Summary

खल्क अवरोधक PD0325901 और विटामिन सी का उपयोग कर माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के जीनोमिक Hypomethylation बनाए रखने के लिए एक वैकल्पिक संस्कृति विधि

Published: June 01, 2018
doi:

Summary

हम विस्तार में वर्णित दो रासायनिक आधारित प्रोटोकॉल संवर्धन माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के लिए । इस नई विधि Tet मध्यस्थता ऑक्सीकरण को बढ़ावा देने के synergistic तंत्र का उपयोग करता है (विटामिन सी द्वारा) और 5 का दमन डी नोवो संश्लेषण-methylcytosine (PD0325901 द्वारा) डीएनए hypomethylation और माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के pluripotency बनाए रखने के लिए.

Abstract

भ्रूण स्टेम (ES) कोशिकाओं को तीन रोगाणु परतों (अन्तः, मध्य त्वक स्तर, या बाह्य त्वक स्तर) में से किसी में अंतर करने की क्षमता है, और अपक्षयी दवा के लिए कई वंश उत्पंन कर सकते हैं । ES सेल संस्कृति इन विट्रो में लंबे समय से व्यापक चिंताओं का विषय रहा है । क्लासिकल, माउस ES कोशिकाओं सीरम और ल्यूकेमिया निरोधात्मक फैक्टर (लिफ) में बनाए रखा-मध्यम युक्त हैं । हालांकि, सीरम/लिफ स्थितियों के अंतर्गत, कक्ष आकृति विज्ञान और pluripotency-संबंधित जीन की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में विविधता दिखाते हैं, और ज्यादातर एक metastable स्थिति में हैं । इसके अलावा, संस्कृत ES कोशिकाओं वैश्विक hypermethylation प्रदर्शन, लेकिन इनर सेल मास (आईसीएम) और मौलिक रोगाणु कोशिकाओं (PGCs) के भोले ES कोशिकाओं वैश्विक hypomethylation के एक राज्य में हैं । आईसीएम और PGCs के hypomethylated राज्य अपने pluripotency के साथ निकटता से जुड़े हुए हैं. माउस ES सेल कल्चर के तरीकों में सुधार करने के लिए, हमने हाल ही में डीएनए hypomethylated और pluripotent राज्य को बनाए रखने के लिए दो छोटे-अणु यौगिकों के चुनिंदा संयुक्त उपयोग के आधार पर एक नई विधि विकसित की है । यहां, हम मौजूद है कि विटामिन सी के सह उपचार (कुलपति) और PD0325901 5 के बारे में ९०% मिटा सकते है-methylcytosine (5mC) माउस ES कोशिकाओं में 5 दिनों में । उत्पंन 5mC सामग्री PGCs में है कि तुलना में है । यंत्रवत जांच से पता चलता है कि PD0325901 अप-Dnmt3b (डी नोवो डीएनए methyltransferase) और Dnmt3l (cofactor की Dnmt3b) को दबाने के लिए Prdm14 अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है, de नोवो 5mC संश्लेषण को कम करके । कुलपति 5mC के रूपांतरण की सुविधा 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) catalyzed मुख्य रूप से Tet1 और Tet2 द्वारा, दोनों निष्क्रिय और सक्रिय डीएनए की भागीदारी का संकेत है । इसके अलावा, Vc/PD0325901 शर्तों के तहत, माउस ES कोशिकाओं सजातीय आकृति विज्ञान और pluripotent राज्य दिखाते हैं । सामूहिक रूप से, हम डीएनए hypomethylation और माउस ES कोशिकाओं में pluripotency के रखरखाव को प्राप्त करने के लिए एक उपंयास और रासायनिक सिनर्जी संस्कृति विधि का प्रस्ताव । छोटे अणु रासायनिक निर्भर विधि सीरम संस्कृति की प्रमुख कमियों पर काबू पा, और आगे नैदानिक अनुप्रयोगों और शोध के लिए सजातीय ES कोशिकाओं उत्पंन वादा रखती है ।

Introduction

ES कक्ष एक ब्लास्टोसिस्ट1के आईसीएम से उत्पंन होते हैं । कोशिकाओं को एक pluripotency राज्य में है और सभी दैहिक वंश और germline कोशिकाओं को2फार्म कर सकते हैं । ES कोशिकाओं की स्थापना इन विट्रो में विकास प्रक्रियाओं की जांच करने का अवसर प्रदान करता है और उनके pluripotency3के आधार पर अपक्षयी दवा के लिए चिकित्सा प्रासंगिकता की कोशिकाओं को उत्पन्न कर सकते हैं ।

