Un método de cultura alternativa para mantener la hipometilación genómica de células madre embrionarias del ratón usando MEK inhibidor PD0325901 y vitamina C
Summary
Describimos en detalle dos protocolos basados en químicos para el cultivo de células madre embrionarias de ratón. Este nuevo método utiliza mecanismos sinérgicos de promover oxidación mediada por Tet (vitamina C) y reprimiendo la síntesis de novo de la 5-METILCITOSINA (por PD0325901) para mantener el hypomethylation de la DNA y pluripotencia de células madre embrionarias de ratón.
Abstract
Las células madre embrionarias (ES) tienen el potencial de diferenciarse en cualquiera de las tres capas germinales (endodermo, mesodermo o ectodermo) y pueden generar muchos linajes para la medicina regenerativa. ES la célula cultura en vitro ha sido objeto de preocupación generalizada. Clásicamente, se mantienen las células de ratón ES en factor inhibitorio del suero y la leucemia (LIF)-que contiene el medio. Sin embargo, bajo condiciones de suero/LIF, las células muestran heterogeneidad en la morfología y el perfil de expresión de genes relacionados con la pluripotencia y sobre todo en un estado metaestable. Por otra parte, las células cultivadas ES exhiben hipermetilación global, pero ingenuo ES las células de la masa celular interna (ICM) y células de germen primordiales (PGCs) son en un estado de hipometilación global. El estado de hypomethylated de ICM y PGCs está estrechamente relacionado con su pluripotencia. Para mejorar los métodos de cultivo de células de ratón ES, recientemente hemos desarrollado un nuevo método basado en la utilización selectiva combinada de dos compuestos de moléculas pequeñas para mantener el estado de hypomethylated y pluripotentes de ADN. Aquí, presentamos el co tratamiento de vitamina C (Vc) y PD0325901 puede borrar cerca de 90% de 5-METILCITOSINA (5mC) en 5 días en células ES de ratón. El contenido generado 5mC es comparable a la de PGCs. La investigación mecanicista demuestra que PD0325901 para arriba-regula la expresión Prdm14 para suprimir la Dnmt3b (metiltransferasa de ADNde novo ) y Dnmt3l (el cofactor de Dnmt3b), reduciendo la síntesis de novo de 5mC. VC facilita la conversión de 5mC 5-hidroximetilcitosina (5hmC) catalizado principalmente por Tet1 y Tet2, indicando la participación de demethylations de ADN activos y pasivos. Por otra parte, bajo condiciones de Vc/PD0325901, las células ES de ratón muestran morfología homogénea y estado pluripotente. Colectiva, proponemos una novela y un método de cultura química-sinergia para lograr hypomethylation de la DNA y el mantenimiento de la pluripotencia en las células ES de ratón. El método de química dependiente de molécula pequeña supera las deficiencias principales de la cultura de suero y tiene promesa de generar células de ES homogéneas para más aplicaciones clínicas e investigaciones.
Introduction
Células madre embrionarias se originan del ICM de un blastocisto1. Las células están en un estado de pluripotencia y pueden formar todos los linajes somáticos y del germline las células2. Creación de células madre embrionarias ofrece la oportunidad de investigar el desarrollo de procesos en vitro y puede generar células de importancia médica para la medicina regenerativa basada en su pluripotencia3.
