Summary

En alternativ kultur metode til at opretholde genomisk Hypomethylation af mus embryonale stamceller ved hjælp af MEK hæmmer PD0325901 og C-Vitamin

Published: June 01, 2018
doi:

Summary

Vi beskrev i detaljer to kemiske-baserede protokoller for dyrkning mus embryonale stamceller. Denne nye metode udnytter synergistisk mekanismer til at fremme Tet-medierede oxidation (af C-vitamin) og undertrykke de novo syntesen af 5-methylcytosine (af PD0325901) for at opretholde DNA hypomethylation og pluripotency mus embryonale stamceller.

Abstract

Embryonale stamceller (ES) har potentiale til at differentiere i nogen af de tre Kim lag (endoderm, mesoderm eller ectoderm), og kan generere mange lineages for regenerativ medicin. ES celle kultur i vitro har længe været genstand for udbredt bekymring. Klassisk, mus ES celler bevares i serum og leukæmi hæmmende faktor (LIF)-indeholdende medium. Dog under serum/LIF betingelser, celler Vis heterogenitet i morfologi og profilen udtryk pluripotency-relaterede gener, og er for det meste i en metastabile tilstand. Desuden kulturperler ES-celler udstille globale hypermethylation, men naiv ES cellerne i den indre cellemasse (ICM) og primordiale kønsceller (PGCs) er i en tilstand af globale hypomethylation. Tilstanden hypomethylated af ICM og PGCs er tæt forbundet med deres pluripotency. For at forbedre mus ES celle kultur metoder, har vi for nylig udviklet en ny metode baseret på selektivt kombineret udnyttelse af to små-molekyle forbindelser til at opretholde den DNA hypomethylated og pluripotente tilstand. Her præsenterer vi at fælles behandling af C-vitamin (Vc) og PD0325901 kan slette omkring 90% af 5-methylcytosine (5mC) på 5 dage i mus ES-celler. Genererede 5mC indhold kan sammenlignes i PGCer. Den mekanistiske undersøgelse viser, at PD0325901 op-regulerer Prdm14 udtryk for at undertrykke Dnmt3b (de novo DNA methyltransferase) og Dnmt3l (cofaktor for Dnmt3b), ved at reducere de novo 5mC syntese. VC letter konvertering af 5mC til 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) katalyseret hovedsagelig af Tet1 og Tet2, der angiver inddragelse af både passive og aktive DNA demethylations. Desuden under Vc/PD0325901 betingelser Vis mus ES celler homogene morfologi og pluripotente stat. Kollektivt, foreslår vi en roman og kemisk-synergy kultur metode til at opnå DNA hypomethylation og vedligeholdelse af pluripotency i mus ES celler. Små-molekyle kemisk-dependent metode overvinder serum kultur og holder løfte om at generere homogene ES-celler for yderligere kliniske applikationer og forsker store mangler.

Introduction

ES-celler stammede fra ICM af en blastocyst1. Cellerne er i tilstanden pluripotency og kan danne alle somatiske lineages og kønscelleoverførsel celler2. Oprettelsen af ES-celler giver mulighed for at undersøge udviklingen processer in vitro- og kan generere celler af medicinsk relevans for regenerativ medicin baseret på deres pluripotency3.

