Summary

Une méthode de Culture Alternative pour maintenir l’hypométhylation génomique des cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de MEK inhibiteur PD0325901 et vitamine C

Published: June 01, 2018
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Summary

Nous avons décrit en détail deux protocoles de base chimique pour la culture des cellules souches embryonnaires de souris. Cette nouvelle méthode utilise des mécanismes synergiques de promouvoir l’oxydation induite par le Tet (par la vitamine C) et réprimant la synthèse de novo de la 5-méthylcytosine (par PD0325901) pour maintenir l’hypométhylation de l’ADN et la pluripotence des cellules souches embryonnaires de souris.

Abstract

Les cellules souches embryonnaires (ES) sont susceptibles de faire la différence dans l’une des trois couches germinales (endoderme, mésoderme et ectoderme) et peuvent générer de nombreux lignages pour la médecine régénérative. ES cellules la culture in vitro est depuis longtemps l’objet de préoccupations répandues. Classiquement, les souris ES cellules sont maintenues en facteur inhibiteur sérique et la leucémie (LIF)-contenant le support. Toutefois, dans des conditions de sérum ou d’un FRV, cellules montrent l’hétérogénéité dans la morphologie et le profil d’expression des gènes reliés à la pluripotence et sont pour la plupart dans un état métastable. En outre, des cellules ES pièce hyperméthylation globale, mais cellules ES naïve de la masse cellulaire interne (MCI) et les cellules germinales primordiales (PGC) sont dans un état de l’hypométhylation globale. L’État hypométhylés de l’ICM et PGC est étroitement associé à leur pluripotence. Pour améliorer les méthodes de culture cellulaire souris ES, nous avons récemment mis au point une nouvelle méthode basée sur l’utilisation sélective combinée des deux composés de petites molécules pour maintenir l’état de hypométhylés et pluripotentes d’ADN. Ici, nous présentons qui le co-traitement de vitamine C (Vc) et PD0325901 permet d’effacer environ 90 % de la 5-méthylcytosine (5mC) à 5 jours dans les cellules ES de souris. Le contenu généré 5mC est comparable à celui dans le PGC. L’enquête mécaniste montre que PD0325901 up-régule l’expression Prdm14 pour supprimer Dnmt3b (de novo ADN méthyltransférase) et Dnmt3l (le cofacteur de Dnmt3b), en réduisant la synthèse de novo de 5mC. VC facilite la conversion de 5mC à 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) catalysée principalement par Tet1 et Tet2, en indiquant l’implication des demethylations ADN passives et actives. Par ailleurs, dans des conditions de Vc/PD0325901, cellules ES souris montrent morphologie homogène et état pluripotent. Collectivement, nous vous proposons un procédé nouveau et culture chimique-synergie pour atteindre l’hypométhylation de l’ADN et l’entretien de la pluripotence des cellules de souris ES. La méthode chimique dépendant de petites molécules permet de surmonter les lacunes importantes de la culture de sérum et promesse de cales pour générer des cellules ES homogènes pour davantage les applications cliniques et de recherches.

Introduction

CSEh est provenus de l’ICM un blastocyste1. Les cellules sont dans un état de pluripotence et peuvent former tous les lignages somatiques et de cellules germinales2. Mise en place de cellules d’ES fournit l’occasion d’étudier le développement des processus in vitro et peut générer des cellules médicales présentant un intérêt pour la médecine régénérative basée sur leur pluripotence3.

