Um método alternativo de cultura para manter Hypomethylation genômico das células-tronco embrionárias Mouse usando MEK inibidor PD0325901 e vitamina C
Summary
Descrevemos em detalhes dois protocolos de base química para cultivo de células-tronco embrionárias do mouse. Esse novo método utiliza mecanismos sinérgicos de promover oxidação mediada por Tet (vitamina C) e reprimindo a síntese de novo de 5-metilcitosina (por PD0325901) para manter o DNA hypomethylation e pluripotência das células-tronco embrionárias do mouse.
Abstract
Células-tronco embrionárias (ES) têm o potencial de se diferenciar em qualquer uma das três camadas germinativas (ectoderma, mesoderma ou endoderme) e podem gerar muitas linhagens para medicina regenerativa. ES célula cultura em vitro tem sido objecto de preocupação generalizada. Classicamente, pilhas do rato ES são mantidas no fator inibitório de soro e leucemia (LIF)-contendo meio. No entanto, sob condições de soro/LIF, células mostram heterogeneidade na morfologia e o perfil de expressão de genes relacionados ao pluripotência e estão principalmente em um estado metaestável. Além disso, células cultivadas de ES exibem hypermethylation global, mas células de ES ingênua da massa celular interna (ICM) e as células germinativas primordiais (PGCs) estão em um estado de hypomethylation global. O estado de hypomethylated do ICM e PGCs está intimamente associado com sua pluripotência. Para melhorar os métodos de cultura de células de rato ES, recentemente foi desenvolvido um novo método baseado na utilização seletivamente combinada de dois compostos da pequeno-molécula para manter o estado de hypomethylated e pluripotentes de DNA. Aqui, apresentamos que co tratamento da vitamina C (Vc), e a PD0325901 podem apagar cerca de 90% de 5-metilcitosina (5mC) em 5 dias em pilhas do ES do rato. O conteúdo gerado 5mC é comparável em PGCs. A investigação mecanicista mostra que PD0325901 acima-regula a expressão Prdm14 para suprimir Dnmt3b (de novo DNA metiltransferase) e Dnmt3l (o cofator de Dnmt3b), reduzindo a síntese de novo de 5mC. Vc facilita a conversão de 5mC 5-Hidroximetilcitosina (5hmC) catalisada principalmente por Tet1 e Tet2, indicando o envolvimento de demethylations de DNA passivas e ativas. Além disso, em condições de Vc/PD0325901, pilhas do ES do rato mostram morfologia homogênea e estado pluripotentes. Coletivamente, propomos um método de cultura química-sinergia para alcançar o DNA hypomethylation e manutenção da pluripotência em células de rato ES e romance. O pequeno-molécula dependente químico método supera as principais deficiências da cultura de soro e a promessa de porões para gerar células homogêneas de ES para novas aplicações clínicas e pesquisas.
Introduction
Pilhas do ES são originadas do ICM de um blastocisto1. As células estão em um estado de pluripotência e podem formar todas as linhagens somáticas e de células da linha germinal2. Estabelecimento de células ES fornece a oportunidade de investigar o desenvolvimento processa-se em vitro e pode gerar células de relevância médica para medicina regenerativa, com base na sua pluripotência3.
