Summary
이 프로토콜 개발 인간의 두뇌의 Zika 바이러스 감염을 모델링 하는 데 사용 되는 기술을 설명 합니다. Wildtype 또는 설계 된 줄기 세포를 사용 하 여, 연구원은 다양 한 메커니즘 또는 초기 뇌 감염 및 결과 microcephaly Zika 바이러스에 감염 된 태아에 영향을 미칠 수 있는 치료를 밝히기 위해이 기술을 사용할 수 있습니다.
Abstract
취약 인구에 Zika 바이러스 (ZIKV)의 최근 출현 microcephaly 갑작스러운 증가 및에 다른 neurodevelopmental 신생아 유아에서 주도하 고 있다. 모기는 바이러스 성 전송의 주요 경로, 그것은 또한 성적 접촉 및 수직 어머니 태아 전송을 통해 확산 하기 위해 표시 되었습니다. 전송, ZIKV의 독특한 바이러스 성 차 있는 굴곡 운동으로이 후자의 경우에 바이러스는 개발 두뇌의 신경 조상 세포 (Npc) 주로 대상으로 생각 됩니다.
여기 ZIKV 감염, 그리고 결과 microcephaly 모델링 하는 방법, 그 때 발생 인간의 대뇌 organoids 노출 되는 ZIKV 사는 설명 합니다. organoids 그들의 신경 조상 인구 내에서 바이러스의 높은 레벨을 표시 하 고 시간이 지남에 심각한 세포 죽음과 microcephaly 전시. 이 3 차원 뇌 organoid 모델을 관찰 하 고 잠재적으로 개발 인간의 두뇌의 ZIKV 감염으로 개입 종 일치 하는 실험을 실시 연구자 수 있습니다. 모델 표준 2 차원 방법, 향상 된 관련성을 제공 하 고 인간의 특정 세포질 건축 및 동물 모델에서 가능 하지 않은 단백질 식 포함.
Introduction
Zika 바이러스 (ZIKV) 미크로네시아, 프랑스령 폴리네시아, 아메리카에서 빠르게 확산 하고있다 그리고 neurodevelopmental 질병 등으로 이어지는 개발 태아 두뇌 감염 placental 방 벽1,2 를 보여왔다 최근 microcephaly3,,45,6 으로. 이 환자의 삶과 치료의 현재 부족에 장기 영향 연구자와 임상 ZIKV 감염 및 복제 메커니즘의 더 나은 이해를 위해 출 격을 주도하 고 있다. 이전 학문 생체 외에서 순수 관련 셀 유형7,8,9, vivo에서10 의 다양 한 시스템의 ZIKV 감염 검사 immunocompetent immunocompromised 마우스11,,1213 그리고 비 인간 영장류14,,1516. 이러한 전통적인 기법 뿐만 아니라 여러 그룹 개발 인간의 두뇌의 ZIKV 감염에 대 한 자세한 이해를 대뇌 organoids 줄기 세포 유래를 구현 했습니다. 이 그룹 microcephaly 형17,18확인, 바이러스 항목19에 연결 된 수용 체를 조사, 감염20 생리 적인 응답을 검사 하는 인간의 대뇌 organoids 활용 , 21, 그리고 잠재적으로 약물 후보22화면. 여기 신속 하 게 생성 하 고 줄기 세포 파생 대뇌 organoids 감염에 대 한 기술 같이 이전19, 개발 인간의 두뇌의 ZIKV 감염의 이해를 개선 하기, 설명 되어 있습니다.
때문에 organoids 표준 만능 줄기 세포 (PSC) 문화에서 형성 된다,이 기술은 개발 두뇌의 바이러스 감염에 관한 답변 다양 한 과학적 질문에 대 한 수 있습니다. 예를 들어 CRISPR 공학 대부분 vivo에서 유전자 연구19보다 더 빠른 속도로 organoid 감염 전에이 PSC 라인 수정에 사용할 수 있습니다. 또한, 달리 표준 2 차원 (2D) 차별화 문화, organoids corticogenesis에 대 한 중요 한 복잡 한 세포 구조 전시 및 최근 연구는이 아키텍처는 감염 시 중단 될 수 있습니다. 21. 마지막으로, 상대적으로 저렴 한 비용 organoids 생성의 더 높은 처리량 실험 및 검사 vivo에서 모델에 비해 있습니다. 다른 한편으로, organoids ZIKV을 공부에 활용 하는 몇 가지 단점이 있다. Organoids 2D 문화 보다 훨씬 더 생물학적으로 관련 있는 동안, 그들의 3 차원 (3D) 특성상 organoids의 평가에서 추가 도전이 있다. 이미징 및 organoids의 분리는 더 많은 장비와 표준 2D 문화에 보다 자원의 더 큰 투자 하 경향이 있다. 또한, organoids 부족 맥 관 구조 및 면역학 구성 요소에에서 존재 하는 비보에 모델, 그래서 연구원은 바이러스 성 감염의 그 측면에 관심이 대체 프로토콜을 추구 하도록 조언 된다.