Deux groupes seminally établi les lignées de cellules de souris ES en 1981 et quand a cultivé des cellules dérivées de l’embryon précoce de souris en sérum fœtal (SVF)-contenant le support avec les fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) que le chargeur couche1,4 . MEFs étaient inactivés mitose et ont été préalablement cultivées dans les plats avant mise en culture des cellules ES. MEFs appuient à la fixation des cellules ES de souris et produisent des facteurs de croissance pour promouvoir la propagation et de réprimer la différenciation5, tandis que le FBS propose des facteurs trophiques essentiels et hormones pour la prolifération cellulaire. Des études subséquentes indiquent que FRV produite par des cellules nourricières était la cytokine clée pour l’auto-renouvellement et l’entretien de pluripotence dans les cellules ES de souris, et l’addition de FRV dans le milieu pourrait remplacer alimentation cellules6. Actuellement, le maintien des cellules ES de souris dans un milieu FBS/FRV sur mangeoires est toujours la méthode standard adoptée par de nombreux chercheurs. Cependant, quelques problèmes avec cette approche de la culture classique. Tout d’abord, des cellules nourricières sécrètent des facteurs excessives et incontrôlées et peuvent causer la contamination pathogène7. Pour éviter cette ingérence, revêtement de la surface des plats avec de la gélatine et l’ajout de FRV dans contenant du sérum moyen sont des méthodes alternatives pour maintenir les cellules de souris ES sans cellules de la couche de conducteur. En outre, les cellules d’ES de souris cultivées dans des conditions de sérum/FRV pièce hétérogénéité morphologique dans les populations de cellules et même dans le niveau d’expression de facteurs liés à la pluripotence8. Des études récentes suggèrent que, dans des conditions de sérum ou d’un FRV, les facteurs de transcription de base liées à la pluripotence (y compris OCT4, SOX2 et Nanog) peuvent maintenir la pluripotence FRV et WNT signaling ; Cependant, en particulier, ils activent également un signal de facteur de croissance (FGF) de fibroblastes pour déclencher la différenciation8. En raison de la double action ambivalente, les base de facteurs de transcription, souris ES cellules cultivées dans le sérum présentes hétérogénéité, composé de deux sous-groupes interchangeables, un semblable à l’ICM et une autre qui ressemble à l’épiblaste apprêtée état8. En outre, les cellules de souris ES dans le sérum présentent souvent hyperméthylation global9, tandis que ICM et PGC est dans un état de hypométhylés global, qui est étroitement lié à leur pluripotence9,10.

Il y a une demande considérable pour développer de nouvelles méthodes de culture de cellules de souris ES. Plusieurs protocoles améliorés ont été établis depuis 200311 , mais il y a encore quelques limitations et défauts7. Depuis 2008, l’utilisation combinée des deux inhibiteurs de la kinase de petites molécules, PD0325901 (l’inhibiteur de la protéine mitogène-kinase (MAPK) / extracellulaire-signal-regulated kinase ERK (MEK)) et CHIR99021 (l’inhibiteur de la glycogène synthase kinase 3 (GSK3)), en N2B27 milieu avec FRV et sans sérum a ouvert des nouvelles perspectives culture souris ES cellules12. Ce nouveau milieu défini est caractérisé par l’utilisation de deux inhibiteurs (2i). Les cellules ES de souris cultivées dans un milieu 2i/FRV sont plus homogènes dans les populations de cellules et l’expression des facteurs de pluripotence. En outre, des cellules de souris cultivées 2i/FRV ES pièce hypométhylation de l’ADN dans le monde, qui est plus proche de cellules ICM9,13. Malgré cela, la culture 2i a ses inconvénients. PD0325901 et CHIR99021 sont insolubles dans l’eau sont généralement dissous dans le diméthylsulfoxyde (DMSO)-base de solution mère pour les ajouter dans le milieu de culture. Des études ont montré qu’à long terme et exposition de faible dose de cellules à DMSO peut conduire à la cytotoxicité14.

Ici, nous avons utilisé deux composés de petites molécules et mis au point une nouvelle méthode de culture de cellules de souris ES. La méthode de culture originale allie Vc et MEK inhibiteur PD0325901 pour promouvoir l’hypométhylation de l’ADN rapidement et efficacement à un niveau comparable de PGC, nommé comme le protocole de culture Vc/PD0325901. Les cellules de souris ES dans Vc/PD0325901-ajout d’un milieu contenant du sérum pièce homogénéité morphologique et sont maintenues dans un état fondamental. Par rapport à la culture de 2i, cellules ES de souris cultivées dans des conditions de Vc/PD0325901 pièce cinétique rapide de déméthylation de l’ADN et peuvent atteindre le niveau de l’hypométhylation comparable à celle du PGC. En outre, l’utilisation d’un inhibiteur d’unique (PD0325901) diminue la quantité d’entrée de DMSO en moyenne par rapport à celle utilisée dans la 2i (PD0325901/CHIR99021) et réduit les dommages aux cellules.

