Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור השגחה של אמת ירוק פלורסצנטיות חלבון (GFP) מתויג גלוקוז טרנספורטר 4 (GLUT4) חלבון סחר על גירוי האינסולין, אפיון התפקיד הביולוגי של CCR5 ב האינסולין – GLUT4 איתות עם מיקרוסקופ Deconvolution.
Abstract
סוכרת סוג 2 (T2DM) הוא משבר הבריאות העולמי אשר מאופיין על ידי אינסולין איתות ליקוי ודלקת כרונית ברקמות היקפיים. ההיפותלמוס במערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא מרכז הבקרה עבור אנרגיה, אינסולין ויסות התגובה האות. דלקת כרונית של רקמות היקפיים וחוסר איזון של נוגדנים מסוימים (כגון CCL5, TNFα ו- IL-6) לתרום סוכרת והשמנה. עם זאת, mechanism(s) תפקודית חיבור נוגדנים ורגולציה אינסולין היפותלמי האות עדיין אינן ברורות.
במבחנה נוירון ראשי תרבות הדוגמניות מודלים נוחה ופשוטה אשר יכול לשמש כדי לחקור אינסולין תקנה אות בנוירונים ההיפותלמוס. במחקר זה, הצגנו exogeneous GLUT4 חלבון מצומדת עם GFP (GFP-GLUT4) לתוך נוירונים היפותלמי העיקרי כדי לעקוב אחר GLUT4 רוברטסונית קרום על גירוי האינסולין. תמונות בצילום מואץ של סחר בבני אדם חלבון ה-GFP-GLUT4 נרשמו על ידי מיקרוסקופ deconvolution, אשר אפשרה למשתמשים להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה במהירות גבוהה ללא פגיעה הנוירונים משמעותית בעת ביצוע הניסוי. התרומה של CCR5 ב אינסולין מוסדר GLUT4 רוברטסונית נצפתה בנוירונים CCR5 לקוי היפותלמי, אשר היו מבודדים ותרבותית של עכברים knockout CCR5. התוצאות שלנו הראו היעילות של טרנסלוקציה ממברנה GLUT4 צומצם בנוירונים היפותלמי לקוי CCR5 לאחר גירוי האינסולין.
Introduction
סוכרת סוג 2 (T2DM) הוא משבר הבריאות העולמי. T2DM מאופיין על ידי אינסולין איתות ליקוי ודלקת כרונית ברקמות היקפיים. ההיפותלמוס הוא מרכז הבקרה המסדירה הומאוסטזיס האנרגיה של הגוף, תיאבון, השעון הביולוגי. והכי חשוב, ההיפותלמוס שמתווכת גם אינסולין התגובה האות לווסת את חילוף החומרים מערכתית1,2,3,4,5. שיבוש היפותלמי אינסולין איתות לשביל שיכולים לזרז אינסולין ההתנגדות6,7. ההיפותלמוס מתאמת מצב האנרגיה התאית, הפרשת הורמונים, כגון אינסולין ו- adipokines (למשל, לפטין) של רקמות היקפיים, כדי לווסת את חילוף החומרים של הגלוקוז מערכתית תגובתיות אינסולין, צריכת המזון. אינסולין מחייב לקולטן האינסולין מפעילה אינסולין קולטן המצע (IRS) חלבונים, אשר לאחר מכן להפעיל מולקולות איתות במורד הזרם של אינסולין, כגון PI3K (phosphatidylinositol 3-קינאז), AKT (חלבון קינאז B (PKB/AKT)), לזירוז GLUT4 טרנסלוקציה ממברנה. נוירונים אינן המטרה העיקרי עבור ספיגת הגלוקוז בתגובה לאינסולין; עם זאת, רמות משמעותיות של GLUT4 ביטוי זוהו באזור arcuate ההיפותלמוס גרעין (ARC). לכן, ברגולציה של GLUT4 בנוירונים היפותלמי עשוי לשחק תפקיד חשוב אינסולין איתות בציר מוח-ציוד היקפי.
