Ce protocole décrit une technique pour l’observation des temps réel Green Fluorescence Protein (GFP) tag protéines 4 transporteur de Glucose (GLUT4) après stimulation par l’insuline et la caractérisation du rôle biologique de CCR5 dans l’insuline – GLUT4 voie avec la microscopie de déconvolution de signalisation.
Diabète de type 2 (T2DM) est une crise de santé mondiale qui se caractérise par l’insuline signalisation déficience et une inflammation chronique dans les tissus périphériques. L’hypothalamus dans le système nerveux central (SNC) est le centre de contrôle de l’énergie et l’insuline signal réponse règlement. Inflammation chronique des tissus périphériques et des déséquilibres de certaines chimiokines (comme CCL5, TNFα et IL-6) contribuent à l’obésité et de diabète. Cependant, les mécanismes fonctionnels reliant chimiokines et règlement de signal insuline hypothalamique encore demeurent incertains.
Modèles de culture in vitro neurone primaires sont modèles simples et pratiques qui peuvent être utilisées pour étudier les règlement de signal de l’insuline dans les neurones hypothalamiques. Dans cette étude, nous avons introduit exogènes GLUT4 protéine conjuguée avec GFP (GFP-GLUT4) dans les neurones hypothalamiques primaires pour suivre la translocation de membrane GLUT4 lors de la stimulation de l’insuline. Time-lapse images du trafic de la protéine GFP-GLUT4 ont été enregistrées par microscopie de déconvolution, qui permettait aux utilisateurs de générer des images à grande vitesse et à haute résolution sans endommager les neurones significativement tandis que mène l’expérience. La contribution de CCR5 dans la translocation de GLUT4 insuline réglementée a été observée chez neurones hypothalamiques déficients CCR5, qui ont été isolées et cultivées de souris knock-out CCR5. Nos résultats démontrent que l’efficacité de la translocation de membrane GLUT4 est réduite dans les neurones hypothalamiques déficients CCR5 après stimulation par l’insuline.
Diabète de type 2 (T2DM) est une crise de santé mondiale. T2DM se caractérise par l’insuline signalisation déficience et une inflammation chronique dans les tissus périphériques. L’hypothalamus est le centre de contrôle qui régule l’homéostasie énergétique du corps, l’appétit et les rythmes circadiens. Plus important encore, l’hypothalamus est également le médiateur réactivité de signal de l’insuline pour réguler le métabolisme systémique1,2,3,4,5. Perturber l’insuline hypothalamique signalisation voie pouvait induire l’insuline résistance6,7. L’hypothalamus coordonne le statut d’énergie cellulaire et la sécrétion des hormones, comme l’insuline et les adipokines (p. ex., leptine) dans les tissus périphériques, pour réguler le métabolisme du glucose systémique, la réactivité de l’insuline et la prise alimentaire. Fixation de l’insuline pour le récepteur de l’insuline active l’insuline récepteurs substrat (IRS) des protéines qui puis activent molécules signalisation en aval d’insuline, tels que PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) et AKT (protéine kinase B (PKB/AKT)), pour induire la GLUT4 translocation de la membrane. Les neurones ne sont pas la cible majeure pour la captation du glucose en réponse à l’insuline ; Cependant, des niveaux significatifs d’expression GLUT4 ont été identifiés dans la région de noyau arqué hypothalamique (ARC). Par conséquent, le règlement de GLUT4 dans les neurones hypothalamiques jouerait un rôle important dans la signalisation dans l’axe cerveau-périphérique d’insuline.
De nombreuses études ont suggéré que l’inflammation chronique et des chimiokines inflammatoires dans l’hypothalamus également jouent un rôle important dans le développement du diabète et l’obésité, et l’inhibition de l’inflammation hypothalamique peut inverser la résistance à l’insuline induite par l’alimentation 8 , 9 , 10. en outre, chemokine-CCL5 (ligand de motif C-C 5, également connu sous le nom de RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) et ses niveaux de récepteurs CCR5 également mettre en corrélation avec le développement de T2DM11,12. Les rôles de CCL5 et CCR5 dans le métabolisme de l’insuline glucose et fonction restent floues. Une étude a signalé que CCR5 carence protégeait les souris de l’inflammation induite par l’obésité, le recrutement de macrophages et insuline résistance11; en revanche, une autre étude indique que la carence CCR5 entrave systémique au glucose, ainsi que l’insuline musculaires et les adipocytes, signalisation12. CCL5 se trouve à augmenter l’absorption du glucose dans les cellules-T et à réduire la prise alimentaire par le biais de son action sur l’hypothalamus13,14, cependant, les deux le mécanisme d’action et les récepteurs impliqués doivent encore être identifiés.
Il est difficile d’étudier les mécanismes cellulaires qui sous-tendent l’effet d’une inflammation des tissus périphériques sur l’insuline fonctionne dans les neurones hypothalamiques. C’est en raison des réglementations de rétroaction circuit cellulaires hétérogénéité et neuron. Pour cette raison, un modèle de culture in vitro cellule fournit un modèle propre afin d’étudier les effets de la chimiokine sur règlement signal insuline hypothalamique. Bien qu’il y a que beaucoup à établir des lignes des neurones hypothalamiques immortalisés pour la recherche, ces lignées cellulaires ont exprimé différents marqueurs et représentent donc les différents types de neurones hypothalamiques15. Même si les cultures hypothalamiques primaires peuvent être difficiles à maintenir, ils peuvent fournir la réponse la plus réaliste des neurones hypothalamiques lors de la stimulation de l’insuline et peuvent également éviter le potentiel des effets inconnus qui entrent en jeu lors de la maintenance des cellules à long terme dans le milieu de culture avec des facteurs de croissance artificielles.
