खल्क अवरोधक PD0325901 और विटामिन सी का उपयोग कर माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के जीनोमिक Hypomethylation बनाए रखने के लिए एक वैकल्पिक संस्कृति विधि
Summary
हम विस्तार में वर्णित दो रासायनिक आधारित प्रोटोकॉल संवर्धन माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के लिए । इस नई विधि Tet मध्यस्थता ऑक्सीकरण को बढ़ावा देने के synergistic तंत्र का उपयोग करता है (विटामिन सी द्वारा) और 5 का दमन डी नोवो संश्लेषण-methylcytosine (PD0325901 द्वारा) डीएनए hypomethylation और माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के pluripotency बनाए रखने के लिए.
Abstract
भ्रूण स्टेम (ES) कोशिकाओं को तीन रोगाणु परतों (अन्तः, मध्य त्वक स्तर, या बाह्य त्वक स्तर) में से किसी में अंतर करने की क्षमता है, और अपक्षयी दवा के लिए कई वंश उत्पंन कर सकते हैं । ES सेल संस्कृति इन विट्रो में लंबे समय से व्यापक चिंताओं का विषय रहा है । क्लासिकल, माउस ES कोशिकाओं सीरम और ल्यूकेमिया निरोधात्मक फैक्टर (लिफ) में बनाए रखा-मध्यम युक्त हैं । हालांकि, सीरम/लिफ स्थितियों के अंतर्गत, कक्ष आकृति विज्ञान और pluripotency-संबंधित जीन की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में विविधता दिखाते हैं, और ज्यादातर एक metastable स्थिति में हैं । इसके अलावा, संस्कृत ES कोशिकाओं वैश्विक hypermethylation प्रदर्शन, लेकिन इनर सेल मास (आईसीएम) और मौलिक रोगाणु कोशिकाओं (PGCs) के भोले ES कोशिकाओं वैश्विक hypomethylation के एक राज्य में हैं । आईसीएम और PGCs के hypomethylated राज्य अपने pluripotency के साथ निकटता से जुड़े हुए हैं. माउस ES सेल कल्चर के तरीकों में सुधार करने के लिए, हमने हाल ही में डीएनए hypomethylated और pluripotent राज्य को बनाए रखने के लिए दो छोटे-अणु यौगिकों के चुनिंदा संयुक्त उपयोग के आधार पर एक नई विधि विकसित की है । यहां, हम मौजूद है कि विटामिन सी के सह उपचार (कुलपति) और PD0325901 5 के बारे में ९०% मिटा सकते है-methylcytosine (5mC) माउस ES कोशिकाओं में 5 दिनों में । उत्पंन 5mC सामग्री PGCs में है कि तुलना में है । यंत्रवत जांच से पता चलता है कि PD0325901 अप-Dnmt3b (डी नोवो डीएनए methyltransferase) और Dnmt3l (cofactor की Dnmt3b) को दबाने के लिए Prdm14 अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है, de नोवो 5mC संश्लेषण को कम करके । कुलपति 5mC के रूपांतरण की सुविधा 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) catalyzed मुख्य रूप से Tet1 और Tet2 द्वारा, दोनों निष्क्रिय और सक्रिय डीएनए की भागीदारी का संकेत है । इसके अलावा, Vc/PD0325901 शर्तों के तहत, माउस ES कोशिकाओं सजातीय आकृति विज्ञान और pluripotent राज्य दिखाते हैं । सामूहिक रूप से, हम डीएनए hypomethylation और माउस ES कोशिकाओं में pluripotency के रखरखाव को प्राप्त करने के लिए एक उपंयास और रासायनिक सिनर्जी संस्कृति विधि का प्रस्ताव । छोटे अणु रासायनिक निर्भर विधि सीरम संस्कृति की प्रमुख कमियों पर काबू पा, और आगे नैदानिक अनुप्रयोगों और शोध के लिए सजातीय ES कोशिकाओं उत्पंन वादा रखती है ।
Introduction
ES कक्ष एक ब्लास्टोसिस्ट1के आईसीएम से उत्पंन होते हैं । कोशिकाओं को एक pluripotency राज्य में है और सभी दैहिक वंश और germline कोशिकाओं को2फार्म कर सकते हैं । ES कोशिकाओं की स्थापना इन विट्रो में विकास प्रक्रियाओं की जांच करने का अवसर प्रदान करता है और उनके pluripotency3के आधार पर अपक्षयी दवा के लिए चिकित्सा प्रासंगिकता की कोशिकाओं को उत्पन्न कर सकते हैं ।