인간 organoids 및 문화, neurospheres의 형성에 대 한 기술의 수 있다 그리고 그들은 일반적으로 패턴화 또는 총칭 범주 내에서을. 패턴화 방법 요소 특정 계보23으로 차별화를 밀어 Wnt, BMP, TGFβ, 및 다른 신호 경로를 구현 합니다. 총칭된 방법, 여기에 설명 된 것과 같은 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc) 성향 활용 하 고 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)으로 neuroectodermal 혈통으로 차별화 하는 데 기본24. 약 3 주 후 차별화, 초기 개발 두뇌에서 관찰 되는 여러 셀 형식을 포함 하는 큰, biomimetic neuroepithelial 구조 결과 organoids에 의하여 이루어져 있다.
기술 표준, 피더 무료 PSC 문화에서 organoids를 생성 하 고 ZIKV와이 organoids이 감염에 대 한 전체에 표시 됩니다. 급지대 무료 PSCs 필요 자란 방법에 대 한 지침, 이전 방법 간행물25,26를 참조 하십시오. 또한, 여러 실험에 대 한 바이러스의 일관 된 금액을 적용, 그것은 미리 나를 계산 하는 것이 중요. 이 Vero 세포, 오버레이 매체, 인큐베이션, immunostaining와 치료 뒤의 감염을 실시 하 여 이루어집니다. 이 기술의 방법과 설명 앞에서 설명한19,27되었습니다.
PSC 문화에 도달 하면 대상 합류 50%-70%의 세포는 해리 그리고 낮은 첨부 파일 96 잘 접시로 집계 합니다. 셀 줄기 세포 이종 무료 유지 보수 미디어 (SCMM), 3 일 동안 유지 되며 다음 문화권의 나머지 부분에 대 한 신경 유도 미디어로 변환. Organoids는 3 주 동안 분화는, 일단 감염을 수행할 수 있습니다. 정기적으로 복용 함으로써 이미지 감염 다음 주 동안, 연구원은 진보적인 세포 죽음과 organoid의 관찰할 것입니다. 연구원은 또한이 transcriptional 실시 시간 또는 proteomic 프로 파일링에 organoids을 분열 수 있습니다. 이미징, Cryosectioning 및 lightsheet 메서드는 권장 하 고 연구원은 감염 및 신경 조상 세포 (NPC) 인구는 organoids에서 내 특히 바이러스 성 복제의 높은 수준의 볼 기대할 수 있습니다. 궁극적으로,이 기술은 신속 하 게 저렴 한 비용 및 제한 된 장비와 인간 두뇌의 바이러스 감염의 메커니즘을 검토 하는 연구를 수 있습니다.
Protocol
1. iPSC에서 만드는 대뇌 Organoids / hESC 2D 문화 (0 일)
참고:이 프로토콜 가정 줄기 세포 (SC) 유지 보수는 vitronectin 또는 Geltrex SCMM 중간에 실시 기판입니다. 미디어를 경작 하는 대안, 높은-단백질 줄기 세포를 사용 하는 경우 것이 좋습니다 적어도 두 구절에 대 한 SCMM 전환 사우스 캐롤라이나 문화 organoid 형성을 시작 하기 전에. 사우스 캐롤라이나 문화 방법 피더 기반 프로토콜 테스트 되지 않았습니다.
- 유지 보수 방법 25 , 26, 50%-70% 합류 문화가지고. 이것은 일반적으로 뿌리고, 후 3-4 일이 문화 방법 및 셀 라인에 종속 될 수 있지만.
참고: 6 잘 플레이트에서 약 2 우물 organoids의 전체 96 잘 접시를 생성 하는 데 필요한.
