Une méthode de Culture Alternative pour maintenir l’hypométhylation génomique des cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de MEK inhibiteur PD0325901 et vitamine C
Summary
Nous avons décrit en détail deux protocoles de base chimique pour la culture des cellules souches embryonnaires de souris. Cette nouvelle méthode utilise des mécanismes synergiques de promouvoir l’oxydation induite par le Tet (par la vitamine C) et réprimant la synthèse de novo de la 5-méthylcytosine (par PD0325901) pour maintenir l’hypométhylation de l’ADN et la pluripotence des cellules souches embryonnaires de souris.
Abstract
Les cellules souches embryonnaires (ES) sont susceptibles de faire la différence dans l’une des trois couches germinales (endoderme, mésoderme et ectoderme) et peuvent générer de nombreux lignages pour la médecine régénérative. ES cellules la culture in vitro est depuis longtemps l’objet de préoccupations répandues. Classiquement, les souris ES cellules sont maintenues en facteur inhibiteur sérique et la leucémie (LIF)-contenant le support. Toutefois, dans des conditions de sérum ou d’un FRV, cellules montrent l’hétérogénéité dans la morphologie et le profil d’expression des gènes reliés à la pluripotence et sont pour la plupart dans un état métastable. En outre, des cellules ES pièce hyperméthylation globale, mais cellules ES naïve de la masse cellulaire interne (MCI) et les cellules germinales primordiales (PGC) sont dans un état de l’hypométhylation globale. L’État hypométhylés de l’ICM et PGC est étroitement associé à leur pluripotence. Pour améliorer les méthodes de culture cellulaire souris ES, nous avons récemment mis au point une nouvelle méthode basée sur l’utilisation sélective combinée des deux composés de petites molécules pour maintenir l’état de hypométhylés et pluripotentes d’ADN. Ici, nous présentons qui le co-traitement de vitamine C (Vc) et PD0325901 permet d’effacer environ 90 % de la 5-méthylcytosine (5mC) à 5 jours dans les cellules ES de souris. Le contenu généré 5mC est comparable à celui dans le PGC. L’enquête mécaniste montre que PD0325901 up-régule l’expression Prdm14 pour supprimer Dnmt3b (de novo ADN méthyltransférase) et Dnmt3l (le cofacteur de Dnmt3b), en réduisant la synthèse de novo de 5mC. VC facilite la conversion de 5mC à 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) catalysée principalement par Tet1 et Tet2, en indiquant l’implication des demethylations ADN passives et actives. Par ailleurs, dans des conditions de Vc/PD0325901, cellules ES souris montrent morphologie homogène et état pluripotent. Collectivement, nous vous proposons un procédé nouveau et culture chimique-synergie pour atteindre l’hypométhylation de l’ADN et l’entretien de la pluripotence des cellules de souris ES. La méthode chimique dépendant de petites molécules permet de surmonter les lacunes importantes de la culture de sérum et promesse de cales pour générer des cellules ES homogènes pour davantage les applications cliniques et de recherches.
Introduction
CSEh est provenus de l’ICM un blastocyste1. Les cellules sont dans un état de pluripotence et peuvent former tous les lignages somatiques et de cellules germinales2. Mise en place de cellules d’ES fournit l’occasion d’étudier le développement des processus in vitro et peut générer des cellules médicales présentant un intérêt pour la médecine régénérative basée sur leur pluripotence3.
