Fare embriyonik kök hücre kullanarak MEK inhibitörü PD0325901 ve C vitamini genomik Hypomethylation korumak için bir alternatif kültür yöntemi
Summary
Fare embriyonik kök hücre kültürü çalışmalarının iki kimyasal tabanlı protokol ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu yeni yöntem Tet-aracılı oksidasyon (vitamin C) teşvik ve DNA hypomethylation ve fare embriyonik kök hücreler pluripotent korumak için 5-metilsitozin (PD0325901 tarafından) de novo sentezi bastırmak sinerjik mekanizmaları kullanır.
Abstract
Embriyonik kök (ES) hücre katmanlardan herhangi birini üç germ (endoderm, mesoderm veya ektoderm) ayırt etmek için potansiyel var ve rejeneratif tıp için birçok soy oluşturabilir. ES hücre kültür vitro uzun yaygın kaygıları konu olmuştur. Klasik, fare ES hücreleri serum ve lösemi inhibitör faktörü (LIF) korunur-orta içeren. Ancak, serum/LIF koşullarda hücreleri heterojen Morfoloji ve pluripotency ilgili genlerin ifade profil göster ve çoğunlukla bir metastable durumdadır. Ayrıca, kültürlü ES hücreleri küresel hipermetilasyon sergi, ama saf ES hücrelerinin iç hücre kütlesi (ICM) ve primordial germ hücreleri (PGCs) bir küresel hypomethylation durumdadır. ICM ve PGCs hypomethylated devlet onların pluripotency ile yakından ilişkilidir. Fare ES hücre kültür yöntemleri geliştirmek için biz son zamanlarda iki küçük molekül bileşikler DNA hypomethylated ve pluripotent durumunu korumak için seçmeli olarak kombine kullanımı dayalı yeni bir yöntem geliştirdi. Burada, biz bu vitamin C (Vc) eş tedavisi mevcut ve PD0325901 5-metilsitozin (5mC) yaklaşık yüzde 90’ını fare ES hücrelerde 5 gün silebilirsiniz. Oluşturulan 5mC içerik PGCs içinde için karşılaştırılabilir olduğunu. Mekanik soruşturma PD0325901 up-Prdm14 ifade Dnmt3b bastırmak için düzenleyen olduğunu gösterir (de novo DNA metiltransferaz) ve Dnmt3l (Dnmt3b kofaktör), de novo 5mC sentezini azaltarak. VC pasif ve aktif DNA demethylations tutulumu gösteren 5-Tet1 ve Tet2, esas katalize arasında bakterilerde görülen (5hmC) 5mC dönüşümünü kolaylaştırır. Ayrıca, Vc/PD0325901 koşullar altında fare ES hücreleri homojen Morfoloji ve pluripotent durumu gösterir. Topluca, biz bir roman ve DNA hypomethylation ve pluripotency fare ES hücrelerdeki bakım ulaşmak için kimyasal-synergy kültür yöntemi öneriyoruz. Küçük molekül kimyasal bağımlı yöntem serum kültür ve daha fazla klinik uygulamaları ve araştırmalar için homojen ES hücreler üretmek için tutar söz önemli eksiklikleri üstesinden gelir.
Introduction
ES hücreler blastosist1ICM kökenli. Hücreler pluripotent durumdadır ve tüm somatik soy ve germline hücreleri2oluşabilir. Kuruluş ES Hücre geliştirme araştırmak için fırsat vitro işler ve hücreler için onların pluripotency3dayalı rejeneratif tıp tıbbi konu ile ilgili-ebilmek oluşturmak sağlar.