दो समूहों को लाभदायक १९८१ में माउस ES सेल लाइनों की स्थापना की और जब प्रारंभिक माउस भ्रूण से व्युत्पंन कोशिकाओं भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)-फीडर परत के रूप में माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) के साथ मध्यम से युक्त में संस्कृति थे1,4 . MEFs mitotically निष्क्रिय थे और पहले व्यंजन में पले थे संवर्धन ES कोशिकाओं से पहले । MEFs माउस ES सेल लगाव के लिए समर्थन प्रदान करते है और विकास कारकों का उत्पादन करने के लिए प्रचार को बढ़ावा देने और भेदभाव5दमन, जबकि FBS आवश्यक पौष्टिकता कारकों और सेल प्रसार के लिए हार्मोन प्रदान करता है । बाद के अध्ययनों से संकेत दिया कि लिफ फीडर कोशिकाओं द्वारा उत्पादित आत्म-नवीकरण और माउस ES कोशिकाओं में pluripotency के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण cytokine था, और मध्यम में लिफ के अलावा फीडर कोशिकाओं के लिए विकल्प सकता है6। वर्तमान में, भक्षण पर FBS/लिफ माध्यम में माउस ES कोशिकाओं के बनाए रखने के मानक कई शोधकर्ताओं द्वारा अपनाया विधि अभी भी है । हालांकि, कुछ समस्याएं इस शास्त्रीय संस्कृति के दृष्टिकोण से उत्पंन होती हैं । सबसे पहले, फीडर कोशिकाओं अतिरिक्त और अनियंत्रित कारकों स्रावित और रोगजनक संदूषण7कारण हो सकता है । इस हस्तक्षेप से बचने के लिए, जिलेटिन के साथ व्यंजन की सतह कोटिंग और सीरम युक्त माध्यम में लिफ के अलावा फीडर परत कोशिकाओं के बिना माउस ES कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए वैकल्पिक तरीके हैं । साथ ही, माउस ES कोशिकाओं सीरम/लिफ शर्तों के तहत उगाया रूपात्मक विविधता कक्ष की आबादी में और यहां तक कि pluripotency से संबंधित कारकों की अभिव्यक्ति स्तर में8। हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि सीरम/लिफ शर्तों के तहत, pluripotency-संबंधित कोर प्रतिलेखन कारक (SOX2, Nanog, और OCT4 सहित) pluripotency और लिफ सिग्नलिंग के माध्यम से WNT को बनाए रख सकते हैं; हालांकि, विशेष रूप से, वे भी एक fibroblast वृद्धि कारक (FGF) को सक्रिय करने के लिए भिंनता8ट्रिगर संकेत । कारण कोर प्रतिलेखन कारकों के ambivalent दोहरी कार्रवाई के लिए, माउस ES सीरम वर्तमान विविधता में कल्चरित कोशिकाओं, दो विनिमेय आबादी से मिलकर, एक आईसीएम के समान है और एक और प्रधान epiblast राज्य8जैसी । इसके अलावा, सीरम में माउस ES कोशिकाओं अक्सर ग्लोबल hypermethylation9प्रदर्शन, जबकि आईसीएम और PGCs एक वैश्विक hypomethylated राज्य है, जो निकट उनके pluripotency9,10के साथ जुड़ा हुआ है में हैं ।
संवर्धन माउस ES कोशिकाओं के लिए नए तरीकों को विकसित करने के लिए काफी मांग है । कई सुधार प्रोटोकॉल २००३ के बाद से स्थापित किया गया है11 लेकिन वहां कुछ सीमाएं और कमियों7होना जारी है । २००८ के बाद से, दो छोटे अणु कळेनासे अवरोधकों के संयुक्त उपयोग, PD0325901 (mitogen के अवरोधक-सक्रिय प्रोटीन कळेनासे (MAPK)/extracellular-signal-regulated कळेनासे (ERK) (खल्क)) और CHIR99021 (ग्लाइकोजन सिंथेस के अवरोधक कळेनासे 3 (GSK3)), एन2बी27 माध्यम में लिफ के साथ और सीरम के बिना संवर्धन माउस ES कोशिकाओं12के लिए नए दृष्टिकोण खोला गया है । इस नए परिभाषित मध्यम दो अवरोधकों (2i) के उपयोग की विशेषता है । 2i/लिफ माध्यम में प्रसंस्कृत माउस ES कोशिकाओं सेल आबादी में अधिक सजातीय और pluripotency कारकों की अभिव्यक्ति कर रहे हैं । इसके अलावा, 2i/लिफ-cultureed माउस ES कोशिकाओं डीएनए hypomethylation विश्व स्तर पर है, जो आईसीएम की तरह कोशिकाओं को9,13के करीब है प्रदर्शन । फिर भी, 2i संस्कृति अपने नुकसान है । PD0325901 और CHIR99021 पानी में अघुलनशील है और आम तौर पर dimethyl sulfoxide (DMSO) में भंग कर रहे हैं-शेयर समाधान आधारित उन्हें संस्कृति माध्यम में जोड़ने के लिए. अध्ययनों से पता चला है कि लंबी अवधि के और DMSO के लिए कोशिकाओं की कम खुराक जोखिम cytotoxicity के लिए नेतृत्व कर सकते हैं14.