מחקרים רבים הראו כי דלקת כרונית של נוגדנים דלקתיות של ההיפותלמוס גם לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות סוכרת והשמנה, עיכוב של דלקת היפותלמי יכול להפוך דיאטה-induced תנגודת לאינסולין 8 , 9 , 10. Moreover, כימוקין-CCL5 (C-C מוטיב ליגנד 5, הידוע גם בשם RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted), רמות קולטן CCR5 שלה גם לתאם עם הפיתוח של T2DM11,12. התפקידים של CCL5 ושל CCR5 חילוף החומרים, פונקציה, גלוקוז, אינסולין נותרו בלתי ברורים. מחקר אחד דיווחו כי מחסור CCR5 מוגן עכברים דלקת הנגרמת השמנת יתר, גיוס macrophage, עמידות לאינסולין11; לעומת זאת, מחקר אחר דיווח כי CCR5 לקוי פוגע גלוקוזה מערכתית, כמו גם אינסולין adipocyte ושרירים איתות12. CCL5 נמצא כדי להגביר את ספיגת הגלוקוז בתאים-T וכדי להפחית את צריכת המזון דרך פעולתה על ההיפותלמוס13,14, לעומת זאת, הן מנגנון הפעולה, קולטני מעורב עדיין זוהו.
קשה ללמוד את המנגנונים התאיים המשמשים כבסיס ההשפעה של דלקת ברקמות היקפיים על האינסולין בתפקוד ההיפותלמוס בנוירונים. זאת בשל הסלולר הטרוגניות נוירון מעגל משוב לתקנות. מסיבה זו, מודל תרבות תא במבחנה מספק מודל נקי כדי לחקור את ההשפעות של כימוקין על תקנה האות ההיפותלמוס אינסולין. למרות שיש רבים הקימו שורות מונצחים תאים עצביים היפותלמי לשימוש מחקר, שורות תאים אלה הביעו סמנים שונים, לכן, מייצגים סוגים שונים של נוירונים היפותלמי-15. אף-על-פי תרבויות היפותלמי ראשי יכול להיות קשה כדי לשמור על, יכול לספק את התגובה ריאליסטי של נוירונים ההיפותלמוס על גירוי האינסולין והם יכולים גם למנוע את האפשרות תופעות לא ידוע, אשר נכנס לשחק בעת שמירה על תאים לטווח ארוך בינוני תרבות עם גורמי גדילה מלאכותית.
במסמך זה, אנו מנצלים נוירונים היפותלמי העיקרי הן C57BL/6 wildtype (WT) עכבר ועכבר CCR5 נוקאאוט (CCR5- / -), transfect שני סוגים של תאים עם GFP-GLUT4 לבנות. כדי לבדוק את התרומה של CCR5 אינסולין מתווכת GLUT4 ממברנה לסחר, נוירונים GFP-GLUT4 transfected טופלו אינסולין או CCL5 רקומביננטי. אנחנו מכן לאפיין את תנועת ה-GFP-GLUT4 על קרום פלזמה בנוירונים היפותלמי ראשי עם מיקרוסקופ Deconvolution.
Protocol
כל הפרוטוקולים ואת שיטות המשמשות המקצועות חיות אושרו על-ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים, שימוש ועדות (IACUC) של האוניברסיטה לרפואה טייפה (פרוטוקול מספרים: LAC-2013-0278; LAC-2015-0397)
1. תרבות נוירון ראשי
- הכנה לפני תרבות
- מעיל המנות תרבות עם פולי-D-ליזין (טבלה 1) יום אחד לפני תרבות. מנה 6-ובכן, הוסיפו 1.5 mL פולי-D-ליזין (0.05 mg/mL) כל טוב. עבור live-הדמיה, התרבות תאים coverslip 12 מ"מ x 12 מ"מ בצלחת 6-ובכן מצופה סטנדרטי.
- הסר/למחזר פולי-D-ליזין ולשטוף את הכלים פעמיים ב 2 מ"ל ddH2O.