İki grup seminally fare ES hücre hatları 1981 yılında kurulan ve ne zaman erken fare embriyo elde edilen hücreleri (FBS) fetal Sığır serum kültürlü-orta fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) ile besleyici katman1,4 içeren . MEFs mitotically inaktive ve yemekleri ES Hücre kültürü çalışmalarının önce önceden yetiştirilmiştir. MEFs fare ES Hücre eki için destek sağlar ve yayma teşvik ve farklılaşma5, FBS temel trofik faktörler ve hormonlar hücre çoğalması için sunarken bastırmak için büyüme faktörleri üretmek. Sonraki çalışmalar besleyici hücreler tarafından üretilen LIF kendini yenileme ve fare ES hücrelerdeki pluripotency için anahtar sitokin yapıldı ve LIF yanı sıra Orta içine için besleyici hücreler6yerine olabilir göstermiştir. Şu anda, fare ES hücrelerde besleyiciler FBS/LIF ortamda sustainment hala pek çok araştırmacı tarafından kabul edilen standart yöntemdir. Ancak, bazı sorunlar ile bu klasik kültür yaklaşım ortaya. İlk olarak, besleyici hücreler aşırı ve kontrolsüz faktör salgılar ve patojen bulaşma7neden olabilir. Yemekleri jelatin ile yüzeyi ve LIF eklenmesi serum içeren kaplama bu girişimi engellemek için orta besleyici katmanlı hücre olmadan fare ES hücreleri korumak için alternatif yöntemler vardır. Ayrıca, fare ES hücreleri serum/LIF koşullar altında yetiştirilen morfolojik heterojenite hücre popülasyonlarının ve hatta pluripotency ile ilgili faktörler8ifade düzeyini sergi. Son yıllarda yapılan çalışmalarda serum/LIF koşullar altında LIF ve WNT sinyal aracılığıyla pluripotency (SOX2, MicroRNAs ve OCT4 dahil) pluripotency ilgili çekirdek transkripsiyon faktörleri ayakta olabilir öneririz; Ancak, özellikle, onlar da farklılaşma8tetiklemek için fibroblast büyüme faktörü (FGF) sinyal etkinleştirin. Çekirdek transkripsiyon faktörleri kararsız çift eylem nedeniyle, fare ES hücre içinde serum kültürlü ICM ve astarlanmalıdır epiblast devlet8benzeyen başka bir benzer bir iki değiştirilebilir nüfus oluşan heterojen, mevcut. Ayrıca, ICM ve PGCs onların pluripotency9,10ile yakından bağlantılı bir küresel hypomethylated durumda ise serum hücrelerde fare ES kez küresel hipermetilasyon9, sergi.
Fare ES Hücre kültürü çalışmalarının için yeni yöntemler geliştirmek için önemli bir talep var. Birkaç gelişmiş protokol 200311 ‘ den beri kurduk ama orada bazı sınırlamalar ve eksiklikleri7olmaya devam ediyor. 2008, iki küçük molekülü kinaz inhibitörleri, PD0325901 kombine kullanımı (inhibitörü olan mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) / hücre dışı sinyal düzenlenir kinaz (ERK) (MEK)) ve CHIR99021 (inhibitörü olan glikojen sentaz kinaz 3 (GSK3)), N2B27 ‘ Orta LIF ve serum olmadan kodlamayla fare ES12hücreleri için yeni perspektifler açtı. Bu yeni tanımlanmış orta iki inhibitörleri (2i) kullanımı ile karakterizedir. 2i/LIF ortamda kültürlü fare ES Hücre popülasyonlarının ve pluripotency faktörler ifade daha homojen hücrelerdir. Buna ek olarak, 2i/LIF-kültürlü fare ES hücre DNA hypomethylation genel olarak ICM benzeri hücreler9,13için daha yakın olan sergi. Öyle olsa bile, 2i kültür kendi dezavantajları vardır. PD0325901 ve CHIR99021 suda çözünmez ve genellikle dimetil sülfoksit (DMSO) çözülür-kültür ortamında eklemek için hisse senedi çözüm tabanlı. Çalışmalar bu uzun vadeli gösterdi ve hücre düşük doz maruz DMSO sitotoksisite14‘ e neden olabilir.
Burada, iki küçük molekül bileşikler kullanılan ve fare ES Hücre yeni bir kültür yöntemi geliştirdi. Roman kültür yöntemi DNA hypomethylation hızla tanıtmak için Vc ve MEK inhibitörü PD0325901 birleştirir ve etkili bir şekilde PGC karşılaştırılabilir düzeyde için Vc/PD0325901 kodlamayla protokolü olarak adlandırılmış. Vc/PD0325901-eklendi serum içeren orta fare ES hücrelerde homojenliği morfoloji içinde sergilemek ve bir yere durumda sürekli. 2i kültür için karşılaştırıldığında, Vc/PD0325901 koşullar altında kültürlü fare ES hücre DNA demethylation daha hızlı kinetik sergi ve hypomethylation düzeyi PGC karşılaştırılabilir ulaşabilirsiniz. Buna ek olarak, tek inhibitörü (PD0325901) kullanımı giriş DMSO ile karşılaştırıldığında 2i içinde kullanılan orta içine azaltır (PD0325901/CHIR99021) ve hücrelere zarar azaltır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çalışma, biz Vc ve PD0325901 fare ES hücreleri de novo DNA bastırmak ve DNA demethylation Vc tarafından teşvik sinerjik bir eylem tarafından elde edildi bir farklılaşmamış ve hypomethylated devlet sürdürebilmek için birleştirme bir roman yöntemi gösterdi metilasyon tarafından PD0325901. Ayrıca, fare ES hücreleri Vc/PD0325901 kültür sistemi altında büyük morfoloji gösterdi.