Dois grupos seminally estabeleceram as linhas de células de rato ES em 1981 e em células derivadas do embrião de rato foram cultivadas em soro fetal bovino (FBS)-contendo meio com fibroblastos embrionários de rato (MEFs) como o alimentador camada1,4 . MEFs foram inactivados mitotically e pre-foram cultivadas em pratos antes de cultivo de células ES. MEFs fornecem suporte para fixação de células de rato ES e produzir fatores de crescimento para promover a propagação e reprimir a diferenciação5, enquanto FBS oferece essenciais fatores tróficos e hormônios para proliferação celular. Estudos posteriores indicaram que LIF produzido pelas células do alimentador foi o cytokine chave para autorenovação e manutenção da pluripotência em células de rato ES, pode substituir a adição de LIF no meio de alimentador células6. Atualmente, a sustentação do rato de pilhas do ES no meio de FBS/LIF em alimentadores ainda é o método padrão adotado por muitos pesquisadores. No entanto, alguns problemas surgem com esta abordagem da cultura clássica. Em primeiro lugar, alimentador células secretam fatores excessiva e descontroladas… e podem causar contaminação patogénica7. Para evitar esta interferência, revestir a superfície dos pratos com gelatina e a adição de LIF em soro contendo médio são métodos alternativos para a manutenção de células de rato ES sem células alimentador-camada. Além disso, células de rato ES cultivadas sob condições de soro/LIF apresentam heterogeneidade morfológica em populações de células e mesmo no nível de expressão de fatores relacionados a pluripotência8. Estudos recentes sugerem que, em condições de soro/LIF, os fatores de transcrição do núcleo pluripotência relacionados (incluindo OCT4, SOX2 e Nanog) podem sustentar a pluripotência através de LIF e WNT sinalização; no entanto, nomeadamente, eles também ativar um sinal de (FGF) do fator de crescimento fibroblástico para desencadear a diferenciação8. Devido à ação dupla ambivalente os núcleo de factores de transcrição, o rato ES células cultivadas no soro apresentam heterogeneidade, consistindo de duas populações intercambiáveis, um semelhante ao ICM e outro parecido com o epiblasto aprontada estado8. Além disso, as células de rato ES no soro muitas vezes apresentam hypermethylation global9, Considerando que ICM e PGCs estão em um estado de hypomethylated global, que está intimamente ligado com sua pluripotência9,10.
Há uma demanda considerável para desenvolver novos métodos de cultivo de células de rato ES. Foram estabelecidos vários protocolos melhorados desde 200311 mas continua a haver algumas limitações e deficiências7. Desde 2008, a utilização combinada de dois inibidores da quinase da pequeno-molécula, PD0325901 (inibidor de quinase da proteína mitogen-ativado (MAPK) / extracelular-sinal-regulada quinase (ERK) (MEK)) e CHIR99021 (inibidor de glicogénio sintase quinase 3 (GSK3)), em N2B27 médio com LIF e sem soro, abriu novas perspectivas para células de rato cultivo ES12. Este novo meio definido é caracterizado pelo uso de dois inibidores (2i). ES de mouse células cultivadas em meio de 2i/LIF são mais homogêneas em populações de células e a expressão de fatores de pluripotência. Além disso, pilhas do rato 2i/LIF-cultivadas ES apresentam DNA hypomethylation globalmente, que está mais perto de células ICM9,13. Mesmo assim, a cultura de 2i tem suas desvantagens. PD0325901 e CHIR99021 são insolúveis em água e geralmente dissolvem-se em dimetilsulfóxido (DMSO)-com base em solução para adicioná-los em meio de cultura. Estudos mostram que a longo prazo e baixa dose de exposição das células ao DMSO pode levar a citotoxicidade14.
Aqui, utilizamos dois compostos da pequeno-molécula e desenvolveu um novo método de cultura de células de rato ES. O método de cultura novela combina Vc e MEK inibidor PD0325901 para promover o DNA hypomethylation rapidamente e eficazmente a um nível comparável de PGC, nomeado como o protocolo de cultivo Vc/PD0325901. Pilhas do mouse ES em Vc/PD0325901-adicionado meio contendo soro apresentam homogeneidade na morfologia e são sustentadas em um estado fundamental. Comparado a cultura 2i, cultivadas sob condições de Vc/PD0325901 de pilhas do rato ES exibem cinética mais rápida da demetilação do ADN e podem atingir o nível de hypomethylation comparável do PGC. Além disso, o uso de um único inibidor (PD0325901) diminui a entrada quantidade de DMSO em média em comparação com que usado em 2i (PD0325901/CHIR99021) e reduz os danos às células.