- הכנת כלים כירורגיים: זוג מספריים לנתח מיקרו, מעוקל-היטה מלקחיים מלקחיים שקצהו ישר רגיל. סטריליזציה של כלי כירורגי ולשמור אותם ב- 75% אתנול במהלך הניתוח.
- למלא צלחות פטרי 10 ס מ עם 20 מ ל שטיפת בינוני (טבלה 1) ולשמור על קרח.
- למלא מבחנה 15 mL 15 מ"ל שטיפת בינונית ולשמור את הצינורית על קרח.
- בידוד רקמת המוח מאזורים שונים במוח
- להקריב את בת 16-19 יום עכברים נקבה בהריון עם פרוטוקולים סטנדרטיים euthanization על-ידי הצבת עכברים בכלוב ללא מאוורר ולאחר מכן משכר עם CO2. E15.5 ~ E16.5 העוברים מומלץ עבור תרבות עצביים היפותלמי, E16.5 ~ E17.5 הם יותר מתאים בהיפוקמפוס ותרבות עצביים בקליפת המוח.
- לחטא את הפלטפורמה, מיקרוסקופ ויבתר וכלי ניתוח עם 75% אתנול כדי למנוע זיהום.
- חותכים מסביב לאזור הטבור (אזור אדום כהה, קו מפריד, 1B איור 1A) כדי לבודד את הגורים בקלות מבלי לפגוע בהם (איור 1C, ד 1).
- הסרת החלק הראשי של כל pup עם זוג מספריים (איור 1E, F), ולאחר מכן לאבטח את החלק הראשי במקום עם המלקחיים שקצהו בסדר ישר על אזור העיניים (איור 1 ג'י). שימוש אחר בסדר שקצהו מעוקל מלקחיים כדי להסיר את העור החיצוני ואת הגולגולת משני הצדדים, לקלף אותם מן הקדמי לכיוון הגבי (איור 1 H, שחור החץ מצביע לכיוון). המוח צריך להיות מבודד ללא נזק (איור 1I).
הערה: זה חיוני כדי לשמור על היושרה של המוח, כדי להבטיח דיוק כאשר לבודד אזורים שונים של המוח. - לשמור על המוח מבודדים בצלחת פטרי נקי שטיפת קר כקרח בינונית עבור השלבים הבאים.
- הפוך את המוח ולשמור על הצד הבטני. ההיפותלמוס הוא מבנה עגול במרכז המוח (איור 1J, החץ מצביע באזור ההיפותלמוס). לבודד את הרקמה היפותלמי עם מלקחיים מעוקל שקצהו פיין. להסיר את קרומי המוח (אשר יש צבע צהבהב-אדום) בקפידה.
זהירות: הסרה מלאה של קרומי המוח היא שלב קריטי כדי למנוע זיהום פיברובלסט. - להחזיק האונה הריח עם המלקחיים חדה, קילוף קרומי המוח דק המקיף את כל המוח עם המלקחיים מעוקל (איור 1 K, L).
- ההיפוקמפוס הוא צורה דמוי בננה שמוטבע בחלק התחתון של קליפת המוח. פליפ בצד התחתון של קליפת המוח, נפרדות ההיפוקמפוס מאזור הקליפה על-ידי משיכתו לצד עם המלקחיים מעוקל (איור 1 MN, ו- O). הקפד להסיר את כל שאר קרומי המוח מסביב לרקמת המוח.
- כאשר בכל אזורי המוח היה מבודד, קוצצים רקמות אלו את החצוצרות שלה 15 מ"ל המכיל שטיפת קר כקרח בינונית בעזרת המלקחיים (שלב 1.1.5).
הערה: ברקמות המוח יכול להישמר במדיום שטיפת קר כקרח במשך 2-3 h.
- עיכול רקמת, ציפוי ותרבות
- לשטוף את הרקמות על-ידי היפוך הצינור 15 מ"ל המכיל רקמות 2 - 3 פעמים ולאחר מכן לשמור את הצינור ישר כדי לאפשר את רקמות להתיישב (1-3 דקות).