To grupper Ecrd etablerede cellelinier mus ES i 1981 og når celler, der stammer fra den tidlige mus Foster var kulturperler i føtal bovint serum (FBS)-indeholdende medium med musen embryonale fibroblaster (MEFs) som feeder lag1,4 . MEFs var inaktiveret mitotically og blev præ dyrket i retter inden dyrkning af ES-celler. MEFs yder støtte til musen ES celle attachment og producere vækstfaktorer for at fremme udbredelse og undertrykke differentiering5, mens FBS tilbyder væsentlige trofiske faktorer og hormoner for celledelingen. Efterfølgende undersøgelser viste, at LIF produceret af feeder celler var den centrale cytokin til selvfornyelse og vedligeholdelse af pluripotency i mus ES-celler og tilsætning af LIF i medium kunne erstatte feeder celler6. I øjeblikket, er opretholdelse af musen ES-celler i FBS/LIF medium på foderautomater stadig standard metode vedtaget af mange forskere. Imidlertid opstår nogle problemer med denne klassiske kultur tilgang. For det første feeder celler udskiller overskydende og ukontrolleret faktorer og kan forårsage sygdomsfremkaldende forurening7. At undgå denne indblanding, belægning overfladen af retter med gelatine og tilsætning af LIF i serum, der indeholder mediet er alternative metoder til at opretholde mus ES celler uden feeder-lag celler. Derudover udviser mus ES celler dyrkes serum/LIF betingelser morfologiske heterogenitet i cellepopulationer og endda i niveauet udtryk pluripotency-relaterede faktorer8. Nylige undersøgelser tyder på, at serum/LIF betingelser pluripotency-relaterede core transskriptionsfaktorer (herunder SOX2, Nanog og OCT4) kan opretholde pluripotency gennem LIF og WNT signalering; dog især aktivere de også en fibroblast vækstfaktor (FGF) signal til at udløse differentiering8. På grund af den ambivalent dual action af transkriptionsfaktorer core præsentere mus ES celler dyrkes i serum heterogenitet, bestående af to udskiftelige populationer, en lignende til ICM og en anden der ligner PRIMES epiblast stat8. Derudover mus ES celler i serum udviser ofte en global hypermethylation9, ICM og PGCs er i en global hypomethylated stat, som er tæt forbundet med deres pluripotency9,10.

Der er en betydelig efterspørgsel til at udvikle nye metoder til dyrkning mus ES celler. Flere forbedrede protokoller har været etableret siden 200311 men der fortsat er visse begrænsninger og mangler7. Siden 2008, den kombinerede udnyttelse af to små-molekyle kinase hæmmere, PD0325901 (hæmmer af mitogen-aktiveret protein kinase (MAPK) / ekstracellulær signal-reguleret kinase (ERK) (MEK)) og CHIR99021 (hæmmer af glykogen syntase kinase 3 (GSK3)), i N2B27 medium med LIF og uden serum har åbnet nye perspektiver for dyrkningsbaserede mus ES-celler12. Denne nye definerede medium er karakteriseret ved brugen af to hæmmere (2i). Musen ES celler dyrkes i 2i/LIF medium er mere homogen cellepopulationer og udtryk pluripotency faktorer. 2i/LIF-kulturperler mus ES celler udviser desuden DNA hypomethylation globalt, som er tættere på ICM-lignende celler9,13. Selv så, har 2i kultur sine ulemper. PD0325901 og CHIR99021 er uopløseligt i vand, og generelt er opløst i dimethylsulfoxid (DMSO)-baserede stock løsning for at tilføje dem i dyrkningsmediet. Undersøgelser har vist, at langvarig og lavdosis udsættelse af celler for DMSO kan føre til cytotoksicitet14.

Her, vi udnyttede to små-molekyle forbindelser og udviklet en ny kultur metode af musen ES celler. Roman kultur metoden kombinerer Vc og MEK hæmmer PD0325901 for at fremme DNA hypomethylation hurtigt og til en sammenlignelig PGC, benævnt effektivt nemlig Vc/PD0325901 dyrkningsbaserede protokol. Musen ES-celler i Vc/PD0325901-tilføjet serum-holdige medium udstille homogenitet i morfologi og er påført i en grundtilstand. I forhold til 2i kultur, mus ES celler kulturperler Vc/PD0325901 betingelser udviser hurtigere kinetik af DNA demetylering og kan nå det hypomethylation niveau sammenlignes med PGC. Desuden brug af en enkelt hæmmer (PD0325901) nedsætter input mængden af DMSO i medium i forhold til, bruges i 2i (PD0325901/CHIR99021) og reducerer skader på celler.

Protocol

1. præparater Forberede en opløsning af 1.0 mM PD0325901 (MEK hæmmer) og 3,0 mM CHIR99021 (GSK3-hæmmer). 2 mg af PD0325901 afvejes og tilføje 4,15 mL af DMSO i en rav hætteglasset. 2 mg af CHIR99021 afvejes og tilføje 1,43 mL af DMSO i en rav hætteglasset. Følgende rekonstitution, gemme delprøver (50 µL/rør i 200 µL PCR rør) ved-20 ° C og beskyttet mod lys. Fjerne et rør, der indeholder den frosne lager fra en fryser og tø ved stuetemperatur fø…

Representative Results

VC/PD0325901 induceret synergistisk globale sletning af musen ES-celler. Musen ES-celler i serum udviser DNA hypermethylation, mens pluripotente ICM celler og PGCs vise global sletning af DNA methylering og hypomethylated staten er tæt forbundet med deres pluripotency9,10. Tidligere, vi og andre konstateret, at Vc kan forbedre Tet-medieret 5mC demetylering<sup class="xr…

Discussion

I arbejdet viste vi en roman metode kombinerer Vc og PD0325901 for at opretholde mus ES celler på en udifferentierede og hypomethylated tilstand, som blev opnået ved en synergistiske virkning af at fremme DNA demetylering af Vc og undertrykke de novo DNA methylering af PD0325901. Derudover mus ES celler viste stor morfologi under Vc/PD0325901 kultur system.