दो समूहों को लाभदायक १९८१ में माउस ES सेल लाइनों की स्थापना की और जब प्रारंभिक माउस भ्रूण से व्युत्पंन कोशिकाओं भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)-फीडर परत के रूप में माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) के साथ मध्यम से युक्त में संस्कृति थे1,4 . MEFs mitotically निष्क्रिय थे और पहले व्यंजन में पले थे संवर्धन ES कोशिकाओं से पहले । MEFs माउस ES सेल लगाव के लिए समर्थन प्रदान करते है और विकास कारकों का उत्पादन करने के लिए प्रचार को बढ़ावा देने और भेदभाव5दमन, जबकि FBS आवश्यक पौष्टिकता कारकों और सेल प्रसार के लिए हार्मोन प्रदान करता है । बाद के अध्ययनों से संकेत दिया कि लिफ फीडर कोशिकाओं द्वारा उत्पादित आत्म-नवीकरण और माउस ES कोशिकाओं में pluripotency के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण cytokine था, और मध्यम में लिफ के अलावा फीडर कोशिकाओं के लिए विकल्प सकता है6। वर्तमान में, भक्षण पर FBS/लिफ माध्यम में माउस ES कोशिकाओं के बनाए रखने के मानक कई शोधकर्ताओं द्वारा अपनाया विधि अभी भी है । हालांकि, कुछ समस्याएं इस शास्त्रीय संस्कृति के दृष्टिकोण से उत्पंन होती हैं । सबसे पहले, फीडर कोशिकाओं अतिरिक्त और अनियंत्रित कारकों स्रावित और रोगजनक संदूषण7कारण हो सकता है । इस हस्तक्षेप से बचने के लिए, जिलेटिन के साथ व्यंजन की सतह कोटिंग और सीरम युक्त माध्यम में लिफ के अलावा फीडर परत कोशिकाओं के बिना माउस ES कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए वैकल्पिक तरीके हैं । साथ ही, माउस ES कोशिकाओं सीरम/लिफ शर्तों के तहत उगाया रूपात्मक विविधता कक्ष की आबादी में और यहां तक कि pluripotency से संबंधित कारकों की अभिव्यक्ति स्तर में8। हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि सीरम/लिफ शर्तों के तहत, pluripotency-संबंधित कोर प्रतिलेखन कारक (SOX2, Nanog, और OCT4 सहित) pluripotency और लिफ सिग्नलिंग के माध्यम से WNT को बनाए रख सकते हैं; हालांकि, विशेष रूप से, वे भी एक fibroblast वृद्धि कारक (FGF) को सक्रिय करने के लिए भिंनता8ट्रिगर संकेत । कारण कोर प्रतिलेखन कारकों के ambivalent दोहरी कार्रवाई के लिए, माउस ES सीरम वर्तमान विविधता में कल्चरित कोशिकाओं, दो विनिमेय आबादी से मिलकर, एक आईसीएम के समान है और एक और प्रधान epiblast राज्य8जैसी । इसके अलावा, सीरम में माउस ES कोशिकाओं अक्सर ग्लोबल hypermethylation9प्रदर्शन, जबकि आईसीएम और PGCs एक वैश्विक hypomethylated राज्य है, जो निकट उनके pluripotency9,10के साथ जुड़ा हुआ है में हैं ।

संवर्धन माउस ES कोशिकाओं के लिए नए तरीकों को विकसित करने के लिए काफी मांग है । कई सुधार प्रोटोकॉल २००३ के बाद से स्थापित किया गया है11 लेकिन वहां कुछ सीमाएं और कमियों7होना जारी है । २००८ के बाद से, दो छोटे अणु कळेनासे अवरोधकों के संयुक्त उपयोग, PD0325901 (mitogen के अवरोधक-सक्रिय प्रोटीन कळेनासे (MAPK)/extracellular-signal-regulated कळेनासे (ERK) (खल्क)) और CHIR99021 (ग्लाइकोजन सिंथेस के अवरोधक कळेनासे 3 (GSK3)), एन2बी27 माध्यम में लिफ के साथ और सीरम के बिना संवर्धन माउस ES कोशिकाओं12के लिए नए दृष्टिकोण खोला गया है । इस नए परिभाषित मध्यम दो अवरोधकों (2i) के उपयोग की विशेषता है । 2i/लिफ माध्यम में प्रसंस्कृत माउस ES कोशिकाओं सेल आबादी में अधिक सजातीय और pluripotency कारकों की अभिव्यक्ति कर रहे हैं । इसके अलावा, 2i/लिफ-cultureed माउस ES कोशिकाओं डीएनए hypomethylation विश्व स्तर पर है, जो आईसीएम की तरह कोशिकाओं को9,13के करीब है प्रदर्शन । फिर भी, 2i संस्कृति अपने नुकसान है । PD0325901 और CHIR99021 पानी में अघुलनशील है और आम तौर पर dimethyl sulfoxide (DMSO) में भंग कर रहे हैं-शेयर समाधान आधारित उन्हें संस्कृति माध्यम में जोड़ने के लिए. अध्ययनों से पता चला है कि लंबी अवधि के और DMSO के लिए कोशिकाओं की कम खुराक जोखिम cytotoxicity के लिए नेतृत्व कर सकते हैं14.