- הסר המדיום העליון באמצעות הזכוכית פסטר פיפטה המחובר למערכת ואקום. לשטוף את הרקמה, להוסיף 15 מ"ל קרח כביסה קרה בינוני, היפוך הצינור 2 - 3 פעמים. חזור על שלבים שטיפת 3 פעמים לפני השלב הבא.
התראה: להיות זהיר של רקמות בחלק התחתון בעת הסרת המדיום העליון באמצעות מערכת ואקום. - לאחר השטיפה הסופית להסיר את המדיום לשטוף בעזרת פיפטה 1 מ"ל.
- דגירה רקמות עם מאגר עיכול פפאין-טריפסין (טבלה 1) בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 7-14 מינימלית טלטול הצינורות כל שתי דקות כדי להבטיח לכל רקמות נחשפים כראוי המאגר לעיכול.
הערה: זמן הדגירה של אמצעי האחסון של מערכת העיכול מאגר ניתן להתאים בהתאם לגודל רקמות. רקמת היפותלמי שנאספו מ- 6-8 גורים, מומלץ 300 µL פפאין-טריפסין עיכול מאגר ו- 7 דקות זמן הדגירה. יותר רקמות ידרוש יותר לעיכול מאגר. - לנטרל את הפעילות של האנזים על-ידי הוספת נפח 1 של העובר סרום שור. מנערת 3 - 5 פעמים בטמפרטורת החדר.
- לשמור את הצינורית על מדפים ולחכות 1-2 דקות לאפשר את רקמות להתיישב; הסר את תגובת שיקוע בזהירות עם פיפטה 1 מ"ל.
- להוסיף 6 מ ל ציפוי בינוני (טבלה 1) לתוך מבחנה ו pipet הרקמה שיהיה 50 פעמים עם פיפטה 5 מ"ל בעדינות (עבור צלחת 6-ובכן, 1.5 mL בינוני ציפוי לכל טוב מומלץ). רוב התאים מביצועם לתוך תאים בודדים לאחר חזר pipetting.
הערה: לנסות למנוע את היווצרות בועות בעת ביצוע שלב זה. רוב מעבדות להשתמש זכוכית האדימו המרעה pipets מביצועם הרקמה. פיפטה 5 מ"ל עם טיפ צר יכול להיות אלטרנטיבה טובה בשלב זה. - לשמור על צינור על המדף ולחכות 1-2 דקות לאפשר הרקמות שמנמנה, האו ם dissociated להתיישב. קח השלב העליון המכיל הפומבית לתאים צינור ו לדלל עם ציפוי בינוני (5 x נפח בינוני ציפוי לכל 1 x נפח התאים חלופה מועדפת. לדוגמה, הוסף 5 מ ל ציפוי בינוני 1 mL הפומבית התאים).
- חישוב צפיפות התאים באמצעות hemocytometer של, זרע את המספר הנדרש של תאים המשקולת תרבות מצופה פולי-D-ליזין כמו שלב 1.1.1. אנו ממליצים על 2-4 x 105 תאים לכל בשביל מנה 6 טוב צלחת/35 מ מ. המליצו על נוירון הדמיה מחקרים. יהיה צורך צפיפות גבוהה יותר של חלבון וניתוחו.
הערה: לא להוסיף יותר מדי ציפוי בינוני, 1-1.5 mL ציפוי במדיום צלחת 6-ובכן אחת מספיקה עבור הקובץ המצורף. כמות מוגזמת של בינוני להאריך את משך הזמן הנדרש עבור הקובץ המצורף התא הנכון. - לחכות 2-3 h וסמנו את הנוירונים הזריעה מתחת למיקרוסקופ. נוירונים יתחיל לצמוח לדלקת בעצה כאשר הם לצרף כראוי.
- להסיר את המדיום ציפוי ולהוסיף 2 מ"ל חימם שטיפת בינוני (37 מעלות צלזיוס) לתוך המנה לשטוף את המדיום ציפוי. חזור על שלב זה פעמיים.
- להוסיף 2 מ"ל תרבות שלמה בינוני (טבלה 1) לבאר כל בצלחת 6-. טוב.
- שנה וחצי של המדיום כל 3-4 ימים. להכין המדיום שלם טרי בכל פעם. נוירונים תרבותי. העכבר שונים במוח אזורים יהיה מורפולוגיה שונה ומאפיינים (איור 2).
2. תקנים של פלסמיד DNA לתוך נוירון העיקרי במערכת ליפוזום
התראה: נוירון תרביות תאים, ערכת טיהור DNA פלסמיד נטולת אנדוטוקסין (טבלת חומרים) מומלץ להכנה הדנ א. משקעים אתנול נוספים ניתן להסיר עודפי הממס ומגבירה את ריכוז הדנ א.
-
ליפוזום מבוססי תקנים DNA בנוירונים העיקרי.
הערה: הזמן תרביות תאים תלוי מצב ההבשלה נדרש בניסויים. הנוירונים היפותלמי היו transfected ב DIV 7-10 (DIV, ימים בתוך חוץ גופית).- DNA: הכנת התערובת ליפוזום: לדלל GFP-GLUT4 פלסמיד דנ א16 (2 µg) ב- microcentrifuge הצינור המכיל 300 µL בסרום נמוך תרבות בינוני. להכין עוד צינור microcentrifuge עם 2 µL ליפוזום במדיום תרבות נמוכה בסרום µL 300 ולאחר תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשלב התוכן של שני צינורות, תקופת דגירה של 20-30 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את המדיום תרבות נוירון המנה תרבות. מוסיפים תערובת הדי-ליפוזום µL 600 לבאר כל, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4-6 שעות.
- לאחר 4-6 ה', להסיר את ה-DNA-ליפוזום התערובת ומוסיפים 2 מ"ל תרבות בינוני.
- אותות פלואורסצנט, כגון ה-GFP לבד וחלבון GLUT4 מצומדת עם התגית GFP (איור 3 ו- 4 באיור), ניתן לצפות לאחר 18-72 h.
3. תמונה הקלטת live
-
הכנת התאים עבור Live הדמיה
- תרבות WT CCR5- / - נוירון היפותלמי ותאי לבטא פלורסצנטיות ירוק חלבון הנקרא נשא גלוקוז 4 (GFP-GLUT4) של 1.5 # (או 0.17 מ מ עובי) coverslip זכוכית אשר כבר מצופה מראש עם פולי-D-ליזין בשלב 1.1.1 בבאר-6 צלחת.
- בזהירות להסיר את coverslips עם הנוירונים באמצעות מלקחיים ומניחים אותו על השקופיות זכוכית בזהירות.
- הסר בינוני/נוזל עודף עם מגבונים המשימה העדינה. מקפלים את המגבונים פעמיים, ומניחים בזהירות על גבי coverslip. לחץ בעדינות כלפי מטה המגבונים מבלי להזיז את coverslip.
שים לב: אל תלחץ את coverslip נגד השקופית זכוכית בכוח. מטרת שלב זה היא להבטיח כי coverslip לא מהלך/להיסחף במהלך ייבוא תמונות הנגרמת על ידי כוח קליל. - הצב coverslips ושקופיות על הבמה מיקרוסקופ deconvolution, עם מול coverslip, וממשיכה מאובטח כראוי. שלב זה נועד להבטיח כי המיקום השקופית נשאר קבוע, כך משתמשים יכולים לעקוב אחר אותה קבוצה של התאים היעד מאוחר יותר.
- להתבונן WT CCR5- / - נוירון היפותלמי תאים עם 60 x / 1.42 ג ' יגה נה שמן טבילה המטרה העדשה.
- מתייחסים הדגימות התא שנבחר עם CCL5 (10 ng/mL) או אינסולין (10 U/mL) עבור µL להוסיף 1.5 מינימלית אחת של אינסולין מדולל על קצה coverslip.