Deux groupes seminally établi les lignées de cellules de souris ES en 1981 et quand a cultivé des cellules dérivées de l’embryon précoce de souris en sérum fœtal (SVF)-contenant le support avec les fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) que le chargeur couche1,4 . MEFs étaient inactivés mitose et ont été préalablement cultivées dans les plats avant mise en culture des cellules ES. MEFs appuient à la fixation des cellules ES de souris et produisent des facteurs de croissance pour promouvoir la propagation et de réprimer la différenciation5, tandis que le FBS propose des facteurs trophiques essentiels et hormones pour la prolifération cellulaire. Des études subséquentes indiquent que FRV produite par des cellules nourricières était la cytokine clée pour l’auto-renouvellement et l’entretien de pluripotence dans les cellules ES de souris, et l’addition de FRV dans le milieu pourrait remplacer alimentation cellules6. Actuellement, le maintien des cellules ES de souris dans un milieu FBS/FRV sur mangeoires est toujours la méthode standard adoptée par de nombreux chercheurs. Cependant, quelques problèmes avec cette approche de la culture classique. Tout d’abord, des cellules nourricières sécrètent des facteurs excessives et incontrôlées et peuvent causer la contamination pathogène7. Pour éviter cette ingérence, revêtement de la surface des plats avec de la gélatine et l’ajout de FRV dans contenant du sérum moyen sont des méthodes alternatives pour maintenir les cellules de souris ES sans cellules de la couche de conducteur. En outre, les cellules d’ES de souris cultivées dans des conditions de sérum/FRV pièce hétérogénéité morphologique dans les populations de cellules et même dans le niveau d’expression de facteurs liés à la pluripotence8. Des études récentes suggèrent que, dans des conditions de sérum ou d’un FRV, les facteurs de transcription de base liées à la pluripotence (y compris OCT4, SOX2 et Nanog) peuvent maintenir la pluripotence FRV et WNT signaling ; Cependant, en particulier, ils activent également un signal de facteur de croissance (FGF) de fibroblastes pour déclencher la différenciation8. En raison de la double action ambivalente, les base de facteurs de transcription, souris ES cellules cultivées dans le sérum présentes hétérogénéité, composé de deux sous-groupes interchangeables, un semblable à l’ICM et une autre qui ressemble à l’épiblaste apprêtée état8. En outre, les cellules de souris ES dans le sérum présentent souvent hyperméthylation global9, tandis que ICM et PGC est dans un état de hypométhylés global, qui est étroitement lié à leur pluripotence9,10.
Il y a une demande considérable pour développer de nouvelles méthodes de culture de cellules de souris ES. Plusieurs protocoles améliorés ont été établis depuis 200311 , mais il y a encore quelques limitations et défauts7. Depuis 2008, l’utilisation combinée des deux inhibiteurs de la kinase de petites molécules, PD0325901 (l’inhibiteur de la protéine mitogène-kinase (MAPK) / extracellulaire-signal-regulated kinase ERK (MEK)) et CHIR99021 (l’inhibiteur de la glycogène synthase kinase 3 (GSK3)), en N2B27 milieu avec FRV et sans sérum a ouvert des nouvelles perspectives culture souris ES cellules12. Ce nouveau milieu défini est caractérisé par l’utilisation de deux inhibiteurs (2i). Les cellules ES de souris cultivées dans un milieu 2i/FRV sont plus homogènes dans les populations de cellules et l’expression des facteurs de pluripotence. En outre, des cellules de souris cultivées 2i/FRV ES pièce hypométhylation de l’ADN dans le monde, qui est plus proche de cellules ICM9,13. Malgré cela, la culture 2i a ses inconvénients. PD0325901 et CHIR99021 sont insolubles dans l’eau sont généralement dissous dans le diméthylsulfoxyde (DMSO)-base de solution mère pour les ajouter dans le milieu de culture. Des études ont montré qu’à long terme et exposition de faible dose de cellules à DMSO peut conduire à la cytotoxicité14.
Ici, nous avons utilisé deux composés de petites molécules et mis au point une nouvelle méthode de culture de cellules de souris ES. La méthode de culture originale allie Vc et MEK inhibiteur PD0325901 pour promouvoir l’hypométhylation de l’ADN rapidement et efficacement à un niveau comparable de PGC, nommé comme le protocole de culture Vc/PD0325901. Les cellules de souris ES dans Vc/PD0325901-ajout d’un milieu contenant du sérum pièce homogénéité morphologique et sont maintenues dans un état fondamental. Par rapport à la culture de 2i, cellules ES de souris cultivées dans des conditions de Vc/PD0325901 pièce cinétique rapide de déméthylation de l’ADN et peuvent atteindre le niveau de l’hypométhylation comparable à celle du PGC. En outre, l’utilisation d’un inhibiteur d’unique (PD0325901) diminue la quantité d’entrée de DMSO en moyenne par rapport à celle utilisée dans la 2i (PD0325901/CHIR99021) et réduit les dommages aux cellules.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans le travail, nous avons démontré une méthode originale de combiner Vc et PD0325901 afin de soutenir des cellules de souris ES à un État indifférencié et hypométhylés, qui a été réalisé par une action synergique favorisant la déméthylation de l’ADN par CR et la suppression de novo de l’ADN méthylation de PD0325901. En outre, souris ES cellules montrent morphologie grande sous le système de culture Vc/PD0325901.
