. D. A., Nogueira, R. F., Morandim-Giannetti, A. D. A., Bersanetti, P. A. DSC characterization of rabbit corneas treated with Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville extracts. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. , (2017).
- Bersanetti, P. A., et al. Characterization of Rabbit Corneas Subjected to Stromal Stiffening by the Acai Extract (Euterpe oleracea). Curr Eye Res. 42 (4), 528-533 (2017).
- Freund, I., Deutsch, M. Second-harmonic microscopy of biological tissue. Opt Lett. 11 (2), 94 (1986).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21 (11), 1356-1360 (2003).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88 (2), 1377-1386 (2005).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J Anat. 215 (6), 682-691 (2009).
- Tsamis, A., Krawiec, J. T., Vorp, D. A. Elastin and collagen fibre microstructure of the human aorta in ageing and disease: a review. J R Soc Interface. 10 (83), 20121004 (2013).
- Raub, C. B., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Zyablitskaya, M., et al. Evaluation of Therapeutic Tissue Crosslinking (TXL) for Myopia Using Second Harmonic Generation Signal Microscopy in Rabbit Sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (1), 21-29 (2017).
- Steven, P., Muller, M., Koop, N., Rose, C., Huttmann, G. Comparison of Cornea Module and DermaInspect for noninvasive imaging of ocular surface pathologies. J Biomed Opt. 14 (6), 064040 (2009).
- Han, M., Giese, G., Bille, J. F. Second harmonic generation imaging of collagen fibrils in cornea and sclera. Optics Express. 13 (15), 5791-5797 (2005).
- Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
- Teng, S. W., et al. Multiphoton autofluorescence and second-harmonic generation imaging of the ex vivo porcine eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1216-1224 (2006).
- Rao, R. A., Mehta, M. R., Leithem, S., Toussaint, K. C. Jr Quantitative analysis of forward and backward second-harmonic images of collagen fibers using Fourier transform second-harmonic-generation microscopy. Opt Lett. 34 (24), 3779-3781 (2009).
- Morishige, N., Petroll, W. M., Nishida, T., Kenney, M. C., Jester, J. V. Noninvasive corneal stromal collagen imaging using two-photon-generated second-harmonic signals. J Cataract Refract Surg. 32 (11), 1784-1791 (2006).
- Aptel, F., et al. Multimodal nonlinear imaging of the human cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2459-2465 (2010).
- Winkler, M., et al. Nonlinear optical macroscopic assessment of 3-D corneal collagen organization and axial biomechanics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 8818-8827 (2011).
- Morishige, N., Takagi, Y., Chikama, T., Takahara, A., Nishida, T. Three-dimensional analysis of collagen lamellae in the anterior stroma of the human cornea visualized by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (2), 911-915 (2011).
- Gore, D. M., et al. Two-photon fluorescence microscopy of corneal riboflavin absorption. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (4), 2476-2481 (2014).
- Park, C. Y., Lee, J. K., Chuck, R. S. Second Harmonic Generation Imaging Analysis of Collagen Arrangement in Human Cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5622-5629 (2015).
- Quantock, A. J., et al. From nano to macro: studying the hierarchical structure of the corneal extracellular matrix. Exp Eye Res. 133, 81-99 (2015).
- Morishige, N., et al. Quantitative analysis of collagen lamellae in the normal and keratoconic human cornea by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (12), 8377-8385 (2014).
- Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (3), 1087-1094 (2007).
- Steven, P., Hovakimyan, M., Guthoff, R. F., Huttmann, G., Stachs, O. Imaging corneal crosslinking by autofluorescence 2-photon microscopy, second harmonic generation, and fluorescence lifetime measurements. J Cataract Refract Surg. 36 (12), 2150-2159 (2010).
- Bueno, J. M., et al. Multiphoton microscopy of ex vivo corneas after collagen cross-linking. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (8), 5325-5331 (2011).
- McQuaid, R., Li, J. J., Cummings, A., Mrochen, M., Vohnsen, B. Second-Harmonic Reflection Imaging of Normal and Accelerated Corneal Crosslinking Using Porcine Corneas and the Role of Intraocular Pressure. Cornea. 33 (2), 125-130 (2014).
- Laggner, M., et al. Correlation Between Multimodal Microscopy, Tissue Morphology, and Enzymatic Resistance in Riboflavin-UVA Cross-Linked Human Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (6), 3584-3592 (2015).
- Chai, D., et al. Quantitative assessment of UVA-riboflavin corneal cross-linking using nonlinear optical microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4231-4238 (2011).
- Scarcelli, G., et al. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (2), 1418-1425 (2013).
- Shao, P., Besner, S., Zhang, J., Scarcelli, G., Yun, S. H. Etalon filters for Brillouin microscopy of highly scattering tissues. Opt Express. 24 (19), 22232-22238 (2016).
- Kumar, C. M., McNeela, B. J. Ultrasonic localization of anaesthetic fluid using sub-Tenon's cannulae of three different lengths. Eye (Lond). 17 (9), 1003-1007 (2003).
- Winder, S., Walker, S. B., Atta, H. R. Ultrasonic localization of anesthetic fluid in sub-Tenon's, peribulbar, and retrobulbar techniques. J Cataract Refract Surg. 25 (1), 56-59 (1999).
- Ripart, J., Eledjam, J. J. [Locoregional anesthesia for ophthalmic surgery: unique episcleral injection (sub-tenon) in the internal canthus]. Ann Fr Anesth Reanim. 17 (4), Fi72-Fi74 (1998).
- Meek, K. M., Hayes, S. Corneal cross-linking--a review. Ophthalmic Physiol Opt. 33 (2), 78-93 (2013).
- Wollensak, G., Spoerl, E. Collagen crosslinking of human and porcine sclera. J Cataract Refract Surg. 30 (3), 689-695 (2004).
- Paik, D. C., Wen, Q., Airiani, S., Braunstein, R. E., Trokel, S. L. Aliphatic beta-nitro alcohols for non-enzymatic collagen cross-linking of scleral tissue. Exp Eye Res. 87 (3), 279-285 (2008).