Establecido dos grupos seminally las líneas de células ES de ratón en 1981 y cuando las células derivadas del embrión temprano de ratón fueron cultivadas en suero fetal bovino (FBS)-que contiene medio con fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) como el alimentador capa1,4 . MEFs fueron inactivadas mitotically y crecieron los platos antes de cultivar células madre embrionarias. MEFs proporcionan soporte para el accesorio de células de ratón ES y producen factores de crecimiento para promover la propagación y reprimir la diferenciación5, mientras que FBS ofrece factores tróficos esenciales y hormonas para la proliferación celular. Estudios posteriores indicaron que LIF producido por las células de alimentador estaba de la citoquina clave para la auto renovación y mantenimiento de la pluripotencia en las células ES de ratón, y la adición de LIF en el medio podría sustituir células de alimentador6. En la actualidad, el mantenimiento de las células ES de ratón en medio de la FBS/LIF en alimentadores sigue siendo el método estándar adoptado por muchos investigadores. Sin embargo, algunos problemas con este enfoque de la cultura clásica. En primer lugar, alimentador células secretan factores exceso y sin control y pueden causar contaminación patógena7. Para evitar esta interferencia, cubriendo la superficie de los platos con gelatina y la adición de LIF en suero que contiene medio son métodos alternativos para mantener las células de ratón ES sin células de la capa de alimentador. Además, las células ES de ratón cultivadas bajo condiciones de suero/LIF exhiben heterogeneidad morfológica en poblaciones de la célula e incluso en el nivel de expresión de factores relacionados con la pluripotencia8. Estudios recientes sugieren que bajo condiciones de suero/LIF, los factores de transcripción básicos relacionados con la pluripotencia (incluyendo OCT4, SOX2 y Nanog) pueden mantener la pluripotencialidad LIF y WNT de señalización; sin embargo, en particular, también activan una señal de fibroblastos factor de crecimiento (FGF) para activar la diferenciación8. Debido a la doble acción ambivalente de los factores de transcripción del núcleo, células ES de ratón cultivadas en suero presentan heterogeneidad, consistiendo en dos poblaciones intercambiables, uno similar al ICM y otro parecido al epiblasto preparado estado8. Por otra parte, las células de ratón ES en suero a menudo muestran hipermetilación global9, mientras que ICM y PGCs se encuentran en un estado de hypomethylated global, que está estrechamente vinculado con su pluripotencia9,10.
Existe una demanda considerable para desarrollar nuevos métodos para el cultivo de células ES de ratón. Se han establecido varios protocolos mejorados desde 200311 pero sigue habiendo algunas limitaciones y defectos7. Desde 2008, la utilización combinada de dos inhibidores de la cinasa de molécula pequeña, PD0325901 (inhibidor de la cinasa de proteína activada por mitógeno (MAPK) / extracelular regulada por señal quinasa (ERK) (MEK)) y CHIR99021 (el inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK3)), en N2B27 medio con LIF y sin suero ha abierto nuevas perspectivas para células de ratón cultivo ES12. Este nuevo medio definido se caracteriza por el uso de dos inhibidores (2i). Las células ES de ratón cultivadas en medio 2i/LIF son más homogéneas en poblaciones celulares y la expresión de factores de pluripotencia. Además, las células de ratón 2i/LIF-cultivadas ES objeto expuesto hypomethylation de la DNA a nivel mundial, que está más cerca de ICM-como las células9,13. Aún así, la cultura 2i tiene sus desventajas. PD0325901 y CHIR99021 son insolubles en agua y generalmente se disuelven en dimetil sulfóxido (DMSO)-basado en la solución para añadir en medio de cultivo. Los estudios han demostrado a largo plazo y dosis bajas de exposición de las células a DMSO puede llevar a citotoxicidad14.
Aquí, utilizamos dos compuestos de moléculas pequeñas y desarrolló un nuevo método de cultivo de células ES de ratón. El método de cultivo novela combina Vc y MEK inhibidor PD0325901 para promover el hypomethylation de la DNA rápidamente y con eficacia a un nivel comparable de PGC, nombrado como el protocolo de cultivo de Vc/PD0325901. Células ES de ratón en Vc/PD0325901-agregado que contiene el suero medio exhiben homogeneidad en morfología y se mantienen en un estado de tierra. En comparación con cultura de 2i, células ES de ratón cultivadas bajo condiciones de Vc/PD0325901 exhiben cinética más rápida de la desmetilación del ADN y pueden alcanzar el nivel de la hipometilación comparable a la del PGC. Además, el uso de un único inhibidor (PD0325901) disminuye la cantidad de entrada de DMSO en medio en comparación con la utilizada en 2i (PD0325901/CHIR99021) y reduce el daño a las células.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el trabajo, hemos demostrado un nuevo método de la combinación de capital y PD0325901 para mantener las células de ratón ES en un estado indiferenciado y hypomethylated, que fue alcanzada por una acción sinérgica de promover la desmetilación del ADN por Vc y supresión de novo de DNA metilación de PD0325901. Por otra parte, las células ES de ratón demostraron gran morfología bajo el sistema de cultivo de Vc/PD0325901.