Afin de mieux soutenir l’état de cellules de so…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale sciences naturelles de Chine (21435008 et 21327006 à H.W.) et le programme de recherche stratégique prioritaire de l’Académie chinoise des Sciences (XDB14030200 à H.W.).
Materials
| fetal bovine serum Australia source | Corning | 35-076-CV | Component of mouse ES cell medium |
| DMEM/high glucose | Hyclone | SH30022 | Component of mouse ES cell medium |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Component of mouse ES cell medium |
| non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140050 | Component of mouse ES cell medium |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Component of mouse ES cell medium |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | Component of mouse ES cell medium |
| penicillin streptomycin solution | Gibco | 15140122 | Component of mouse ES cell medium |
| PBS | Sigma | P5493 | Cells rinse |
| trypsin | Hyclone | SH30042 | Cell dissociation |
| gelatin | Sigma | 48722 | Dishes coating |
| PD0325901 | Stemolecule | 04-0006-10 | small-molecule chemical for cell culture |
| CHIR99021 | Stemolecule | 04-0004 | small-molecule chemical for cell culture |
| vitamin C | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | XW00508171 | small-molecule chemical for cell culture |
| Ultra Bioscience water purification systemr | Purelab | Ultra | Ultra water |
| DMSO | Sigma | D8418 | Cell freezing medium |
| centrifuger | Eppendorf | 5427R | DNA and protein extraction |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | Component of RIPA buffer |
| PMSF Protease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 36978 | Component of RIPA buffer |
| DTT | Sigma | 43815 | Component of RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E3889 | Component of RIPA buffer |
| Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 | Genomic DNA extraction |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | NanoDrop 2000 | Determination of DNA concentration |
| calf intestinal phosphatase | New England Biolabs | M0290 | DNA digestion |
| DNase I | New England Biolabs | M0303 | DNA digestion |
| snake venom phosphodiesterase I | Sigma | P4506 | DNA digestion |
| Nanosep 3K Omega | Pall | OD003C35 | filtration of digested DNA |
| 1290 UHPLC system | Agilent | 1290 | UHPLC separation |
| G6410B triple quadrupole mass spectrometer | Agilent | G6410B | MS/MS analysis |
| Zorbax Eclipse Plus C18 column | Agilent | Zorbax Eclipse Plus | colume for UHPLC separation |
| 5-methylcytosine | Solarbio Life Sciences | SM8900 | standard 5mC |
| 5-hydroxymethylcytosine (standard) | Toronto Research Chemicals | M295900 | standard 5hmC |
| Prdm14 antibody | bioworld | BS7634 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3a antibody | bioworld | BS6587 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3b antibody | abcam | ab13604 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3l antibody | abcam | ab3493 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt1 antibody | abcam | ab13537 | Western blot analysis-primary antibody |
| β-tubulin antibody | bioworld | BS1482MH | Western blot analysis-primary antibody |
| goat anti-rabbit IgG | abcam | ab6721 | Western blot analysis-secondary antibody |
| goat anti-mouse IgG | abcam | ab6789 | Western blot analysis-secondary antibody |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA extraction |
| reverse transcription system | Promega | A3500 | RNA reverse transcription |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | RT-PCR |
| StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit | Cells Biolabs, Inc. | CBA-302 | alkaline phosphatase staining analysis |
| mouse ES cells: WT, 129 SvEv | Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) | cell strain of mouse ES cells | |
| microscope | Zeiss | LSM510 | cells observation |
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad Prism Software Inc. | 5.0 | statistical analysis |
References
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