Protocol

1. les préparatifs Préparer une solution de 1,0 mM PD0325901 (inhibiteur de la MEK) et 3,0 mM CHIR99021 (inhibiteur de GSK3). Peser 2 mg de PD0325901 et ajouter 4,15 mL de DMSO dans un flacon de verre ambré. Peser 2 mg de CHIR99021 et ajouter 1,43 mL de DMSO dans un flacon de verre ambré. Suivante reconstitution, stocker aliquotes (50 µL/tube en tube PCR 200 µL) à-20 ° C et l’abri de la lumière. Retirer un tube contenant le stock congelé d’une cong…

Representative Results

VC/PD0325901 induite en synergie l’effacement global de cellules ES de souris. Dans le sérum, les cellules de souris ES pièce hyperméthylation de l’ADN, tandis que les cellules pluripotentes ICM et PGC montrent l’effacement global de la méthylation de l’ADN et de l’État hypométhylés est étroitement lié à leur pluripotence9,10. Auparavant, nous et autr…

Discussion

Dans le travail, nous avons démontré une méthode originale de combiner Vc et PD0325901 afin de soutenir des cellules de souris ES à un État indifférencié et hypométhylés, qui a été réalisé par une action synergique favorisant la déméthylation de l’ADN par CR et la suppression de novo de l’ADN méthylation de PD0325901. En outre, souris ES cellules montrent morphologie grande sous le système de culture Vc/PD0325901.

Afin de mieux soutenir l’état de cellules de so…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale sciences naturelles de Chine (21435008 et 21327006 à H.W.) et le programme de recherche stratégique prioritaire de l’Académie chinoise des Sciences (XDB14030200 à H.W.).

Materials

fetal bovine serum Australia source Corning 35-076-CV Component of mouse ES cell medium
DMEM/high glucose Hyclone SH30022 Component of mouse ES cell medium
LIF Millipore ESG1107 Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140050 Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvate Gibco 11360070 Component of mouse ES cell medium
L-glutamine Gibco 25030081 Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solution Gibco 15140122 Component of mouse ES cell medium
PBS Sigma P5493 Cells rinse
trypsin Hyclone SH30042 Cell dissociation
gelatin Sigma 48722 Dishes coating
PD0325901 Stemolecule 04-0006-10 small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021 Stemolecule 04-0004 small-molecule chemical for cell culture
vitamin C Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd  XW00508171 small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemr Purelab Ultra Ultra water
DMSO Sigma D8418 Cell freezing medium
centrifuger Eppendorf 5427R DNA and protein extraction
protease inhibitor cocktail Sigma P8340 Component of RIPA buffer
PMSF Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 36978 Component of RIPA buffer
DTT Sigma 43815 Component of RIPA buffer
EGTA Sigma E3889 Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit  Promega A1125 Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000 ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000 Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphatase New England Biolabs M0290 DNA digestion
DNase I New England Biolabs M0303 DNA digestion
snake venom phosphodiesterase I Sigma P4506 DNA digestion
Nanosep 3K Omega Pall OD003C35 filtration of digested DNA
1290 UHPLC system Agilent  1290 UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometer Agilent  G6410B MS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 column Agilent  Zorbax Eclipse Plus colume for UHPLC separation
5-methylcytosine Solarbio Life Sciences SM8900  standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard) Toronto Research Chemicals M295900 standard 5hmC
Prdm14 antibody bioworld BS7634 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibody bioworld BS6587 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibody abcam ab13604 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibody abcam ab3493 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibody abcam ab13537 Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibody bioworld BS1482MH Western blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgG abcam ab6721 Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgG abcam ab6789 Western blot analysis-secondary antibody
Trizol Invitrogen 15596-026 RNA extraction
reverse transcription system Promega A3500 RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001 RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit Cells Biolabs, Inc. CBA-302  alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEv Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) cell strain of mouse ES cells
microscope Zeiss LSM510 cells observation
GraphPad Prism 5.0 GraphPad Prism Software Inc. 5.0 statistical analysis

References

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Li, C., Lai, W., Wang, H. An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C. J. Vis. Exp. (136), e56391, doi:10.3791/56391 (2018).

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