- דמיינו ולהקליט הדגימות התא שנבחר באופן מיידי. לתכנת את תוכנת הקלטת וידאו להקליט למשך 30 דקות.
-
מיקרוסקופ deconvolution וניתוח
הערה: חלק זה של הפרוטוקול מחייב השימוש של מיקרוסקופ deconvolution וכן תוכנות מיוחדות לניתוח.- להפעיל את הכוח של מערכת ההדמייה, לאפשר את הבמה מיקרוסקופ כדי לאתחל כראוי, ולאחר מכן להפוך את מקור האור LED.
- להוסיף שמן טבילה (מקדם שבירה 1.520 עבור דגימות בשידור חי ב 37 מעלות צלזיוס)-60 x 1.42 נה המטרה עדשה. במקום השקופית מדגם על המיקרוסקופ עם coverslip הפונה לכיוון המטרה העדשה, ולאבטח את השקופית כראוי.
- להשתמש תאורה בהירים-שדה או קרינה פלואורסצנטית לזיהוי תאי היעד. התאם את המוקד עד התאים היעד יכול להיות שנצפו בבירור. אל תזיז את העדשה אובייקטיבי מחוץ לאזור coverslip כדי למנוע שריטות מיותרים.
- לזהות ירוק פלורסצנטיות חלבון מצומדת גלוקוז טרנספורטר 4 (GFP-GLUT4) ע י האות ה-GFP. זיהוי התאים היעד הרצוי עבור רכישת התמונה. מיקום תא היעד הנבחר יכול בעל פה לשימוש עתידי (איור 4).
- התקנה נכונה ניסיוני פרמטרים (כולל מספר פיקסלים, עירור גל, אחוז שידור, זמן החשיפה, עובי מחסנית, מרווח זמן ושעה הכולל הדמיה) על כל תא היעד. את הניסוי הזה, המספר פיקסל התמונה היה להגדיר ב- 512 x 512 (ניתן להגדיר ב 1,024 x 1,024 עבור רזולוציה גבוהה יותר) עבור אותות ה-GFP. זמן החשיפה נקבע בין 0.025 עד 0.05 s עבור כל 5 דק קטין לרוחב x, y, ו- z התאמות יכול להיות נשלט על ידי התוכנה המומלצת (חומרים טבלה).
- להגדיר את הפרמטר חשיפה כ 2,000-3,000 ספירות להשגת עוצמה פיקסלים מרבי. כדי למזער photobleaching פלורסצנטיות, להפחית את האחוז של עירור שידור אור ככל האפשר תוך שמירה על חשיפה הזמן חוזר ס' פחות מ- 1 שלבים אלה עבור כל פרופיל נוספים פלורסצנטיות ואזור בודדים בכל עניין.
- להגדיר את הגבול העליון והתחתון של Z-המחסנית בכל תא היעד. זו יכולה להיות מושגת על ידי הזזת השלב מיקרוסקופ עד החלק העליון והחלק התחתון של תא היעד הן מעט מחוץ לפוקוס. המשתמשים ניתן להתאים את הרזולוציה של ציר z על-ידי הגדרת מספר תמונות בין הגבול העליון והתחתון (אשר ניתן לבצע על-ידי הגדרת המרחק בין כל תמונה).
- ערימות של תמונות היו deconvolved, לאחר מכן ניתח בעזרת התוכנה המתאימים – מהירות מ- PerkinElmer במקרה זה.
Representative Results
הנוירונים היפותלמי תרבותי של עכברים זוהו עוד יותר על ידי immunostaining עם חלבונים הקשורים microtubule חלבון ספציפי היפותלמי - נוגדן pro-opiomelanocortin (POMC), סמן עצביים - 2 (MAP2) (איור 2 א). וידאנו שהנוירונים היפותלמי בתרבית העיקרי הביע היפותלמי חלבון POMC... הביטוי של קולטן CCR5, CCL5 בנוירונים היפותלמי היו מזוהות עם נוגדנים ספציפיים ומוענקת משותפת POMC נוגדנים (איור 2 א, 2 ב).
