Summary

أسلوب ثقافة بديلة للحفاظ على هيبوميثيليشن الجينية للخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام مجاهدي خلق مثبطات PD0325901 وفيتامين (ج)

Published: June 01, 2018
doi:

Summary

وصفت لنا بالتفصيل البروتوكولين على أساس المادة الكيميائية لاستزراع الخلايا الجذعية الجنينية الماوس. ويستخدم هذا الأسلوب الجديد التآزري آليات تعزيز أكسدة تيت بوساطة (بفيتامين ج) وقمع حيثياته توليف 5-ميثيلسيتوسيني (حسب PD0325901) للحفاظ على الحمض النووي هيبوميثيليشن وبلوريبوتينسي من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس.

Abstract

الخلايا الجذعية الجنينية (ES) لديها القدرة على التفريق بين أي من الطبقات الجرثومية الثلاث (الأنسجة أو ميسوديرم أو الأديم الظاهر)، ويمكن أن تولد الكثير من الأنساب للطب التجديدي. وفاق خلية الثقافة في المختبر منذ أمد بعيد موضوع مخاوف على نطاق واسع. تقليديا، يتم الاحتفاظ بالماوس دإط الخلايا في مصل الدم وسرطان الدم من العوامل المثبطة (LIF)-التي تحتوي على المتوسط. بيد تحت ظروف المصل/ليف، الخلايا إظهار عدم التجانس في التشكل والتشكيل الجانبي لتعبير الجينات المتعلقة بلوريبوتينسي، وهي في معظمها في دولة يتواجد. وعلاوة على ذلك، مثقف دإط الخلايا معرض هايبرميثيليشن العالمي، ولكن السذاجة دإط الخلايا من كتلة الخلايا الداخلية (ICM) والخلايا الجرثومية الأساسية (بجكس) في حالة من هيبوميثيليشن العالمية. الدولة هيبوميثيلاتيد ICM وبجكس يرتبط ارتباطاً وثيقا بما بلوريبوتينسي. لتحسين أساليب الثقافة الخلية الماوس دإط، وضعنا مؤخرا طريقة جديدة على أساس استخدام مجتمعة بشكل انتقائي من المركبين جزيء صغير للحفاظ على الدولة هيبوميثيلاتيد و pluripotent في الحمض النووي. هنا، نقدم هذا العلاج المشارك من فيتامين ج (Vc)، ويمكن محو PD0325901 حوالي 90 في المائة من 5-ميثيلسيتوسيني (5mC) في 5 أيام في الماوس دإط الخلايا. المحتوى الذي تم إنشاؤه 5mC يماثل في بجكس. آليا إلى التحقيق يظهر أن PD0325901 أعلى-وينظم التعبير Prdm14 لقمع Dnmt3b (دي نوفو الحمض النووي ميثيلترانسفيراسي) و Dnmt3l (مساعد Dnmt3b)، بخفض التوليف 5mC دي نوفو . Vc يسهل تحويل 5mC إلى 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC) تحفزها أساسا Tet1 و Tet2، التي تشير إلى تورط ديميثيليشنز الحمض النووي السلبي والإيجابي على حد سواء. وعلاوة على ذلك، تظهر الماوس دإط الخلايا تحت ظروف Vc/PD0325901، مورفولوجيا متجانسة والدولة pluripotent. جماعياً، نقترح الرواية والأسلوب الثقافة الكيميائية-التآزر لتحقيق هيبوميثيليشن الحمض النووي والحفاظ على بلوريبوتينسي في خلايا الفأر ES. طريقة كيميائية تعتمد على جزيء صغير ويتغلب على أوجه القصور الرئيسية في الثقافة المصل، ويحمل وعدا بتوليد خلايا ES متجانسة لمزيد من التطبيقات السريرية، والأبحاث.

Introduction

دإط الخلايا نشأت من ICM من الكيسة1. في حالة بلوريبوتينسي الخلايا ويمكن أن تشكل جميع الأنساب الجسدية و خلايا germline2. إنشاء خلايا ES يوفر الفرصة للتحقيق في تطوير العمليات في المختبر ويمكن أن تولد خلايا ذات الأهمية الطبية للطب التجديدي استناداً على بلوريبوتينسي3.