- 품는 추가 5 분에 대 한 37 ° C 배양 기에서 접시
- 접시를 제거 하 고 치료 우물을 검사 하십시오. 부드럽게 집계 셀 헤어 접시에 누릅니다. 큰 셀 클러스터 여전히 표시 되는 경우 37 2 추가 분에 대 한 접시를 품 어 ° C. 반복 클러스터는 맨 눈으로 볼 수 이상 때까지이 단계.
- 돌아가기 모든 나머지, 치료 우물 유지 관리 접시에서 37 ° C 배양 기.
2. 대뇌 Organoid 유지 보수 (주 2)
- 17와 SCMM의 준비 17 mL 50 mL 원뿔 튜브에서 50 m m Y-27643 µ L. SCMM + Y-27632를 따뜻한 뜨거운 물 목욕에서 37 ° C에 솔루션.
- 는 Organoid 플레이트는 인큐베이터에서 하 고 75 µ L로 설정 멀티 채널 P200 피 펫을 사용 하 여 천천히 세우 중간 우물의 가장자리에서 첫 번째 행에. 일단 매체 그려 왔다, 신속 하 게 느슨한 세포와 organoids를 올려 잘으로 중간 다시 추방. 각 행에 대해이 반복.
참고: 이 기술을 라 함은 " 분산, " 서 스 펜 션에 세포질 파편과는 organoid 리프트. 작은 파편에, 미디어의 변화와 함께 제거할 수 있도록 유지 하는 동안에 빠르게는 organoid, 우물의 바닥에 싱크. 이 세포질 파편에 휴식 하는 문화 중에서 organoid를 방지할 수 있습니다.- 후 모든 우물 분산 되어, 15에 대 한 대기는 organoids가 각 우물의 바닥에 침 몰 되도록 s.
- 천천히 그리고 신중 하 게 잘 사용 하 여 각 멀티 채널 P200 피 펫에서 매체의 75 µ L 발음 및 폐기물 저수지로 분배.
참고: 대부분의 사용자는 때때로 일반 피드 동안 한 organoid 발음. 이 약 1%의 시간을 발생할 수 있습니다. 충분 한 organoids 실험 시간 포인트를 살아남을 수 있도록 적절 하 게 계획 하십시오. - 전송 SCMM + 시 저수지로, Y-27632 솔루션 잘 멀티 채널 P200 피 펫을 사용 하 여 각 organoid에 150 µ L를 분배 하는 고.
- 37 ° C 배양 기에 다시 접시를 놓습니다.
3. 대뇌 Organoid 유지 보수 (주 3)
- 따뜻한이 시간 없이 Y-27643 37 ° C에 SCMM의 17 mL.
- 멀티 채널 P200 피펫으로 100 µ L로 설정, 함께 분산 organoid 판의 모든 우물 (단계 2.2 참조). Organoids는 그들의 우물의 바닥에 침 몰 되도록 대기 15 s.
- 폐기물 저수지를 준비 하 고 소스 저수지로 따뜻하게 SCMM 전송.
- 신중 하 게 각 우물에서 매체의 125 µ L 발음 하 고 멀티 채널 P200 피 펫을 사용 하 여 신선한 SCMM의 150 µ L 바꿉니다.
- 37 ° C 배양 기에 다시 접시를 놓습니다.
4. 대뇌 Organoid 유지 보수 (하루 4 +)
참고: 감염까지 매일이 정기적인 유지 관리를 수행.
- 하루 4에 피드를 시작 하기 전에 준비 신경 유도 (NI) 매체.
100 X N-2 보충의
- 재개 2 mg/mL 헤 파 린, 하 나와 함께 약 250 µ L 수 5 mL 유리병. 헤 파 린, 100 X N-2의 5 mL 및 100의 5 mL의 250 µ L 추가 X MEM-NEAA DMEM의 500 ml / F12 + GlutaMAX. 멸 균 필터 500 mL 필터에서 혼합된 솔루션.
참고: NI 사용;에 4 ° C에서 유지 NI 지속 2 주 전에 신선한 매체를 준비 합니다.
- 재개 2 mg/mL 헤 파 린, 하 나와 함께 약 250 µ L 수 5 mL 유리병. 헤 파 린, 100 X N-2의 5 mL 및 100의 5 mL의 250 µ L 추가 X MEM-NEAA DMEM의 500 ml / F12 + GlutaMAX. 멸 균 필터 500 mL 필터에서 혼합된 솔루션.