यहां, हम दो छोटे अणु यौगिकों का उपयोग किया और माउस ES कोशिकाओं की एक नई संस्कृति विधि विकसित की है । उपंयास संस्कृति विधि कुलपति और खल्क अवरोध करनेवाला PD0325901 को जोड़ती है डीएनए hypomethylation को बढ़ावा देने के लिए तेजी से और प्रभावी ढंग से PGC के एक तुलनीय स्तर पर, कुलपति के रूप में नामित/PD0325901 संवर्धन प्रोटोकॉल । Vc/PD0325901 में माउस ES कक्षों-जोड़ा गया सीरम युक्त मध्यम प्रदर्शन एकरूपता में आकृति विज्ञान और एक जमीन राज्य में निरंतर रहे हैं । 2i संस्कृति की तुलना में, माउस ईएस Vc/PD0325901 शर्तों के तहत संस्कृति डीएनए के तेजी से कैनेटीक्स प्रदर्शन और hypomethylation PGC के लिए तुलनीय स्तर तक पहुंच सकते हैं । इसके अलावा, एक एकल अवरोध करनेवाला का उपयोग (PD0325901) DMSO की तुलना में मध्यम में इनपुट राशि कम हो जाती है कि 2i में इस्तेमाल किया (PD0325901/CHIR99021) और कोशिकाओं को नुकसान कम कर देता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
काम में, हम कुलपति और PD0325901 के संयोजन के एक उपंयास विधि का प्रदर्शन एक विभेदित और hypomethylated राज्य में माउस ES कोशिकाओं को बनाए रखने, जो कुलपति द्वारा डीएनए और दमन को बढ़ावा देने के एक synergistic कार्रवाई द्वारा हासिल क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था चीन (२१४३५००८ और २१३२७००६ करने के लिए बुश hw), और सामरिक प्राथमिकता के अनुसंधान कार्यक्रम के चीनी अकादमी ऑफ साइंसेज (XDB14030200 करने के लिए बुश hw).
Materials
| fetal bovine serum Australia source | Corning | 35-076-CV | Component of mouse ES cell medium |
| DMEM/high glucose | Hyclone | SH30022 | Component of mouse ES cell medium |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Component of mouse ES cell medium |
| non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140050 | Component of mouse ES cell medium |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Component of mouse ES cell medium |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | Component of mouse ES cell medium |
| penicillin streptomycin solution | Gibco | 15140122 | Component of mouse ES cell medium |
| PBS | Sigma | P5493 | Cells rinse |
| trypsin | Hyclone | SH30042 | Cell dissociation |
| gelatin | Sigma | 48722 | Dishes coating |
| PD0325901 | Stemolecule | 04-0006-10 | small-molecule chemical for cell culture |
| CHIR99021 | Stemolecule | 04-0004 | small-molecule chemical for cell culture |
| vitamin C | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | XW00508171 | small-molecule chemical for cell culture |
| Ultra Bioscience water purification systemr | Purelab | Ultra | Ultra water |
| DMSO | Sigma | D8418 | Cell freezing medium |
| centrifuger | Eppendorf | 5427R | DNA and protein extraction |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | Component of RIPA buffer |
| PMSF Protease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 36978 | Component of RIPA buffer |
| DTT | Sigma | 43815 | Component of RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E3889 | Component of RIPA buffer |
| Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 | Genomic DNA extraction |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | NanoDrop 2000 | Determination of DNA concentration |
| calf intestinal phosphatase | New England Biolabs | M0290 | DNA digestion |
| DNase I | New England Biolabs | M0303 | DNA digestion |
| snake venom phosphodiesterase I | Sigma | P4506 | DNA digestion |
| Nanosep 3K Omega | Pall | OD003C35 | filtration of digested DNA |
| 1290 UHPLC system | Agilent | 1290 | UHPLC separation |
| G6410B triple quadrupole mass spectrometer | Agilent | G6410B | MS/MS analysis |
| Zorbax Eclipse Plus C18 column | Agilent | Zorbax Eclipse Plus | colume for UHPLC separation |
| 5-methylcytosine | Solarbio Life Sciences | SM8900 | standard 5mC |
| 5-hydroxymethylcytosine (standard) | Toronto Research Chemicals | M295900 | standard 5hmC |
| Prdm14 antibody | bioworld | BS7634 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3a antibody | bioworld | BS6587 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3b antibody | abcam | ab13604 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3l antibody | abcam | ab3493 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt1 antibody | abcam | ab13537 | Western blot analysis-primary antibody |
| β-tubulin antibody | bioworld | BS1482MH | Western blot analysis-primary antibody |
| goat anti-rabbit IgG | abcam | ab6721 | Western blot analysis-secondary antibody |
| goat anti-mouse IgG | abcam | ab6789 | Western blot analysis-secondary antibody |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA extraction |
| reverse transcription system | Promega | A3500 | RNA reverse transcription |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | RT-PCR |
| StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit | Cells Biolabs, Inc. | CBA-302 | alkaline phosphatase staining analysis |
| mouse ES cells: WT, 129 SvEv | Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) | cell strain of mouse ES cells | |
| microscope | Zeiss | LSM510 | cells observation |
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad Prism Software Inc. | 5.0 | statistical analysis |
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