Questo protocollo descrive una tecnica per osservazione di in tempo reale verde fluorescenza Protein (GFP) contrassegnati 4 di trasportatore del glucosio (GLUT4) proteina traffico su stimolazione dell’insulina e la caratterizzazione del ruolo biologico di CCR5 in insulina – GLUT4 via con microscopia di Deconvolution di segnalazione.
Diabete mellito di tipo 2 (T2DM) è una crisi di salute globale che è caratterizzata dalla segnalazione di danno e infiammazione cronica nei tessuti periferici dell’insulina. L’ipotalamo nel sistema nervoso centrale (SNC) è il centro di controllo per regolazione segnale risposta dell’insulina e di energia. Infiammazione cronica in tessuti periferici e gli squilibri di alcune chemochine (ad esempio CCL5, TNFα e IL-6) contribuire al diabete e obesità. Tuttavia, i meccanismi funzionali collegamento chemochine e regolamento di segnale ipotalamico insulina ancora rimangono poco chiari.
Modelli di coltura in vitro primaria del neurone sono modelli convenienti e semplici che possono essere utilizzati per studiare il regolamento di segnale dell’insulina in neuroni ipotalamici. In questo studio, abbiamo introdotto esogene GLUT4 proteine coniugate con GFP (GFP-GLUT4) in neuroni ipotalamici primari per tenere traccia di traslocazione di membrana GLUT4 stimolazione dell’insulina. Time-lapse immagini di GFP-GLUT4 traffico della proteina sono state registrate da microscopia di deconvoluzione, che permetteva agli utenti di generare immagini ad alta risoluzione e ad alta velocità senza danneggiare i neuroni significativamente durante l’esperimento. Il contributo di CCR5 in insulina regolato GLUT4 traslocazione è stato osservato in neuroni ipotalamici carenti di CCR5, che è stati isolati e coltivati da topi knockout CCR5. I nostri risultati hanno dimostrato che l’efficienza di traslocazione di membrana GLUT4 è stata ridotta in neuroni ipotalamici carenti CCR5 dopo stimolazione dell’insulina.
Diabete mellito di tipo 2 (T2DM) è una crisi sanitaria globale. T2DM è caratterizzata dalla segnalazione di danno e infiammazione cronica nei tessuti periferici dell’insulina. L’ipotalamo è il centro di controllo che regola l’omeostasi energetica del corpo, appetito e ritmi circadiani. La cosa più importante, l’ipotalamo media anche la risposta del segnale dell’insulina per regolare il metabolismo sistemico1,2,3,4,5. Interrompere la segnalazione via potrebbe indurre insulino resistenza6,7ipotalamico dell’insulina. L’ipotalamo coordina lo stato di energia cellulare e la secrezione di ormoni, come l’insulina e adipochine (ad es., leptina) dai tessuti periferici, per regolare il metabolismo del glucosio sistemico, risposta dell’insulina e l’assunzione di cibo. L’insulina si lega al recettore dell’insulina attiva proteine substrato (IRS) del ricevitore dell’insulina, che quindi attivare molecole dell’insulina di segnalazione a valle, ad esempio PI3K (fosfatidilinositolo 3-chinasi) e AKT (proteina chinasi B (PKB/AKT)), per indurre GLUT4 traslocazione di membrana. I neuroni non sono l’obiettivo principale per l’assorbimento del glucosio in risposta all’insulina; Tuttavia, sono stati identificati livelli significativi di GLUT4 espressione della regione di nucleo arcuato ipotalamico (ARC). Pertanto, il regolamento di GLUT4 in neuroni ipotalamici può svolgere un ruolo importante nella segnalazione nell’asse cervello-periferico dell’insulina.
Molti studi hanno suggerito che l’infiammazione cronica e chemochine infiammatorie nell’ipotalamo anche giocare un ruolo importante nello sviluppo del diabete e dell’obesità, e inibizione dell’infiammazione ipotalamica può invertire la resistenza all’insulina indotta da dieta 8 , 9 , 10. Peraltro, chemochine-CCL5 (ligando di motivo C-C 5, noto anche come RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) e i suoi livelli del recettore CCR5 anche correlare con lo sviluppo di T2DM11,12. I ruoli di CCL5 e CCR5 nel metabolismo del glucosio e funzione dell’insulina rimangono poco chiari. Uno studio ha riferito che la carenza di CCR5 topi protetti da infiammazione obesità-indotta, del reclutamento del macrofago e insulino resistenza11; al contrario, un altro studio ha riferito che CCR5 carenza altera la tolleranza al glucosio sistemica, come pure degli adipociti e muscolo segnalazione12dell’insulina. CCL5 è trovato per aumentare l’assorbimento del glucosio in cellule di T e per ridurre l’assunzione di cibo attraverso la sua azione l’ipotalamo13,14, tuttavia, sia il meccanismo d’azione e i recettori coinvolti devono ancora essere identificati.
È difficile studiare i meccanismi cellulari alla base dell’effetto di infiammazione del tessuto periferico sull’insulina funzionamento in neuroni ipotalamici. Si tratta di regolamento feedback di circuito del neurone e della eterogeneità cellulare. Per questo motivo, un modello della coltura cellulare in vitro fornisce un modello pulito per studiare gli effetti della chemochina il regolamento segnale ipotalamico dell’insulina. Sebbene esistano che molte affermate linee cellulari immortalizzate di un neurone ipotalamico per uso di ricerca, queste linee cellulari espressi diversi marcatori e rappresentano pertanto, diversi tipi di neuroni ipotalamici15. Anche se colture primarie ipotalamiche possono essere difficile da mantenere, essi possono fornire la risposta più realistica di neuroni ipotalamici stimolazione dell’insulina e può anche evitare il potenziale effetti sconosciuti che entrano in giocano quando il mantenimento delle cellule a lungo termine nel terreno di coltura con fattori di crescita artificiali.