- 37에 NI 매체의 17 mL 따뜻한 ° c.
- 멀티 채널 P200 피펫으로 100 µ L로 설정, 함께 분산 organoid 판의 모든 우물 (단계 2.2 참조). Organoids는 그들의 우물의 바닥에 침 몰 되도록 대기 15 s.
- 폐기물 저수지를 준비 하 고 따뜻하게 NI 소스 저수지로 전송.
- 신중 하 게 각 우물에서 매체의 125 µ L 발음 하 고 멀티 채널 P200 피 펫을 사용 하 여 신선한 NI의 125 µ L 바꿉니다.
- 37 ° C 배양 기에 다시 접시를 놓습니다.
5. ZIKV Organoid 감염 (~ 하루 24)
참고: 차별화, 거기 인터넷의 약 3 주 후큰 neuroepithelial 구조와 rosettes organoid ZIKV 감염에 매우 취약 하 게 될 것입니다 내 표시 수.
- 가지고 얼 ' 뜨거운 물을 욕조에 37 ° C에 1 X 균형 소금 솔루션 (EBSS), 1 X PBS 및 NI s.
- Dilute 대상 감염에 1 X EBSS에 ZIKV 알려진된 농도의 다양 한 감염 (MOI).
참고: 다른 MOIs의 titrations 바이러스 성 복용량 응답을 달성 하는 것이 좋습니다. 이 바이러스 스트레인;에 의해 다를 수 있습니다. ATCC VR-1838, ATCC VR-1843, 일반 나 0.1과 10 사이의 값). - 는 Organoid 잘 단일 채널 P200 피 펫을 사용 하 여에서 신중 하 게 모든 매체를 제거 합니다. 신속 하 게 잘 사용 하 여 각 P200 멀티 채널 피 펫은 organoids를 씻어 1 X PBS의 200 µ L 추가.
- 는 Organoid 잘 단일 채널 P200 피 펫을 사용 하 여에서 신중 하 게 모든 매체를 제거 합니다. 신속 하 게 EBSS 전용 (모의 감염) 또는 잘 하는 organoid 완전히 빠져들 수 있도록 ZIKV 바이러스 솔루션 X 1의 50 µ L를 추가 합니다. 연구에 대 한 감염 하는 것입니다 각 organoid 반복.
- 2 h. 위해 37 ° C 배양 기에 다시 접시를 놓고
참고: 이 기간 해야 크게 영향을 주지 그대로 organoids에 비해 그들의 성장을 위한 organoids 모의 감염 잠복기. - 바이러스 부 화 하기 전에 약 30 분 이며 50 mL 원뿔 튜브에의 완료, aliquot 25 mL NI의 뜨거운 물을 욕조에 37 ° C를.
- 바이러스 노출 완료 되 면, 각 잘 1 X PBS의 200 µ L 함께 organoids 세척, 15 s, 그리고 단일 채널 P200 피 펫을 사용 하 여 제거 1 X PBS를 organoids 수.
- 추가 200 µ L 각 신선한 NI의 잘, 그리고 다시는 인큐베이터에 배치.
- 옵션: 하루 0 시간, organoids 1 시간 감염 후 몇 군데 있습니다.
- 125 µ L NI 분산 메서드를 사용 하 여 다른 모든 일을 대체 하 여 문화를 계속 (4 단계 참조). 반드시 제대로 보낸된 미디어 및 팁, 폐기이 감염 ZIKV 입자 포함.
Representative Results
하루 동안 organoid 형성의, 사우스 캐롤라이나 문화 있는 그들은 50%-70% 합칠, 그림 1(A-C)와 같이 로그-성장 단계에 있어야 합니다. 문화는 별개 가장자리, 둥근된 식민지를 형성 한다 그리고 우물 차별화 그림 1(D-E)의 명확 해야 한다. 차별화를 발생 하는 경우는 선택 제거 하기 organoids를 만들기 전에 적어도 하루 판 내에서 영향을 받는 영역을 청소를 실시 하는 것이 좋습니다. 문화의 큰 부분을 분화 하는 경우 그것은 여분의 통로 실시, 새로운 유리병을 녹여 또는 변경 하는 organoids는 순수 줄기 세포 문화에 의해 형성 되 고 되도록 줄기 세포 문화 기술을 필요할 수 있습니다.
여전히 셀을 계산 하는 동안 관찰의 작은 집계 수 있지만 효소 및 효소 분리 시 약 처리의 조합에 의해 분리 주로 단일 셀에 연결 되어야 합니다. 작은 집계의 존재 계산 정확도 영향을 미칠 수 있습니다 비록 organoid 형성 방해 표시 되지 않습니다. 여러 건의 샘플, 당 만들어집니다 및 카운트 20% 이상의 경우, 그것은 셀 추가 단 수 화 하는 분리 시간을 증가 해야 할 수 있습니다 것이 좋습니다.
일단 셀 시드 울 라 U-하단 96 잘 접시그림 2(A)에 스핀 다운, 그들은 각의 맨 아래에 있는 셀의 평면, 고밀도 시트로 표시 됩니다. 세포는 다음 2 일 동안 천천히 집계 합니다. 그것은 기계적인 힘은 느슨하게 형성 집계 중단 될 수 있습니다이 48 시간 동안 접시를 방해 하지 것이 좋습니다. 처음 10 일 동안는 organoid 구형, 주로 유지 됩니다 그리고 600-800 µ m (그림 2B) ~ 300 µ m에서 성장할 것 이다. 더 현저한 구조 organoid 10 일과 20 일 사이에서 나타나는 것을 시작 (그림 2C-E). 하루 24, 연구원 명시 야 현미경 검사 법 (그림 2F) 통해 장미 모양의 구조를 관찰할 수 있어야 합니다. 문화를 계속 하는 동안 이러한 neuroepithelial 구조는 (그림 2G)으로 몇 일 동안 수량 및 크기에서 증가할 수 있습니다. 피드, 동안 연구원 문화의 첫 2 주 동안 특히 각 우물의 바닥에 모으는 파편의 상당한 금액을 알아차릴 것 이다. 2.2 단계에 설명 된 분산 기술을 여러 피드 (그림 3A) 통해 축적에서 apoptotic 파편을 방지 하기 위해이 세포질 파편의 대부분을 제거 합니다. 이 파편은 이미징 방해할 수 있습니다, 그것은 관찰 하 고 계량 감염 유도 된 세포 죽음, 더 도전 할 수 있는 고 차별화에 영향을 미칠 수 있는 이웃 organoid 비대칭 신호 제공할 수 있습니다. 분산 기술을 제대로 실시 하 고,이 해야 감소 (그림 3B-C, 3D-E).
Cryosections 또는 lightsheet 이미징는 organoids 내에서 형성 하는 대뇌 피 질의 구조 검사를 실시 하는 것이 좋습니다. 하루 25 organoids에 근 엽 구조 및 심 실 영역 DAPI(그림 4)와 (그림 4B) 인-vimentin 얼룩에 명확 하 게 볼 수 있습니다. TBR2의 존재 (그림 4C) 바깥쪽으로 마이그레이션 제안 형태와 중간 창시자 형성 됩니다 나타냅니다. MAP2 + (그림 4D) 신경 각 장미의 외부 영역을 채웁니다. 심 실 영역 (VZ), 帯 (SVZ), 중간 영역 (이즈), 그리고 각 장미 내 외피 격판덮개 (CP)이이 단백질에서 하나는 시각화 수 있습니다 (그림 4E, 4E'). 하나는 개발의 나중 단계를 관찰 하기 위해 이러한 organoids 문화를 계속할 수 있습니다. 대뇌 피 질의 레이어 링이이 유형의 organoid에서 저명한 동안, vivo에서처럼 gliogenesis에 자연 스위치는 훨씬 발생지 않습니다. 이 하루 108 organoids, 세포의 큰 부분 MAP2 또는 GFAP 표현에서 관찰 될 수 있다 (그림 4F-난).