Protocol
Representative Results
Discussion
No trabalho, temos demonstrado um novo método de combinar Vc e PD0325901 para sustentar as células de rato ES em um estado indiferenciado e hypomethylated, que foi alcançado por uma ação sinérgica de promover demetilação do ADN por Vc e suprimindo de novo DNA metilação de PD0325901. Além disso, as células ES do rato mostraram grande morfologia sob o sistema de cultura Vc/PD0325901.
Para melhor sustentar o estado das pilhas do rato ES no sistema de cultura Vc/PD0325901, exi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Nacional Natural Science Foundation da China (21435008 e 21327006 de h. w) e o programa de pesquisa de prioridade estratégica da Academia Chinesa de Ciências (XDB14030200 de H.W.).
Materials
| fetal bovine serum Australia source | Corning | 35-076-CV | Component of mouse ES cell medium |
| DMEM/high glucose | Hyclone | SH30022 | Component of mouse ES cell medium |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Component of mouse ES cell medium |
| non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140050 | Component of mouse ES cell medium |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Component of mouse ES cell medium |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | Component of mouse ES cell medium |
| penicillin streptomycin solution | Gibco | 15140122 | Component of mouse ES cell medium |
| PBS | Sigma | P5493 | Cells rinse |
| trypsin | Hyclone | SH30042 | Cell dissociation |
| gelatin | Sigma | 48722 | Dishes coating |
| PD0325901 | Stemolecule | 04-0006-10 | small-molecule chemical for cell culture |
| CHIR99021 | Stemolecule | 04-0004 | small-molecule chemical for cell culture |
| vitamin C | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | XW00508171 | small-molecule chemical for cell culture |
| Ultra Bioscience water purification systemr | Purelab | Ultra | Ultra water |
| DMSO | Sigma | D8418 | Cell freezing medium |
| centrifuger | Eppendorf | 5427R | DNA and protein extraction |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | Component of RIPA buffer |
| PMSF Protease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 36978 | Component of RIPA buffer |
| DTT | Sigma | 43815 | Component of RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E3889 | Component of RIPA buffer |
| Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 | Genomic DNA extraction |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | NanoDrop 2000 | Determination of DNA concentration |
| calf intestinal phosphatase | New England Biolabs | M0290 | DNA digestion |
| DNase I | New England Biolabs | M0303 | DNA digestion |
| snake venom phosphodiesterase I | Sigma | P4506 | DNA digestion |
| Nanosep 3K Omega | Pall | OD003C35 | filtration of digested DNA |
| 1290 UHPLC system | Agilent | 1290 | UHPLC separation |
| G6410B triple quadrupole mass spectrometer | Agilent | G6410B | MS/MS analysis |
| Zorbax Eclipse Plus C18 column | Agilent | Zorbax Eclipse Plus | colume for UHPLC separation |
| 5-methylcytosine | Solarbio Life Sciences | SM8900 | standard 5mC |
| 5-hydroxymethylcytosine (standard) | Toronto Research Chemicals | M295900 | standard 5hmC |
| Prdm14 antibody | bioworld | BS7634 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3a antibody | bioworld | BS6587 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3b antibody | abcam | ab13604 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3l antibody | abcam | ab3493 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt1 antibody | abcam | ab13537 | Western blot analysis-primary antibody |
| β-tubulin antibody | bioworld | BS1482MH | Western blot analysis-primary antibody |
| goat anti-rabbit IgG | abcam | ab6721 | Western blot analysis-secondary antibody |
| goat anti-mouse IgG | abcam | ab6789 | Western blot analysis-secondary antibody |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA extraction |
| reverse transcription system | Promega | A3500 | RNA reverse transcription |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | RT-PCR |
| StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit | Cells Biolabs, Inc. | CBA-302 | alkaline phosphatase staining analysis |
| mouse ES cells: WT, 129 SvEv | Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) | cell strain of mouse ES cells | |
| microscope | Zeiss | LSM510 | cells observation |
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad Prism Software Inc. | 5.0 | statistical analysis |
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