Dans les présentes, nous utiliser des neurones hypothalamiques primaires du CCR5 knockout (CCR5– / –) souris C57BL/6 souris de type sauvage (WT) et et transfecter les deux types de cellules avec GFP-GLUT4 construct. Afin d’étudier la contribution du CCR5 à insuline véhiculée par GLUT4 membrane traite, GFP-GLUT4 transfectées neurones ont été traités avec l’insuline ou CCL5 recombinante. Ensuite, nous caractériser le mouvement de GFP-GLUT4 sur la membrane plasmique dans des neurones hypothalamiques primaires avec la microscopie de déconvolution.
La capacité de contrôler des cellules vivantes, par stimulation de CCL5 ou de l’insuline, est extrêmement importante pour l’étude de l’effet rapide du CCL5 ou de l’insuline sur mouvement GLUT4. En fait, il nous permet de visualiser la différence significative entre les versions WT et CCR5 neurones hypothalamiques– / – après stimulation par l’insuline. Nous avons effectué l’étiquetage surface des protéines endogènes GLUT4 WT et CCR5 neurones hypothalamiques– / – à des moments différents après stimulation de l’insuline17. Le marquage des protéines de surface cellulaire nécessite haute spécificité anticorps avec faible bruit de fond. En outre, quantification de la fluorescence de surface peut également être difficile et fastidieux. Ainsi, Time-lapse enregistrement nous permet d’être certain que l’effet de la CCL5 ou l’insuline est un vrai changement physiologique issu des conditions expérimentales, et non une variation statistique. Avec surface de marquage de GLUT4 endogène, nous fournissons des preuves solides et expériences pour démontrer comment CCL5 et CCR5 participent à GLUT4 translocation et signalisation de l’insuline.
En biologie cellulaire moderne et des études de biologie moléculaire, de nombreuses expériences nécessitent l’utilisation de la microscopie de fluorescence. Cette technologie permet aux scientifiques de visualiser les relations spatiales entre les protéines et/ou des organites cellulaires, en plus de la direction du mouvement et vitesse, effets stimulants, des changements morphologiques et traite des protéines. Cependant, cette technologie a encore ses limites : lorsque les fluorophores sont excités, les signaux émis par la protéine cible (ou zone) peuvent être accablé par fluorescence de fond. En conséquence, images de fluorescence peuvent apparaître flous avec signaux attendus enterrés profondément dans les signaux de fond. Ce phénomène est particulièrement évident pour l’observation des protéines membranaires.
Total interne réflexion Fluorescence Microscopy (TIRFM) a été mis au point pour surmonter cette difficulté. Il permet aux scientifiques de visualiser l’excitation des fluorophores sélectionnés de surface-bondissent sans affecter les fluorophores de fond. Il permet aux scientifiques caractériser sélectivement les fonctionnalités et les événements sur une région de surface très mince comme une membrane plasmique. La microscopie de déconvolution est une technique qui est rendue possible grâce aux avancées technologiques ces dernières années de traitement d’image par le calcul intensive. Il a été fréquemment utilisé pour améliorer la résolution des images numériques de fluorescence. Tel que mentionné précédemment, lorsque fluorophores sont été excitées par n’importe quel type d’éclairage (par exemple, laser ou LED), fluorochromes émet signaux lumineux sans se soucier si elles sont en discussion, ou non, donc l’image apparaîtra toujours floue. Ce flou est causée par un phénomène appelé « Point Spread Function » (PSF), comme la lumière provenant d’une petite source fluorescente (lueur d’espoir) sera étalé plus loin et devenir flou (blur). En principe, cet événement va produire un signal fluorescent en forme de sablier-like, et une image de fluorescence peut être composée de nombreux ces signaux lumineux. Le processus de déconvolution peut réattribuer tous les signaux de fluorescence à sa forme originale de spot lumineux et éliminer la plupart de la lumière d’out-of-focus pour améliorer le contraste de l’image.
Ces dernières années, les algorithmes de déconvolution ont généré des images avec une résolution comparable à celle d’un microscope confocal. En outre, par rapport à TIRFM, qui empêche out-of-focus flou d’être détecté par une région limitée excitation, microscopie à champ large permet de lumière tous les signaux pour être détectée et réaffecte leur retour à leur source à travers le processus de déconvolution. Par conséquent, dans la pratique, microscopie de déconvolution est devenu non seulement une méthode d’acquisition image plus efficace, mais aussi une méthode plus rentable par rapport à la microscopie FRBR.
The authors have nothing to disclose.
Nous sommes reconnaissants pour les subventions accordées par le ministère de la Science et la technologie, Taiwan – MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3), de santé et de bien-être en supplément des produits du tabac – MOHW106-SAB-B-212-144001 à S-Y C.
DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
Insulin | Actrapid, Denmark | ||
Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |