En alternativ kultur metode å opprettholde Genomic Hypomethylation av mus embryonale stamceller MEK hemmer PD0325901 og Vitamin C
Summary
Vi beskrevet nærmere to kjemisk-baserte protokoller for dyrking mus embryonale stamceller. Denne nye metoden benytter synergistisk mekanismer for å fremme Tet-mediert oksidasjon (av vitamin C) og repressing de novo syntese av 5-methylcytosine (av PD0325901) for å opprettholde DNA hypomethylation og pluripotency av mus embryonale stamceller.
Abstract
Embryonale stamceller (ES) har potensial til å skille ut noen av de tre bakterie lag (endoderm, mesoderm eller ektoderm), og kan generere mange linjene for regenerativ medisin. ES celle kultur i vitro har lenge vært gjenstand for omfattende bekymringer. Klassisk, musen ES celler blir vedlikeholdt i serum og leukemi hemmende faktor (LIF)-som inneholder mediet. Men under serum/LIF forhold, celler Vis heterogenitet morfologi og profilen for expression av pluripotency-relaterte gener, og det meste i en metastable tilstand. Videre kulturperler ES celler viser globale hypermethylation, men naiv ES celler av indre cellemasse (ICM) og primordial bakterie celler (PGCs) er i en tilstand av globale hypomethylation. Hypomethylated staten ICM og PGCs er nært forbundet med deres pluripotency. For å forbedre musen ES celle kultur metoder, har vi nylig utviklet en ny metode basert på selektivt kombinert utnyttelse av to små molekyl forbindelser å vedlikeholde DNA hypomethylated og pluripotent statusen. Her presenterer vi som co behandling vitamin c (Vc) og PD0325901 kan slette ca 90% av 5-methylcytosine (5mC) 5 dager i musen ES celler. Generert 5mC innholdet er sammenlignbar med i PGCs. Mekanistisk undersøkelsen viser at PD0325901 opp regulerer Prdm14 uttrykk for å undertrykke Dnmt3b (de novo DNA methyltransferase) og Dnmt3l (kofaktor av Dnmt3b), ved å redusere de novo 5mC syntese. VC forenkler konvertering av 5mC til 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) katalysert hovedsakelig av Tet1 og Tet2, som indikerer involvering av både passive og aktive DNA demethylations. Videre under Vc/PD0325901 forhold Vis musen ES celler homogen morfologi og pluripotent tilstand. Kollektivt, foreslår vi en roman og kjemisk-synergy kultur metode for å oppnå DNA hypomethylation og vedlikehold av pluripotency i musen ES celler. Små molekyl kjemisk-avhengige metoden overvinner de store manglene av serum kultur og holder løftet om å generere homogen ES celler for ytterligere kliniske applikasjoner og undersøkelser.
Introduction
ES celler er stammer fra ICM av blastocysten1. Cellene i en pluripotency tilstand og kan danne alle somatiske linjene og germline celler2. Etablering av ES celler gir muligheten til å undersøke utvikling prosesser i vitro og kan generere celler medisinsk relevansen for regenerativ medisin basert på deres pluripotency3.
To grupper seminally etablert musen ES cellelinjer i 1981 og når cellene stammer fra tidlig musen embryoet ble kultivert i fosterets bovin serum (FBS)-inneholder medium med mus embryonale fibroblaster (MEFs) som mater lag1,4 . MEFs ble deaktivert mitotically og ble pre dyrket i retter før dyrking ES celler. MEFs gir støtte for mus ES celle vedlegg og produsere vekstfaktorer for å fremme forplantning og undertrykke differensiering5, mens FBS tilbyr viktige trophic faktorer og hormonene celle spredning. Studier viste at LIF produsert av materen celler var viktige cytokin for selvtillit fornyelse og vedlikehold av pluripotency i musen ES celler og tillegg av LIF til medium kan erstatte mater celler6. Foreløpig er opprettholdelse av musen ES celler i FBS/LIF medium på matere fortsatt standard metode vedtatt av mange forskere. Men oppstår enkelte problemer med denne klassiske kultur. Først mater celler skiller overflødig og ukontrollert faktorer og kan forårsake patogene forurensning7. Å unngå denne forstyrrelser, belegg overflaten av retter med gelatin og tillegg av LIF i serum inneholder medium er alternative metoder for å vedlikeholde musen ES celler uten mater lag celler. I tillegg utstilling musen ES celler dyrket under serum/LIF forhold morfologiske heterogenitet i celle populasjoner og selv i hvilket uttrykk pluripotency-relaterte faktorer8. Nyere studier tyder på at serum/LIF tilfeller pluripotency-relaterte kjernen transkripsjonsfaktorer (inkludert SOX2, Nanog og OCT4) kan opprettholde pluripotency gjennom LIF og WNT signalering; imidlertid spesielt, aktivere de også en fibroblast vekst faktor (FGF) signal utløse differensiering8. Grunn ambivalent dobbelt handlingen av kjernen transkripsjonsfaktorer presentere musen ES celler dyrket i serum heterogenitet, bestående av to utskiftbare befolkninger, en lignende ICM og en annen som ligner primet epiblast staten8. Videre viser musen ES celler i serum ofte globale hypermethylation9, mens ICM og PGCs er i en global hypomethylated tilstand, som er nært forbundet med deres pluripotency9,10.
Det er et betydelig behov å utvikle nye metoder for dyrking musen ES celler. Flere forbedret protokoller har vært etablert siden 200311 men det fortsetter å være noen begrensninger og mangler7. Siden 2008, kombinert utnyttelse av to små molekyl kinase hemmere, PD0325901 (inhibitor av mitogen-aktivert protein kinase (MAPK) / ekstracellulære signal-regulert kinase (ERK) (MEK)) og CHIR99021 (inhibitor av glykogen syntase kinase 3 (GSK3)), i N2B27 medium med LIF og uten serum har åpnet nye perspektiver for dyrking musen ES celler12. Dette nye definerte mediet er preget av bruk av to hemmere (2i). Mus ES celler kultivert 2i/LIF medium er mer homogen i celle populasjoner og uttrykk for pluripotency faktorer. 2i/LIF-kulturperler musen ES celler utstilling i tillegg DNA hypomethylation globalt, som er nærmere ICM-lignende celler9,13. Likevel har 2i kultur sine ulemper. PD0325901 og CHIR99021 er uløselig i vann generelt er oppløst i dimethyl sulfoxide (DMSO)-basert lager løsning for å legge dem i kultur medium. Studier har vist at langsiktige og lav dose eksponering for celler DMSO kan føre til cytotoksisitet14.
Her vi benyttet to små molekyl forbindelser og utviklet en ny kultur metode for musen ES celler. Metoden romanen kultur kombinerer Vc og MEK hemmer PD0325901 for å fremme DNA hypomethylation raskt og til et tilsvarende nivå for PGC, benevnt effektivt idet Vc/PD0325901 culturing protokollen. Mus ES celler i Vc/PD0325901-lagt serum inneholder medium exhibit homogenitet i morfologi og opprettholdes i bakken tilstand. Sammenlignet med 2i kultur, musen ES celler kultivert vilkår Vc/PD0325901 exhibit raskere kinetics av DNA demethylation og kan nå hypomethylation nivå sammenlignes med PGC. Dessuten, bruk av en enkelt hemmer (PD0325901) reduserer input mengden DMSO til medium i forhold som brukes i 2i (PD0325901/CHIR99021) og reduserer skader celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
I arbeidet viste vi en ny metode for å kombinere Vc og PD0325901 for å opprettholde musen ES celler ved en udifferensierte og hypomethylated stat, som ble nådd synergistiske handling for å fremme DNA demethylation av Vc og undertrykke de novo DNA metylering av PD0325901. Videre viste musen ES celler stor morfologi under Vc/PD0325901 kultur-systemet.
For å bedre opprettholde staten musen ES celler i Vc/PD0325901 kultur systemet, finnes det noen viktige trinn. Først må FBS gruppe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation av Kina (21435008 og 21327006 til HW) og strategiske prioritet forskningsprogrammet av det kinesiske vitenskapsakademi (XDB14030200 til HW).
Materials
| fetal bovine serum Australia source | Corning | 35-076-CV | Component of mouse ES cell medium |
| DMEM/high glucose | Hyclone | SH30022 | Component of mouse ES cell medium |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Component of mouse ES cell medium |
| non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140050 | Component of mouse ES cell medium |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Component of mouse ES cell medium |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | Component of mouse ES cell medium |
| penicillin streptomycin solution | Gibco | 15140122 | Component of mouse ES cell medium |
| PBS | Sigma | P5493 | Cells rinse |
| trypsin | Hyclone | SH30042 | Cell dissociation |
| gelatin | Sigma | 48722 | Dishes coating |
| PD0325901 | Stemolecule | 04-0006-10 | small-molecule chemical for cell culture |
| CHIR99021 | Stemolecule | 04-0004 | small-molecule chemical for cell culture |
| vitamin C | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | XW00508171 | small-molecule chemical for cell culture |
| Ultra Bioscience water purification systemr | Purelab | Ultra | Ultra water |
| DMSO | Sigma | D8418 | Cell freezing medium |
| centrifuger | Eppendorf | 5427R | DNA and protein extraction |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | Component of RIPA buffer |
| PMSF Protease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 36978 | Component of RIPA buffer |
| DTT | Sigma | 43815 | Component of RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E3889 | Component of RIPA buffer |
| Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 | Genomic DNA extraction |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | NanoDrop 2000 | Determination of DNA concentration |
| calf intestinal phosphatase | New England Biolabs | M0290 | DNA digestion |
| DNase I | New England Biolabs | M0303 | DNA digestion |
| snake venom phosphodiesterase I | Sigma | P4506 | DNA digestion |
| Nanosep 3K Omega | Pall | OD003C35 | filtration of digested DNA |
| 1290 UHPLC system | Agilent | 1290 | UHPLC separation |
| G6410B triple quadrupole mass spectrometer | Agilent | G6410B | MS/MS analysis |
| Zorbax Eclipse Plus C18 column | Agilent | Zorbax Eclipse Plus | colume for UHPLC separation |
| 5-methylcytosine | Solarbio Life Sciences | SM8900 | standard 5mC |
| 5-hydroxymethylcytosine (standard) | Toronto Research Chemicals | M295900 | standard 5hmC |
| Prdm14 antibody | bioworld | BS7634 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3a antibody | bioworld | BS6587 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3b antibody | abcam | ab13604 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3l antibody | abcam | ab3493 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt1 antibody | abcam | ab13537 | Western blot analysis-primary antibody |
| β-tubulin antibody | bioworld | BS1482MH | Western blot analysis-primary antibody |
| goat anti-rabbit IgG | abcam | ab6721 | Western blot analysis-secondary antibody |
| goat anti-mouse IgG | abcam | ab6789 | Western blot analysis-secondary antibody |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA extraction |
| reverse transcription system | Promega | A3500 | RNA reverse transcription |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | RT-PCR |
| StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit | Cells Biolabs, Inc. | CBA-302 | alkaline phosphatase staining analysis |
| mouse ES cells: WT, 129 SvEv | Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) | cell strain of mouse ES cells | |
| microscope | Zeiss | LSM510 | cells observation |
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad Prism Software Inc. | 5.0 | statistical analysis |
References
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
- Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. Plos One. 8 (12), e81156 (2013).
- Yamaji, M. PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).
- Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).
- Smith, Z. D., et al. A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo. Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).
- Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell. 115 (3), 281-292 (2003).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Leitch, H. G., et al. Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).
- Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
- Yin, R., et al. Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals. J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).
- Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells. Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171 (2017).
- Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
- Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).
- Inoue, A., Zhang, Y. Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
- Maiti, A., Drohat, A. C. Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites. J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).
- Habibi, E., et al. Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).
- von Meyenn, F., et al. Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells. Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).
- Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells. Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).
- Hackett, J. A., et al. Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency. Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).
- Nakaki, F., Saitou, M. PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming. Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).
- Nichols, J., Smith, A. Pluripotency in the embryo and in culture. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).