Nel presente documento, utilizziamo neuroni ipotalamici primari da CCR5 knockout (CCR5– / –) mouse e C57BL/6 wildtype (WT) del mouse e transfect entrambi i tipi di cellule con costruzione GFP-GLUT4. Per studiare il contributo di CCR5 al traffico di membrana GLUT4 insulina mediata, GFP-GLUT4 trasfettati neuroni sono stati trattati con insulina o CCL5 ricombinante. Ci caratterizzano quindi il movimento di GFP-GLUT4 sulla membrana plasmatica in neuroni primari ipotalamici con microscopia di deconvoluzione.
La possibilità di monitorare le cellule vive, su stimolo CCL5 o insulina, è criticamente importante per studiare l’effetto rapido di CCL5 o insulina sul movimento di GLUT4. Infatti, esso ci permette di visualizzare la differenza significativa tra WT e CCR5– / – neuroni ipotalamici stimolazione dell’insulina. Abbiamo eseguito l’etichettatura superficie della proteina endogena di GLUT4 in WT e CCR5– / – neuroni ipotalamici in diversi momenti dopo stimolazione di insulina17. L’etichettatura delle proteine della superficie cellulare richiede alta specificità dell’anticorpo con fondo basso. Inoltre, superficie fluorescenza quantificazione anche può essere impegnativo e richiede tempo. Così, registrazione time-lapse consente di essere certi che l’effetto di CCL5 o l’insulina è un vero cambiamento fisiologico basato su condizioni sperimentali, piuttosto che una variazione statistica. Collaborazione con superficie etichettatura di GLUT4 endogeno, offriamo forti prove ed esperimenti per dimostrare come CCL5 e CCR5 partecipare GLUT4 traslocazione e segnalazione dell’insulina.
In studi di biologia molecolare e biologia cellulare moderno, molti esperimenti richiedono l’utilizzo di microscopia di fluorescenza. Questa tecnologia permette agli scienziati di visualizzare le relazioni spaziali tra proteine e/o organelli cellulari, oltre alla direzione del movimento e velocità, gli effetti stimolatori, i cambiamenti morfologici e traffico della proteina. Tuttavia, questa tecnologia ha ancora il suo limite: quando sono eccitati fluorofori, i segnali emessi dalla proteina bersaglio (o zona) possono essere sopraffatti dalla fluorescenza di fondo. Di conseguenza, immagini di fluorescenza possono apparire sfocate con attesi segnali seppelliti profondo in segnali di fondo. Questo fenomeno è particolarmente evidente per l’osservazione delle proteine di membrana-limitano.
Microscopia di fluorescenza nel riflessione totale interna (TIRFM) è stato sviluppato per superare questa difficoltà. Esso permette agli scienziati di visualizzare l’eccitazione di fluorofori associato a superficie selezionata senza intaccare i fluorofori di sfondo. Esso permette agli scienziati di caratterizzare selettivamente caratteristiche ed eventi su una regione di superficie molto sottile come una membrana plasmatica. Microscopia di deconvoluzione è un’immagine richiede un uso intensivo di elaborazione tecnica che è reso possibile con l’aiuto degli avanzamenti tecnologici negli ultimi anni. È stato spesso utilizzato per migliorare la risoluzione dell’immagine digitale di fluorescenza. Come accennato in precedenza, quando fluorofori sono essere eccitati da qualsiasi tipo di illuminazione (come il laser o LED), tutti i fluorophores emetterà segnali luminosi a prescindere se sono a fuoco o no, quindi l’immagine apparirà sempre sfocata. Questa sfocatura è causato da un fenomeno chiamato “Point Spread Function” (PSF), come luce proveniente da una piccola sorgente fluorescente (punto luminoso) sarà sparso ulteriormente e diventano fuori fuoco (sfocatura). In linea di principio, questo evento produrrà un segnale fluorescente a forma di clessidra-come, e un’immagine di fluorescenza può essere costituita da numerosi tali segnali luminosi. Il processo di deconvoluzione può riassegnare tutti i segnali di fluorescenza alla forma originale spot luminoso ed eliminare la maggior parte della luce, out-of-focus per migliorare il contrasto dell’immagine.
Negli ultimi anni, gli algoritmi di deconvoluzione hanno generato immagini con risoluzione paragonabile a quella di un microscopio confocale. Inoltre, in confronto con TIRFM, che impedisce la out-of-focus blur da essere rilevato da una regione limitata di eccitazione, la microscopia grandangolari permette tutta la luce segnala essere rilevato e li riassegna torna alla loro fonte attraverso il processo di deconvoluzione. Quindi, in pratica, deconvoluzione microscopia è diventata non solo un metodo di acquisizione di immagine più efficiente, ma anche un metodo più conveniente rispetto alla microscopia TIRF.
The authors have nothing to disclose.
Siamo grati per le sovvenzioni fornite dal Ministero della scienza e tecnologia, Taiwan – MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3), salute e benessere a pagamento dei prodotti del tabacco – MOHW106-TDU-B-212-144001 a C. S-Y
DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
Insulin | Actrapid, Denmark | ||
Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |