En alternativ kultur-metod för att bibehålla genomisk hypometylering av mus embryonala stamceller med MEK-hämmare PD0325901 och Vitamin C
Summary
Vi beskrivs i detalj två kemisk-baserat protokoll för odling mus embryonala stamceller. Denna nya metod använder tredjeparts samverkande mekanismer för att främja Tet-medierad oxidation (av C-vitamin) och undertrycka de novo syntesen av 5-metylcytosin (av PD0325901) för att upprätthålla DNA hypometylering och pluripotency mus embryonala stamceller.
Abstract
Embryonala stamceller (ES) har potential att differentieras till någon av de tre groddar skikt (endoderm, mesoderm och ektoderm) och kan generera många härstamningar för regenerativ medicin. ES cell kultur in vitro- har länge varit föremål för omfattande oro. Klassiskt, mus ES celler upprätthålls i serum och leukemi hämmande faktor (LIF)-innehållande medium. Dock villkor som serum/LIF, celler Visa heterogenitet i morfologi och uttryck profilen för pluripotens-relaterade gener, och är oftast i ett metastabilt tillstånd. Dessutom odlade ES-celler uppvisar globala hypermethylation, men naiv ES-celler av inre cellmassan (ICM) och primordiala könsceller (PGCs) är i ett tillstånd av globala hypometylering. Tillståndet hypometylering av ICM och PGCs är nära förknippad med deras pluripotency. För att förbättra mus ES cell kultur metoder, har vi nyligen utvecklat en ny metod baserad på selektivt kombinerade utilizationen av två småmolekylär föreningar att DNA hypometylering och pluripotenta tillståndet. Här presenterar vi som samtidig behandling av C-vitamin (Vc) och PD0325901 kan ta bort ca 90% av 5-metylcytosin (5mC) på 5 dagar på mus ES-celler. Genererade 5mC innehållet är jämförbar med den hos PGCs. Den mekanistiska utredningen visar att PD0325901 upp-reglerar Prdm14 uttryck för att undertrycka Dnmt3b (de novo DNA methyltransferase) och Dnmt3l (kofaktor av Dnmt3b), genom att minska de novo 5mC syntes. VC underlättar konvertering av 5mC till 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) katalyseras huvudsakligen av Tet1 och Tet2, som anger medverkan av både passiva och aktiva DNA demetylering. Mus ES-celler visar dessutom på Vc/PD0325901 villkor, homogen morfologi och pluripotenta stat. Sammantaget föreslår vi en roman och kemiska-synergy kultur metod för att uppnå DNA hypometylering och underhåll av pluripotency i mus ES-celler. Metoden småmolekylär kemikalie-beroende övervinner de stora bristerna i serum kultur och håller löftet att generera homogen ES-celler för ytterligare kliniska tillämpningar och forskningar.
Introduction
ES-celler har sitt ursprung från ICM en blastocyst1. Cellerna i en pluripotency tillstånd och kan bilda alla somatiska härstamningar och könsceller celler2. Inrättandet av ES-celler ger möjlighet att undersöka utvecklingen bearbetar in vitro- och kan generera celler av medicinsk relevans för regenerativ medicin baserat på deras pluripotency3.