사용자가 바이러스 나 organoids (그림 5A-B)에 적용에 따라 ZIKV 감염 후 약 3 일에 의해 organoid 크기 차이 볼을 기대할 수 있습니다. 두 일 후에 있을 것입니다 또한 증가 세포질 파편에 모의 우물에 비해 감염 된 우물. Organoid 크기에이 차이 다음 주, 감염 된 organoids 떨어져 (그림 5C D)를 시작할 때까지 증가할 것 이다. 분석 실험의 다양 한 감염 메커니즘, 바이러스 성 RNA 추출 및 cryosectioning (권장 자료의 테이블에 보고 된 항 체)를 포함 하 여 조사를 시점에서 사용할 수 있습니다. Cryosectioning, 따라 사용자가 ZIKV 감염 (그림 6)에 신경 조상 세포 (Npc)의 민감성을 제안 neuroepithelial 구조의 꼭대기 지역에서 바이러스의 큰 존재를 관찰할 것입니다. 면역 형광 sectioned organoids의 또한 감염 된 organoids (그림 7)에서 쪼개진 caspase 3 식 증가 표시 됩니다.
그림 1 : Organoid 형성 하기 전에 줄기 세포 식민지 형태학.
식민지는 일관 된 organoids의 많은 수를 생성 하는 분리의 시간에서 50%-70% 합칠 이어야 한다. (A) Sparse, 최근 시드 문화 도달 하지 않은 아직 로그-성장 단계, 그리고 많은 organoids를 생성 하지 것입니다. (B) 셀 적절 한 합류에 도달, 그들은 분리에 대 한 준비입니다. 또한 이러한 식민지 되도록 그들은 분명 차별화의 검사는 중요 하다.입니다. (C) 너무 멀리 찍은 식민지 과도 합류를 도달할 것 이다 고 organoid 형성에 대 한 권장 하지 않습니다. 이 상태에서 문화 차별화 셀을 포함 하도록 더 높습니다. (D) 식민지 가장자리, 중앙에 둥근된 셀의 일관 된 셀 형태와 별개 이어야 하며 약간 길쭉한 세포 가장자리를 향해. (E) 최소한의 차별화는 문화에 존재 해야 합니다. 더 큰, 병합 된 셀 센터 또는 식민지 (흰색 화살표)의 가장자리에서 관찰 된다 문화의 1% 이상 약을 선택 제거 또는 추가 구절 유니폼 줄기 세포 인구를 형성 하기 위하여 실시 하는 것이 좋습니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 시간이 지남에 대뇌 organoid 성장.
(A) 2D에서 대뇌 organoids의 생산에 대 한 다이어그램 PSCs 이종, 피더 없는 매체에 유지. (B) 첫 번째 8 일 organoids 유지 됩니다 대부분 구형 몇 감지 기능. organoid의 직경 10 일째에 500 µ m. (C-E) 약 300 µ m에서 배열할 것 이다, 명확 하 게 지역 organoids의 주위에 감지 되도록 시작 됩니다 그리고 그들은 그들의 둥근 모양 잃게됩니다. 그들은 크게는 organoids를 생성 하는 데 사용 되는 셀 라인에 따라 직경 약 1 m m 크기의 증가를 계속할 것 이다. (F) 약 20 일 후 차별화의 사용자는 대부분 organoids의 맑은 주변 지역에서 neuroepithelial 구조 (검은 화살표)의 형성을 관찰할 것입니다. 이 꼭대기와 기저 구조 개발 피 그를 흉내 낸 고리 모양의 형태가 있다. (G) 이러한 neuroepithelial 구조는 성장 하 고 약 20-30 일에 대 한 크기에서 증가 계속 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 분산을 통해 세포질 파편의 피드 기술.
Organoid 성장, 동안 세포 죽음의 다량, 예상 될 것입니다 그리고는 organoid의 기지를 둘러싼 세포질 파편의 축적으로 이어질 수 있습니다. (A) 묘사 분산 기술은 각 피드 동안이 파편의 대부분을 제거 하는 연구자 수 있습니다. 이렇게 하려면 멀티 채널 P200 피 펫을 사용 하 여 천천히 사용된 매체를 인출 하 고 빠르게 organoid 및 세포 잔해 서 스 펜 션에 들어 그것을 추방. organoid 신속 하 게 어느 시간에 일정 한 급 식 지휘 될 수 있다 우물의 바닥에 떨어질 것 이다. (B) 전과 후 상당한 파편 감소를 보여준다 (C) 분산 먹이 주 6 organoid의 예. 이 하루 18 organoid (D) 전후 (전자) 분산 먹이 의해 표시 된 대로 몇 주 동안 계속 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : Immunohistochemistry 통해 대뇌 organoids의.