אחרי 3 ימים של culturing, נוירונים היו transfected עם GFP דנ א (איור 3) או GFP מצומדת GLUT4 (איור 4). GFP ביטוי בדרך כלל ניתן למצוא בכל מקום שהתא ללא דפוס מסוים (איור 3) אבל GLUT4-GFP מבטאים כמו מבנה דמוי punctate ציטוזול (איור 4). ערכת תרביות תאים השתמשו במחקר זה אינה השיטה היעילה ביותר עבור נוירון תקנים; עם זאת, היא שיטה מחמירים פחות להישרדות תא טוב יותר לאחר תרביות תאים, אשר תורמת יותר לחיות תאים הדמיה/הקלטה מאוחר יותר. התמונות של נוירונים לביטוי GFP-GLUT4 צולמו לפני זמן לשגות סרטים (איור 4A-B, משלים וידאו 1, 2) על גירוי האינסולין או גירוי CCL5 (איור 4C, משלים 3 וידאו). האותות של ה-GFP, GFP-GLUT4 הם ברור וחזק בנוירונים.
נוירונים היפותלמי עם תרביות תאים GLUT4-GFP טופלו יותר אינסולין (40 U) כדי לאפיין GFP-GLUT4 סחר. Reprehensive קטעי וידאו של GLUT4-GFP תנועה על גירוי האינסולין ב WT והן CCR5- / - היפותלמי נוירונים מוצגים כמו וידאו 1 ו- 2 הסרטונים, בהתאמה.
איור 1: בידוד של רקמות מאזורים שונים במוח העכבר בשלב העוברי (יום 16.5). (י-ם) השלבים המעורבים הפרדת הגורים מן השליה. (E, F) ניתוח ראש כלבלב מן הגוף. (G-אני) הצעדים הכרוכים הבידוד של המוח כולו מהגולגולת. הנקודות חץ שחור כיוון שיש למשוך בעת הסרת הגולגולת באמצעות מלקחיים. (J) בידודו של ההיפותלמוס. החץ השחור נקודות באזור ההיפותלמוס, בין מלקחיים. (K-L) בידוד של קליפת המוח העכבר. הכוכבית השחורה מציינת אזור בקליפת המוח של המוח העכבר, ועל החץ הלבן מצביע על ההפרדה של קליפת מהמוח כל. (M-O) ההפרדה של החלק בהיפוקמפוס מאזור הקליפה. החץ הלבן העליון מסמן את הרקמה בהיפוקמפוס וסימון לבן החץ התחתון הרקמה קורטיקלית. גודל ברים = 1 ס מ (A-F), 200 מיקרומטר (G-O). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: אפיון של ההיפותלמוס סמן עצביים - POMC לבין ביטוי משותף של CCL5 ושל CCR5. נוירונים היפותלמי בתרבית העיקרי (A) הודבקו תוויות עם סמן עצביים היפותלמי - POMC (אדום), הביטוי שיתוף של סמן CCR5 (ירוק), נוירון MAP2 (אפור). (B) CCL5 (ירוק) ביטוי בנוירונים POMC (אדום) חיובי היפותלמי (Adapted מן הנתונים המשלימים של הפניה17). . דאפי בתווית את הגרעין עם צבע כחול. גודל ברים = 50 מיקרומטר ב (א) ו- (ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ביטוי חלבון ה-GFP נוירונים העיקרי העכבר. דנ א פלסמיד GFP transfected לתוך נוירונים העיקרי בתרבית לאחר 4 ימים התרבות (DIV4) עם ליפוזום והביע במשך עוד 3 ימים (DIV7). (A-B) GFP ביטוי לדלקת בעצה והן סומא. (C-D) נוירונים עם תרביות תאים מדומה; דאפי בתווית את הגרעין (B, D). גודל ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: הצילומים של GFP-GLUT4 בנוירונים היפותלמי. (א, ג) חלבון ה-GFP-GLUT4 ביטוי נוירונים היפותלמי Wildtype (WT) ו- (B) CCR5- / - נוירונים ההיפותלמוס. נוירונים היו מגורה עם אינסולין (A, B) או CCL5 (C). החצים להצביע GFP-GLUT4 punctate ב לדלקת בעצה לפני (-) ואחרי (+) אינסולין או גירוי CCL5, כוכביות הצבע GLUT4 משטח-GFP לפני (-) ואחרי (+) CCL5 גירוי ב (ג). (איור משנת הפניה17). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| 5 x Borade מאגר | החברה | מספר קטלוגי | נפח |