For at opretholde bedre tilstand af musen ES celler i Vc/PD0325901 kultur system, er der nogle afgørende skridt. For det førs…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (21435008 og 21327006 til H.W.), og den strategiske prioritet Research Program af den kinesiske Academy of Sciences (XDB14030200 til H.W.).

Materials

fetal bovine serum Australia source Corning 35-076-CV Component of mouse ES cell medium
DMEM/high glucose Hyclone SH30022 Component of mouse ES cell medium
LIF Millipore ESG1107 Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140050 Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvate Gibco 11360070 Component of mouse ES cell medium
L-glutamine Gibco 25030081 Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solution Gibco 15140122 Component of mouse ES cell medium
PBS Sigma P5493 Cells rinse
trypsin Hyclone SH30042 Cell dissociation
gelatin Sigma 48722 Dishes coating
PD0325901 Stemolecule 04-0006-10 small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021 Stemolecule 04-0004 small-molecule chemical for cell culture
vitamin C Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd  XW00508171 small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemr Purelab Ultra Ultra water
DMSO Sigma D8418 Cell freezing medium
centrifuger Eppendorf 5427R DNA and protein extraction
protease inhibitor cocktail Sigma P8340 Component of RIPA buffer
PMSF Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 36978 Component of RIPA buffer
DTT Sigma 43815 Component of RIPA buffer
EGTA Sigma E3889 Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit  Promega A1125 Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000 ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000 Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphatase New England Biolabs M0290 DNA digestion
DNase I New England Biolabs M0303 DNA digestion
snake venom phosphodiesterase I Sigma P4506 DNA digestion
Nanosep 3K Omega Pall OD003C35 filtration of digested DNA
1290 UHPLC system Agilent  1290 UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometer Agilent  G6410B MS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 column Agilent  Zorbax Eclipse Plus colume for UHPLC separation
5-methylcytosine Solarbio Life Sciences SM8900  standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard) Toronto Research Chemicals M295900 standard 5hmC
Prdm14 antibody bioworld BS7634 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibody bioworld BS6587 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibody abcam ab13604 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibody abcam ab3493 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibody abcam ab13537 Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibody bioworld BS1482MH Western blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgG abcam ab6721 Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgG abcam ab6789 Western blot analysis-secondary antibody
Trizol Invitrogen 15596-026 RNA extraction
reverse transcription system Promega A3500 RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001 RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit Cells Biolabs, Inc. CBA-302  alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEv Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) cell strain of mouse ES cells
microscope Zeiss LSM510 cells observation
GraphPad Prism 5.0 GraphPad Prism Software Inc. 5.0 statistical analysis

References

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  2. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).
  3. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  5. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).
  6. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
  7. Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. Plos One. 8 (12), e81156 (2013).
  8. Yamaji, M. PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).
  9. Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).
  10. Smith, Z. D., et al. A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo. Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).
  11. Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell. 115 (3), 281-292 (2003).
  12. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  13. Leitch, H. G., et al. Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).
  14. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
  15. Yin, R., et al. Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals. J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).
  16. Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells. Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171 (2017).
  17. Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).
  18. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  19. Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).
  20. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
  21. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
  22. Maiti, A., Drohat, A. C. Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites. J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).
  23. Habibi, E., et al. Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).
  24. von Meyenn, F., et al. Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells. Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).
  25. Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells. Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).
  26. Hackett, J. A., et al. Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency. Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).
  27. Nakaki, F., Saitou, M. PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming. Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).
  28. Nichols, J., Smith, A. Pluripotency in the embryo and in culture. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).

Play Video

Cite This Article
Li, C., Lai, W., Wang, H. An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C. J. Vis. Exp. (136), e56391, doi:10.3791/56391 (2018).

View Video