대뇌 organoids의 Lightsheet 이미지 형성 세포 아키텍처의 예를 제공 하기 위해 표시 됩니다. 하루 25 일 DAPI (A) 에 형광체 Vimentin (B)는 각각 개별 근 엽 및 심 실 영역 표시. (C) TBR2 레이블 바깥쪽, 마이그레이션하는 중간 창시자 그리고 MAP2 (D) 라벨 외피 격판덮개에 형성 하는 신경. (E, E') 이 단백질의 조합을 대뇌 organoid 모델에 명확 하 게 대뇌 피 질의 개발의 재현 부를 보여줍니다. (F-나) 하루 108, gliogenesis는, GFAP + 및 MAP2 + 셀 채우기는 organoid의 다량의 혼합물으로 발생 했습니다. VZ 심 실 영역, SVZ = = 帯, 오늘 중간 영역, CP = = 외피 격판덮개. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 감염 된 organoids의 저하.
모의 나에서 대뇌 organoids ZIKV 감염의 (A) 밝은 필드 이미지 = 0.1, 10. 이미지 촬영 했다 감염 (0 일) 직후도 3 ~ 6 일 후 감염. (B-C) (B) 모의 및 (C) 나에 ZIKV 감염 세포 파편의 명시 이미지 = 10 대뇌 organoids 3 일 후 감염. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : Cryosection 및 면역 형광의 감염 organoids.
하루 24 organoids 나에 ZIKV에 노출 됐다 = 0.1, 및 cryosectioned 6 일 후. 이 단계에서 심 실, subventricular, 및 중간 영역에서 organoid의 신경 뿌리 세포와 방사형 명과 있는 바이러스의 존재를 분명 있다. (A) 핵 얼룩 통해이 neuroepithelial 지역 명확 하 게 볼 수 있습니다 (흰색 화살표) 인해 꼭대기 표면 주위 고리 모양의 구조를 형성 하는 핵의 높은 밀도를. (B) 바이러스 성 봉투에 대 한 얼룩으로 이러한 근 엽 구조 (흰색 화살표) 내에서 바이러스의 상대적으로 높은 존재를 확인할 수 있습니다 하나. 참고 다양 한 미확인된 주변 세포에 있는 바이러스의 작은 금액입니다. (C-D) MAP2 또는 다른 신경 관련 쇼 신경 바이러스 성 얼룩 겹치더라도 바이러스에 의해 감염 된 것으로 표시 되지 않는 문화에는 얼룩. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : 감염된 organoid의 면역 형광 caspase 3 죽 습.
감염 후 하나는 organoids 내에서 발생 하는 세포 죽음의 메커니즘을 조사 apoptotic 표시기를 사용할 수 있습니다. 이 예제에서는 하루 24 organoids 나에 ZIKV에 노출 됐다 = 0.1, 및 cryosectioned 6 일 후. (A) 감염 되지 않은 organoids 표시 없음 바이러스 성 봉투 (4G 2 단백질), 그리고 최소한의 조직에서 발생 하는 항상성 apoptosis 때문 쪼개진된 caspase 3. (B) 감염 rosettes apoptosis의 증가 수준을 표시 하기 시작 합니다. (C) 4G 2 또한 얼룩 통해 심각한 감염을 보이고 있다 근 엽이이 지역에서 쪼개진된 caspase 3의 상부를 전시 하는 경향이 있다. 감염의 심각도 감염된 근 엽에서 쪼개진된 caspase 3 식 사이 직접적인 상관 관계가 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
인간의 대뇌 organoids를 활용 하면 ZIKV 감염 조사를 고려해 야 할 몇 가지 경고가 있다. 한 가지 중요 한 고려 사항은 그 organoid 형성 이며 구조는 매우 그들이 형성 하는 줄기 세포 라인에 의존. 셀 라인 사이 비교 주의 isogenic를 포함 하 여 설계 라인; 그것은 최고의 여러 subclones, 그리고 이상적으로 여러 줄기 세포 라인을 사용 하 여 결론을 확인 하는. 또한 셀 라인에이 차이로 인해 파일럿 실험 적절 한 차별화는 organoids에서 발생 되도록 것이 좋습니다. Neuroepithelial 구조는 명시 야 현미경으로 볼 수 있습니다, 하는 동안 그것은 또한 신경 분화 마커 PAX6 등 인 vimentin 찾아 qRT-PCR 또는 cryosectioning 실험을 실시 권장 됩니다.