यहां, हम दो छोटे अणु यौगिकों का उपयोग किया और माउस ES कोशिकाओं की एक नई संस्कृति विधि विकसित की है । उपंयास संस्कृति विधि कुलपति और खल्क अवरोध करनेवाला PD0325901 को जोड़ती है डीएनए hypomethylation को बढ़ावा देने के लिए तेजी से और प्रभावी ढंग से PGC के एक तुलनीय स्तर पर, कुलपति के रूप में नामित/PD0325901 संवर्धन प्रोटोकॉल । Vc/PD0325901 में माउस ES कक्षों-जोड़ा गया सीरम युक्त मध्यम प्रदर्शन एकरूपता में आकृति विज्ञान और एक जमीन राज्य में निरंतर रहे हैं । 2i संस्कृति की तुलना में, माउस ईएस Vc/PD0325901 शर्तों के तहत संस्कृति डीएनए के तेजी से कैनेटीक्स प्रदर्शन और hypomethylation PGC के लिए तुलनीय स्तर तक पहुंच सकते हैं । इसके अलावा, एक एकल अवरोध करनेवाला का उपयोग (PD0325901) DMSO की तुलना में मध्यम में इनपुट राशि कम हो जाती है कि 2i में इस्तेमाल किया (PD0325901/CHIR99021) और कोशिकाओं को नुकसान कम कर देता है.

Protocol

1. तैयारी १.० mm PD0325901 (खल्क अवरोधक) और ३.० mm CHIR99021 (GSK3 अवरोध करनेवाला) का समाधान तैयार करें । PD0325901 के 2 मिलीग्राम वजन और एक एंबर कांच की शीशी में DMSO की ४.१५ मिलीलीटर जोड़ें । CHIR99021 के 2 मिलीग्राम वजन और ए…

Representative Results

Vc/PD0325901 synergistically माउस ES कोशिकाओं के वैश्विक विलोपन प्रेरित । सीरम प्रदर्शन डीएनए hypermethylation में माउस ES कोशिकाओं, जबकि pluripotent आईसीएम कोशिकाओं और PGCs डीएनए मिथाइल के वैश्विक विलोपन दिखाने के लिए और hypomethylated र?…

Discussion

काम में, हम कुलपति और PD0325901 के संयोजन के एक उपंयास विधि का प्रदर्शन एक विभेदित और hypomethylated राज्य में माउस ES कोशिकाओं को बनाए रखने, जो कुलपति द्वारा डीएनए और दमन को बढ़ावा देने के एक synergistic कार्रवाई द्वारा हासिल क…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस काम के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था चीन (२१४३५००८ और २१३२७००६ करने के लिए बुश hw), और सामरिक प्राथमिकता के अनुसंधान कार्यक्रम के चीनी अकादमी ऑफ साइंसेज (XDB14030200 करने के लिए बुश hw).

Materials

fetal bovine serum Australia source Corning 35-076-CV Component of mouse ES cell medium
DMEM/high glucose Hyclone SH30022 Component of mouse ES cell medium
LIF Millipore ESG1107 Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140050 Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvate Gibco 11360070 Component of mouse ES cell medium
L-glutamine Gibco 25030081 Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solution Gibco 15140122 Component of mouse ES cell medium
PBS Sigma P5493 Cells rinse
trypsin Hyclone SH30042 Cell dissociation
gelatin Sigma 48722 Dishes coating
PD0325901 Stemolecule 04-0006-10 small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021 Stemolecule 04-0004 small-molecule chemical for cell culture
vitamin C Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd  XW00508171 small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemr Purelab Ultra Ultra water
DMSO Sigma D8418 Cell freezing medium
centrifuger Eppendorf 5427R DNA and protein extraction
protease inhibitor cocktail Sigma P8340 Component of RIPA buffer
PMSF Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 36978 Component of RIPA buffer
DTT Sigma 43815 Component of RIPA buffer
EGTA Sigma E3889 Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit  Promega A1125 Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000 ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000 Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphatase New England Biolabs M0290 DNA digestion
DNase I New England Biolabs M0303 DNA digestion
snake venom phosphodiesterase I Sigma P4506 DNA digestion
Nanosep 3K Omega Pall OD003C35 filtration of digested DNA
1290 UHPLC system Agilent  1290 UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometer Agilent  G6410B MS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 column Agilent  Zorbax Eclipse Plus colume for UHPLC separation
5-methylcytosine Solarbio Life Sciences SM8900  standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard) Toronto Research Chemicals M295900 standard 5hmC
Prdm14 antibody bioworld BS7634 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibody bioworld BS6587 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibody abcam ab13604 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibody abcam ab3493 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibody abcam ab13537 Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibody bioworld BS1482MH Western blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgG abcam ab6721 Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgG abcam ab6789 Western blot analysis-secondary antibody
Trizol Invitrogen 15596-026 RNA extraction
reverse transcription system Promega A3500 RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001 RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit Cells Biolabs, Inc. CBA-302  alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEv Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) cell strain of mouse ES cells
microscope Zeiss LSM510 cells observation
GraphPad Prism 5.0 GraphPad Prism Software Inc. 5.0 statistical analysis

References

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Cite This Article
Li, C., Lai, W., Wang, H. An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C. J. Vis. Exp. (136), e56391, doi:10.3791/56391 (2018).

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