Para sustentar mejor el estado de las células de rat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la nacional Ciencias naturales Fundación de China (21435008 y 21327006 a H.W.) y el programa de investigación prioridad estratégica de la Academia China de Ciencias (XDB14030200 a H.W.).
Materials
| fetal bovine serum Australia source | Corning | 35-076-CV | Component of mouse ES cell medium |
| DMEM/high glucose | Hyclone | SH30022 | Component of mouse ES cell medium |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Component of mouse ES cell medium |
| non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140050 | Component of mouse ES cell medium |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Component of mouse ES cell medium |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | Component of mouse ES cell medium |
| penicillin streptomycin solution | Gibco | 15140122 | Component of mouse ES cell medium |
| PBS | Sigma | P5493 | Cells rinse |
| trypsin | Hyclone | SH30042 | Cell dissociation |
| gelatin | Sigma | 48722 | Dishes coating |
| PD0325901 | Stemolecule | 04-0006-10 | small-molecule chemical for cell culture |
| CHIR99021 | Stemolecule | 04-0004 | small-molecule chemical for cell culture |
| vitamin C | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | XW00508171 | small-molecule chemical for cell culture |
| Ultra Bioscience water purification systemr | Purelab | Ultra | Ultra water |
| DMSO | Sigma | D8418 | Cell freezing medium |
| centrifuger | Eppendorf | 5427R | DNA and protein extraction |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | Component of RIPA buffer |
| PMSF Protease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 36978 | Component of RIPA buffer |
| DTT | Sigma | 43815 | Component of RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E3889 | Component of RIPA buffer |
| Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 | Genomic DNA extraction |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | NanoDrop 2000 | Determination of DNA concentration |
| calf intestinal phosphatase | New England Biolabs | M0290 | DNA digestion |
| DNase I | New England Biolabs | M0303 | DNA digestion |
| snake venom phosphodiesterase I | Sigma | P4506 | DNA digestion |
| Nanosep 3K Omega | Pall | OD003C35 | filtration of digested DNA |
| 1290 UHPLC system | Agilent | 1290 | UHPLC separation |
| G6410B triple quadrupole mass spectrometer | Agilent | G6410B | MS/MS analysis |
| Zorbax Eclipse Plus C18 column | Agilent | Zorbax Eclipse Plus | colume for UHPLC separation |
| 5-methylcytosine | Solarbio Life Sciences | SM8900 | standard 5mC |
| 5-hydroxymethylcytosine (standard) | Toronto Research Chemicals | M295900 | standard 5hmC |
| Prdm14 antibody | bioworld | BS7634 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3a antibody | bioworld | BS6587 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3b antibody | abcam | ab13604 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3l antibody | abcam | ab3493 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt1 antibody | abcam | ab13537 | Western blot analysis-primary antibody |
| β-tubulin antibody | bioworld | BS1482MH | Western blot analysis-primary antibody |
| goat anti-rabbit IgG | abcam | ab6721 | Western blot analysis-secondary antibody |
| goat anti-mouse IgG | abcam | ab6789 | Western blot analysis-secondary antibody |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA extraction |
| reverse transcription system | Promega | A3500 | RNA reverse transcription |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | RT-PCR |
| StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit | Cells Biolabs, Inc. | CBA-302 | alkaline phosphatase staining analysis |
| mouse ES cells: WT, 129 SvEv | Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) | cell strain of mouse ES cells | |
| microscope | Zeiss | LSM510 | cells observation |
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad Prism Software Inc. | 5.0 | statistical analysis |
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