إنشاء فريقين يحملني خطوط الخلايا الماوس وفاق في عام 1981 وعندما كانت استزراع الخلايا المشتقة من الأجنة الماوس المبكر في مصل الدم البقري الجنين (FBS)-تتضمن المتوسطة مع الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEFs) كتغذية طبقة1،4 . تم إبطال ميتوتيكالي ميفس وكانت تزرع مسبقاً في الأطباق قبل استزراع خلايا ES. تقديم الدعم لمرفق خلية الماوس ES ميفس وإنتاج عوامل النمو لتعزيز نشر وقمع التمايز5، بينما يقدم FBS العوامل التغذوية الأساسية والهرمونات لتكاثر الخلايا. بينت الدراسات اللاحقة أن ليف تنتجها الخلايا المغذية سيتوكين رئيسي للذاتي تجديد وصيانة بلوريبوتينسي في الماوس دإط الخلايا، وإضافة ليف في المتوسط يمكن أن تكون بديلاً لتغذية الخلايا6. في الوقت الراهن، الاكتفاء الماوس دإط الخلايا في المتوسط FBS/ليف على مغذيات لا يزال الأسلوب القياسي اعتمده العديد من الباحثين. ومع ذلك، تنشأ بعض المشاكل مع هذا النهج الثقافة الكلاسيكية. أولاً، تغذية الخلايا تفرز عوامل الزائدة وغير المنضبط وقد يسبب التلوث المسببة للمرض7. لتجنب هذا التدخل، وطلاء سطح الأطباق مع الجيلاتين وإضافة ليف في المحتوية على مصل المتوسطة أساليب بديلة للحفاظ على الماوس دإط الخلايا دون تغذية طبقة الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، يحمل الماوس دإط الخلايا نمت تحت ظروف المصل/ليف المورفولوجية عدم التجانس في السكان خلية وحتى في مستوى التعبير من العوامل المتصلة بلوريبوتينسي8. تشير الدراسات الأخيرة إلى أن عوامل النسخ الأساسية المتصلة بلوريبوتينسي (بما في ذلك SOX2 ونانج OCT4) يمكن الحفاظ على ظروف المصل/ليف، بلوريبوتينسي عن طريق الآنف و WNT الإشارات؛ ومع ذلك، خصوصا، أنها أيضا تنشيط إشارة عامل النمو (صندوق الأجيال القادمة) تنتجها الخلايا الليفية لتحريك التمايز8. بسبب العمل المزدوج المتناقض لعوامل النسخ الأساسية، تقديم الماوس دإط الخلايا المستزرعة في المصل التغايرية، تتألف من السكان للتبادل اثنين، واحد مماثلة لمؤسسة أي سي أم وأخرى تشبه الدولة epiblast معبي8. وعلاوة على ذلك، الماوس دإط الخلايا في مصل الدم يحمل غالباً ما هايبرميثيليشن العالمي9، بينما ICM وبجكس في حالة هيبوميثيلاتيد عالمية، التي ترتبط ارتباطاً وثيقا بما9،بلوريبوتينسي10.

وهناك طلب كبير لتطوير أساليب جديدة لاستزراع خلايا الفأر ES. وقد أقيمت عدة بروتوكولات تحسن منذ عام 200311 ولكن لا تزال هناك بعض القيود وأوجه القصور7. منذ عام 2008 بالجمع بين استخدام اثنين كيناز جزيء صغير مثبطات، PD0325901 (مثبط للبروتين المنشط mitogen كيناز (MAPK)/ينظم إشارة خارج الخلية كيناز (إيرك) (مجاهدي خلق)) و CHIR99021 (مثبطات سينثاز الجليكوجين كيناز 3 (GSK3))، في ن2ب27 المتوسطة مع الآنف ودون المصل إلى فتح آفاق جديدة للماوس تثقيف دإط الخلايا12. هذه الوسيلة المعرفة الجديدة تتميز باستعمال مثبطات اثنين (2i). دإط الماوس الخلايا المستزرعة في المتوسط 2 طاء/ليف أكثر تجانساً في الخلية السكان والتعبير عن العوامل بلوريبوتينسي. وبالإضافة إلى ذلك، أن الماوس 2 طاء/ليف-مثقف دإط الخلايا يحمل هيبوميثيليشن الحمض النووي على الصعيد العالمي، وهو أقرب إلى الخلايا مثل ICM9،13. ومع ذلك فقد الثقافة 2 طاء عيوبها. PD0325901 CHIR99021 غير قابلة للذوبان في الماء، وعموما يتم حله في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])-على أساس حل الأسهم لإضافتها في الثقافة المتوسطة. وقد أظهرت الدراسات أن طويل الأجل ويمكن أن يؤدي التعرض لجرعة منخفضة من الخلايا إلى [دمس] إلى سيتوتوكسيسيتي14.

هنا، يمكننا استخدام المركبين جزيء صغير ووضع أسلوب ثقافة جديدة للماوس دإط الخلايا. الأسلوب الثقافة رواية يجمع بين المانع الرأسمالي ومجاهدي خلق PD0325901 النهوض هيبوميثيليشن الحمض النووي بسرعة وفعالية على مستوى مماثل من PGC، اسمه كبروتوكول تثقيف Vc/PD0325901. معرض التجانس في مورفولوجيا الخلايا ES الماوس في Vc/PD0325901–أضيفت المتوسطة المحتوية على مصل وهي مستمرة في حالة الأرض. بالمقارنة مع الثقافة 2 طاء، الماوس دإط الخلايا المزروعة تحت ظروف Vc/PD0325901 يحمل أسرع حركية demethylation الحمض النووي ويمكن أن تصل إلى مستوى هيبوميثيليشن مماثلة لتلك التي PGC. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام مثبط واحد (PD0325901) يقلل كمية المدخلات [دمس] في المتوسط بالمقارنة مع تلك المستخدمة في 2i (PD0325901/CHIR99021)، ويقلل من الضرر للخلايا.