Daha iyi fare ES hücreleri durumunu Vc/PD0325901 kültür sistemi içinde sürdürmek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (21435008 ve 21327006 H.W. için) ve stratejik öncelik araştırma programı Çin Bilimler Akademisi tarafından desteklenmiştir (H.W. için XDB14030200).
Materials
| fetal bovine serum Australia source | Corning | 35-076-CV | Component of mouse ES cell medium |
| DMEM/high glucose | Hyclone | SH30022 | Component of mouse ES cell medium |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Component of mouse ES cell medium |
| non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140050 | Component of mouse ES cell medium |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Component of mouse ES cell medium |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | Component of mouse ES cell medium |
| penicillin streptomycin solution | Gibco | 15140122 | Component of mouse ES cell medium |
| PBS | Sigma | P5493 | Cells rinse |
| trypsin | Hyclone | SH30042 | Cell dissociation |
| gelatin | Sigma | 48722 | Dishes coating |
| PD0325901 | Stemolecule | 04-0006-10 | small-molecule chemical for cell culture |
| CHIR99021 | Stemolecule | 04-0004 | small-molecule chemical for cell culture |
| vitamin C | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | XW00508171 | small-molecule chemical for cell culture |
| Ultra Bioscience water purification systemr | Purelab | Ultra | Ultra water |
| DMSO | Sigma | D8418 | Cell freezing medium |
| centrifuger | Eppendorf | 5427R | DNA and protein extraction |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | Component of RIPA buffer |
| PMSF Protease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 36978 | Component of RIPA buffer |
| DTT | Sigma | 43815 | Component of RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E3889 | Component of RIPA buffer |
| Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 | Genomic DNA extraction |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | NanoDrop 2000 | Determination of DNA concentration |
| calf intestinal phosphatase | New England Biolabs | M0290 | DNA digestion |
| DNase I | New England Biolabs | M0303 | DNA digestion |
| snake venom phosphodiesterase I | Sigma | P4506 | DNA digestion |
| Nanosep 3K Omega | Pall | OD003C35 | filtration of digested DNA |
| 1290 UHPLC system | Agilent | 1290 | UHPLC separation |
| G6410B triple quadrupole mass spectrometer | Agilent | G6410B | MS/MS analysis |
| Zorbax Eclipse Plus C18 column | Agilent | Zorbax Eclipse Plus | colume for UHPLC separation |
| 5-methylcytosine | Solarbio Life Sciences | SM8900 | standard 5mC |
| 5-hydroxymethylcytosine (standard) | Toronto Research Chemicals | M295900 | standard 5hmC |
| Prdm14 antibody | bioworld | BS7634 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3a antibody | bioworld | BS6587 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3b antibody | abcam | ab13604 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3l antibody | abcam | ab3493 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt1 antibody | abcam | ab13537 | Western blot analysis-primary antibody |
| β-tubulin antibody | bioworld | BS1482MH | Western blot analysis-primary antibody |
| goat anti-rabbit IgG | abcam | ab6721 | Western blot analysis-secondary antibody |
| goat anti-mouse IgG | abcam | ab6789 | Western blot analysis-secondary antibody |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA extraction |
| reverse transcription system | Promega | A3500 | RNA reverse transcription |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | RT-PCR |
| StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit | Cells Biolabs, Inc. | CBA-302 | alkaline phosphatase staining analysis |
| mouse ES cells: WT, 129 SvEv | Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) | cell strain of mouse ES cells | |
| microscope | Zeiss | LSM510 | cells observation |
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad Prism Software Inc. | 5.0 | statistical analysis |
References
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
- Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. Plos One. 8 (12), e81156 (2013).
- Yamaji, M. PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).
- Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).
- Smith, Z. D., et al. A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo. Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).
- Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell. 115 (3), 281-292 (2003).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Leitch, H. G., et al. Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).
- Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
- Yin, R., et al. Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals. J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).
- Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells. Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171 (2017).
- Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
- Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).
- Inoue, A., Zhang, Y. Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
- Maiti, A., Drohat, A. C. Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites. J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).
- Habibi, E., et al. Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).
- von Meyenn, F., et al. Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells. Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).
- Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells. Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).
- Hackett, J. A., et al. Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency. Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).
- Nakaki, F., Saitou, M. PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming. Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).
- Nichols, J., Smith, A. Pluripotency in the embryo and in culture. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).