Två grupper seminally etablerades mus ES cellinjer 1981 och när celler från det tidiga embryot mus odlades i fostrets bovint serum (FBS)-innehållande medium med mus embryonala fibroblaster (MEFs) som mataren lager1,4 . MEFs var inaktiverat mitotiskt och odlades redan i rätter före odling ES-celler. MEFs ger stöd för mus ES cell fastsättning och producera tillväxtfaktorer för att främja förökning och förtränga den differentiering5, medan FBS erbjuder väsentliga trofiska faktorer och hormoner för cellproliferation. Efterföljande studier indikerade att LIF produceras av mataren celler var den viktigaste cytokin för självförnyelse och underhåll av pluripotency i mus ES-celler, och tillägg av LIF till medium kan ersätta för feeder celler6. För närvarande är sustainment av mus ES-celler i FBS/LIF medium på matare fortfarande den standardmetod som antagits av många forskare. Dock uppstå vissa problem med detta klassisk kultur synsätt. För det första feeder celler utsöndrar överflödigt och okontrollerad faktorer och kan orsaka patogena kontaminering7. Att undvika denna störning, beläggning ytan av rätter med gelatin och tillägg av LIF i serum-innehållande medium finns alternativa metoder för att upprätthålla mus ES celler utan feeder-lager celler. Dessutom uppvisar mus ES-celler som odlas under serum/LIF förhållanden morfologiska heterogenitet i cellpopulationer och även i uttrycket nivån på pluripotency-relaterade faktorer8. Nyligen genomförda studier tyder på att villkor som serum/LIF, de pluripotency-relaterade core transkriptionsfaktorer (inklusive SOX2, Nanog och OCT4) kan upprätthålla pluripotency genom LIF och WNT signalering; men framför allt, aktivera de också en fibroblast tillväxtfaktor (FGF) signal att utlösa differentiering8. På grund av ambivalent dubbla verkan av de core transkriptionsfaktorerna presentera mus ES-celler odlade i serum heterogenitet, bestående av två utbytbara populationer, ett liknande ICM och en annan som liknar den primade epiblast state8. Dessutom uppvisar mus ES celler i serum ofta globala hypermethylation9, ICM och PGCs är i en global hypometylering tillstånd, vilket är nära förbunden med deras pluripotency9,10.
Det finns en betydande efterfrågan att utveckla nya metoder för odling mus ES-celler. Flera förbättrade protokoll har fastställts sedan 200311 men det fortsätter att vara vissa begränsningar och brister7. Sedan 2008 har den kombinera utilizationen av två småmolekylär kinashämmare, PD0325901 (en hämmare av de mitogen-aktiverat proteinkinas (MAPK) / extracellulär signal-reglerade kinase (ERK) (MEK)) och CHIR99021 (en hämmare av glykogen syntetas Kinas 3 (GSK3)), i N2B27 medium med LIF och utan serum har öppnat nya perspektiv för odling mus ES cells12. Detta nya definierade medium kännetecknas av användning av två hämmare (2i). Mus ES-celler odlade i 2i/LIF medium är mer homogena i cellpopulationer och uttryck för pluripotens faktorer. 2i/LIF-odlade mus ES celler uppvisar dessutom DNA hypometylering globalt, vilket är närmare till ICM-liknande celler9,13på. Även så, har 2i kultur sina nackdelar. PD0325901 och CHIR99021 är olösligt i vatten och allmänt löses i dimetyl sulfoxid (DMSO)-baserat stamlösning för att lägga till dem i odlingsmedium. Studier har visat att långsiktiga och låg dos exponering av celler för DMSO kan leda till cytotoxicitet14.
Här, vi utnyttjade två småmolekylär föreningar och utvecklat en ny kultur metod av mus ES-celler. Den nya kultur-metoden kombinerar Vc och MEK-hämmare PD0325901 för att främja DNA hypometylering snabbt och till en jämförbar PGC, benämn effektivt så Vc/PD0325901 culturing protokollet. Mus ES-celler i Vc/PD0325901-lagt serum-innehållande medium uppvisar homogenitet i morfologi och upprätthålls i en grundtillståndet. Jämfört med 2i kultur, mus ES-celler odlade Vc/PD0325901 villkor uppvisar snabbare kinetik av DNA demetylering och kan nå hypometylering nivå jämförbar med PGC. Dessutom, användning av en enda hämmare (PD0325901) minskar den ingående mängden DMSO till medium i jämförelse med som används i 2i (PD0325901/CHIR99021) och minskar skador på celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
I arbetet visat vi en ny metod för att kombinera Vc och PD0325901 för att upprätthålla mus ES celler på en odifferentierad och hypometylering stat, som uppnåddes genom en samverkande åtgärder för att främja DNA demetylering av Vc och undertrycka de novo DNA metylering av PD0325901. Dessutom visade mus ES-celler fantastiska morfologi under systemets Vc/PD0325901 kultur.
För att bättre upprätthålla tillståndet av mus ES-celler i Vc/PD0325901 kultur systemet, finns det nå…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete fick stöd av den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (21435008 och 21327006 att H.W.) och prioriterade strategiska forskningsprogrammet i kinesiska Academy of Sciences (XDB14030200 att H.W.).