하나는 또한 동일한 셀 라인에서 organoids 사이에서 상당한 변화를 예상 해야 합니다. 프로토콜의 총칭 특성상 수와 neuroepithelial 구조체의 크기는 개별 organoids 사이 달라질 수 있습니다. 일반적으로, 하나 적어도 2을 큰 기대할 수 있습니다 (> D24 직경에 200 µ m) 당 organoid 신경 근 엽. 이러한 이유로, 감염, 따라 organoid 크기에서 변화의 관찰 등 경도 연구는 특히 계몽. 배치 사이 가변성 발생할 수 있습니다 또한,이 대 한 가장 큰 원인은와 부정확 한 셀 계산 또는 시드. 여러 계산을 수행 하 고 셀 서 스 펜 션은 울 라 U-하단 96 잘 접시에 뿌리기 전에 잘 혼합 되도록 하는 것이 좋습니다.
Organoids 울 라 U-하단 96 잘 접시에서 배양 때 플레이트의 가장자리 주위 상당한 증발 효과 보는에 계획 한다. PBS이 웰이 스 작성 및 센터 60 우물 에서만 작동 이상적 이다. 증발, 인해 외부 우물에서 organoids 보다 가능성이 그들의 성장과 분화에 영향을 미칠 것입니다 중앙에 서로 다른 조건에 노출 됩니다. 실험에 필요한 것입니다 organoids의 수를 계획할 때이 고려 하시기 바랍니다. 또한, organoids 문화 매체의 변색 표시 될 것입니다 약 30 일 후 96 잘 포맷을 자라 다 시작 됩니다. 지난 30 일 organoids에 계획 하는 경우는 organoids 울 라 24-잘 접시에 전송 하는 것이 좋습니다. 전송을 수행 하려면 오프닝, organoids 보다 훨씬 큽니다 P1000 팁을 잘라가 위를 사용 하 여 고 pipetting으로 organoids 전송.
인간의 대뇌 organoids neurodevelopment 및 질병의 필드의 이해에 큰 잠재력을 보유. 연구원은 필요에 따라 프로토콜을 수정 하는 것이 좋습니다. 예를 들어 하나의 특정 해 부 지역에 바이러스 영향을 탐구 있도록 특정 세포 유형으로 분화 효율을 향상 시키기 위해 패턴 요소 구현 수 있습니다. ZIKV의 neurodevelopmental 효과 여전히 제대로 이해 하 고, 그러나이 새로운 방법은 연구자에 게 감염의 메커니즘을 조사 하는 데 액세스할 수, 빠른, 및 높은 처리량 방법을 줄 것 이다.
Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
저자는 초기 전파 및 ZIKV의 정량화에 대 한 프리 실라 나 양 및 하버드의과 대학의 도미니크 제이 자가 감사합니다. 우리 또한 이미징 지원에 대 한 나 다니엘 디 캠프를 감사 하 고 싶습니다. K.E. 정신과 연구와 하버드 대학 줄기 세포 연구소 스탠리 센터에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR | StemCell Technologies | 5873 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X) | Gibco | 10565-018 | (+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11140-050 | |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30029.02 | |
| Stericup Filter (500mL) | Millipore | 220009-140 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom | Corning | 7007 | |
| Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL) | Integra | 4312 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | |
| Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible | Thermo Scientific | 75007210 | |
| Culture Plate Centrifuge Rotor | Thermo Scientific | 75005706 | |
| Vero Cells | ATCC | CCL-81 | For virus expansion, if necessary |
| Zika Virus (Uganda Strain) | ATCC | VR-1838 | Other strains may be used |
| Zika Virus (Puerto Rico Strain) | ATCC | VR-1843 | Other strains may be used |
| phospho-vimentin | MBL | D076-3 | mouse polyclonal, 1:250 dilution |
| TBR2 | Abcam | ab23345 | rabbit polyclonal, 1:300 dilution |
| MAP2 | Novus | NB300-213 | chicken polyclonal, 1:1500 dilution |
| GFAP | Cell Signaling Technologies | CST12389S | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
| D1-4G2 flavivirus envelope protein | EMD Millipore | MAB10216 | mouse monoclonal, 1:500 dilution |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technologies | 9661 | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
| 488 anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A-11001 | goat polyclonal, 1:1000 |
| 594 anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-11037 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
| 647 anti-chicken IgY | Thermo Fisher | A-21449 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
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