Protocol

1-الأعمال التحضيرية تعد الحل من 1.0 مم PD0325901 (مثبط لمجاهدى خلق) ومم 3.0 CHIR99021 (مثبط GSK3). تزن 2 مغ PD0325901 وإضافة مل 4.15 من [دمس] في قنينة زجاج العنبر. تزن 2 مغ CHIR99021 وإضافة مل 1.43 من [دمس] في قنينة زجاج العنبر. إعادة تشكيل التالية، تخزين مختبرين (50 ميليلتر/أنبوب في أنابيب PCR م…

Representative Results

Vc/PD0325901 فعل تآزر المحو العالمية للماوس دإط الخلايا. خلايا ES الماوس في مصل الدم يحمل هايبرميثيليشن الحمض النووي، بينما pluripotent الخلايا ICM وبجكس إظهار انتفاء مثلايشن الحمض النووي العالمي والدولة هيبوميثيلاتيد يرتبط ارتباطاً وثيقا بما9،بلوريبوتينسي<sup class…

Discussion

وفي هذا العمل، أثبتنا طريقة جديدة للجمع بين الرأسمالي و PD0325901 للحفاظ على خلايا الفأر ES في حالة غير متمايزة وهيبوميثيلاتيد، الذي تم التوصل إليه قبل إجراء تعاوني لتعزيز demethylation DNA بالاستثمار الرأسمالي، وقمع حيثياته الحمض النووي مثلايشن التي PD0325901. وعلاوة على ذلك، أظهرت الماوس دإط الخلا…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيده هذا العمل الوطني العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (21435008 و 21327006 إلى الأب)، وبرنامج البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية للأكاديمية الصينية للعلوم (XDB14030200 إلى الأب).

Materials

fetal bovine serum Australia source Corning 35-076-CV Component of mouse ES cell medium
DMEM/high glucose Hyclone SH30022 Component of mouse ES cell medium
LIF Millipore ESG1107 Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140050 Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvate Gibco 11360070 Component of mouse ES cell medium
L-glutamine Gibco 25030081 Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solution Gibco 15140122 Component of mouse ES cell medium
PBS Sigma P5493 Cells rinse
trypsin Hyclone SH30042 Cell dissociation
gelatin Sigma 48722 Dishes coating
PD0325901 Stemolecule 04-0006-10 small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021 Stemolecule 04-0004 small-molecule chemical for cell culture
vitamin C Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd  XW00508171 small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemr Purelab Ultra Ultra water
DMSO Sigma D8418 Cell freezing medium
centrifuger Eppendorf 5427R DNA and protein extraction
protease inhibitor cocktail Sigma P8340 Component of RIPA buffer
PMSF Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 36978 Component of RIPA buffer
DTT Sigma 43815 Component of RIPA buffer
EGTA Sigma E3889 Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit  Promega A1125 Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000 ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000 Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphatase New England Biolabs M0290 DNA digestion
DNase I New England Biolabs M0303 DNA digestion
snake venom phosphodiesterase I Sigma P4506 DNA digestion
Nanosep 3K Omega Pall OD003C35 filtration of digested DNA
1290 UHPLC system Agilent  1290 UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometer Agilent  G6410B MS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 column Agilent  Zorbax Eclipse Plus colume for UHPLC separation
5-methylcytosine Solarbio Life Sciences SM8900  standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard) Toronto Research Chemicals M295900 standard 5hmC
Prdm14 antibody bioworld BS7634 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibody bioworld BS6587 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibody abcam ab13604 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibody abcam ab3493 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibody abcam ab13537 Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibody bioworld BS1482MH Western blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgG abcam ab6721 Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgG abcam ab6789 Western blot analysis-secondary antibody
Trizol Invitrogen 15596-026 RNA extraction
reverse transcription system Promega A3500 RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001 RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit Cells Biolabs, Inc. CBA-302  alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEv Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) cell strain of mouse ES cells
microscope Zeiss LSM510 cells observation
GraphPad Prism 5.0 GraphPad Prism Software Inc. 5.0 statistical analysis

References

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  2. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).
  3. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  5. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).
  6. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
  7. Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. Plos One. 8 (12), e81156 (2013).
  8. Yamaji, M. PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).
  9. Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).
  10. Smith, Z. D., et al. A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo. Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).
  11. Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell. 115 (3), 281-292 (2003).
  12. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  13. Leitch, H. G., et al. Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).
  14. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
  15. Yin, R., et al. Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals. J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).
  16. Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells. Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171 (2017).
  17. Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).
  18. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  19. Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).
  20. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
  21. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
  22. Maiti, A., Drohat, A. C. Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites. J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).
  23. Habibi, E., et al. Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).
  24. von Meyenn, F., et al. Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells. Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).
  25. Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells. Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).
  26. Hackett, J. A., et al. Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency. Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).
  27. Nakaki, F., Saitou, M. PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming. Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).
  28. Nichols, J., Smith, A. Pluripotency in the embryo and in culture. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).

Play Video

Cite This Article
Li, C., Lai, W., Wang, H. An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C. J. Vis. Exp. (136), e56391, doi:10.3791/56391 (2018).

View Video