Materials
| fetal bovine serum Australia source | Corning | 35-076-CV | Component of mouse ES cell medium |
| DMEM/high glucose | Hyclone | SH30022 | Component of mouse ES cell medium |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Component of mouse ES cell medium |
| non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140050 | Component of mouse ES cell medium |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Component of mouse ES cell medium |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | Component of mouse ES cell medium |
| penicillin streptomycin solution | Gibco | 15140122 | Component of mouse ES cell medium |
| PBS | Sigma | P5493 | Cells rinse |
| trypsin | Hyclone | SH30042 | Cell dissociation |
| gelatin | Sigma | 48722 | Dishes coating |
| PD0325901 | Stemolecule | 04-0006-10 | small-molecule chemical for cell culture |
| CHIR99021 | Stemolecule | 04-0004 | small-molecule chemical for cell culture |
| vitamin C | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | XW00508171 | small-molecule chemical for cell culture |
| Ultra Bioscience water purification systemr | Purelab | Ultra | Ultra water |
| DMSO | Sigma | D8418 | Cell freezing medium |
| centrifuger | Eppendorf | 5427R | DNA and protein extraction |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | Component of RIPA buffer |
| PMSF Protease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 36978 | Component of RIPA buffer |
| DTT | Sigma | 43815 | Component of RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E3889 | Component of RIPA buffer |
| Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 | Genomic DNA extraction |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | NanoDrop 2000 | Determination of DNA concentration |
| calf intestinal phosphatase | New England Biolabs | M0290 | DNA digestion |
| DNase I | New England Biolabs | M0303 | DNA digestion |
| snake venom phosphodiesterase I | Sigma | P4506 | DNA digestion |
| Nanosep 3K Omega | Pall | OD003C35 | filtration of digested DNA |
| 1290 UHPLC system | Agilent | 1290 | UHPLC separation |
| G6410B triple quadrupole mass spectrometer | Agilent | G6410B | MS/MS analysis |
| Zorbax Eclipse Plus C18 column | Agilent | Zorbax Eclipse Plus | colume for UHPLC separation |
| 5-methylcytosine | Solarbio Life Sciences | SM8900 | standard 5mC |
| 5-hydroxymethylcytosine (standard) | Toronto Research Chemicals | M295900 | standard 5hmC |
| Prdm14 antibody | bioworld | BS7634 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3a antibody | bioworld | BS6587 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3b antibody | abcam | ab13604 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3l antibody | abcam | ab3493 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt1 antibody | abcam | ab13537 | Western blot analysis-primary antibody |
| β-tubulin antibody | bioworld | BS1482MH | Western blot analysis-primary antibody |
| goat anti-rabbit IgG | abcam | ab6721 | Western blot analysis-secondary antibody |
| goat anti-mouse IgG | abcam | ab6789 | Western blot analysis-secondary antibody |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA extraction |
| reverse transcription system | Promega | A3500 | RNA reverse transcription |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | RT-PCR |
| StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit | Cells Biolabs, Inc. | CBA-302 | alkaline phosphatase staining analysis |
| mouse ES cells: WT, 129 SvEv | Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) | cell strain of mouse ES cells | |
| microscope | Zeiss | LSM510 | cells observation |
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad Prism Software Inc. | 5.0 | statistical analysis |
References
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
- Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. Plos One. 8 (12), e81156 (2013).
- Yamaji, M. PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).
- Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).
- Smith, Z. D., et al. A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo. Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).
- Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell. 115 (3), 281-292 (2003).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Leitch, H. G., et al. Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).
- Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
- Yin, R., et al. Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals. J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).
- Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells. Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171 (2017).
- Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
- Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).
- Inoue, A., Zhang, Y. Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
- Maiti, A., Drohat, A. C. Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites. J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).
- Habibi, E., et al. Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).
- von Meyenn, F., et al. Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells. Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).
- Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells. Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).
- Hackett, J. A., et al. Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency. Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).
- Nakaki, F., Saitou, M. PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming. Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).
- Nichols, J., Smith, A. Pluripotency in the embryo and in culture. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).