| חומצה בורית | סיגמה-אולדריץ | B6768 | 1.55 גר' |
| בורקס | סיגמה-אולדריץ | 71997 | 2.375 g |
| ddH2O | 100 מ | ||
| מסוננים, לשמור ב 4 ° C | |||
| 20 x מניות פולי-D-ליזין | החברה | מספר קטלוגי | נפח |
| פולי-D-ליזין | סיגמה-אולדריץ | P6407 | 100 מ ג |
| ddH2O | 100 מ | ||
| מסוננים, לשמור ב-20 ° C | |||
| 1 x פולי-D-ליזין | נפח | ||
| 20 x פולי-D-ליזין | 5 מ | ||
| 5 x Borade מאגר | 20 מ | ||
| ddH2O | 75 מ | ||
| סה | 100 מ | ||
| לשמור על 4 ° C | |||
| לשטוף בינוני | החברה | מספר קטלוגי | נפח |
| גלוקוז גבוהה DMEM | Gibco | 12800-017 | 495 מ |
| אנטיביוטיקה-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 5 מ |
| סה | 500 מ | ||
| לשמור על 4° C | |||
| פפאין-טריפסין עיכול מאגר: | החברה | מספר קטלוגי | ריכוז אמצעי אחסון/גמר |
| פפאין (10 mg/mL) | סיגמה-אולדריץ | P4762 | µL 200 (2 mg/mL) |
| טריפסין-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-072 | 200 ΜL (0.05%) |
| לשטוף בינוני | 600 ΜL | ||
| סה | 1,000 ΜL | ||
| לשמור ב-20 ° C | |||
| ציפוי בינוני: | החברה | מספר קטלוגי | נפח |
| Neurobasal בינוני | Gibco | 21103-049 | 176 מ |
| סרום שור עוברית | Gibco | 10437-028 | 20 מ |
| L-גלוטמט (200 מ מ) | Gibco | 25030 | 2 מ |
| אנטיביוטיקה-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 2 מ |
| סה | 200 מ | ||
| לשמור על 4 ° C | |||
| בינוני תרבות שלמה | החברה | מספר קטלוגי | נפח |
| Neurobasal בינוני | Gibco | 21103-049 | 95 מ"ל |
| תוספת N2 (100 x) | Gibco | 17502-048 | 1 מ"ל |
| תוספת B27 (50 x) | Gibco | 17504-04 | 2 מ |
| L-גלוטמט (200 מ מ) | Gibco | 25030 | 1 מ"ל |
| אנטיביוטיקה-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 1 מ"ל |
| סה | 100 מ | ||
| טריה |
טבלה 1: עיכול מאגר מדיה, קומפוזיציה השתמשו במחקר זה.
משלים וידאו 1: אינסולין מגורה GFP-GLUT4 בתנועת-הנוירונים היפותלמי WT. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
וידאו משלים 2: אינסולין מגורה GFP-GLUT4 בתנועת-הנוירונים היפותלמי- / - CCR5. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
וידאו משלים 3: CCL5 מגורה GFP-GLUT4 בתנועת-הנוירונים היפותלמי WT (וידאו מ הפניה17). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Discussion
היכולת לפקח על תאים חיים, על גירוי CCL5 או אינסולין, חשוב באורח קשה ללמוד את ההשפעה המהירה של CCL5 או אינסולין GLUT4 התנועה. למעשה, זה מאפשר לנו להמחיש את ההבדל המשמעותי בין WT ו CCR5- / - היפותלמי נוירונים על גירוי האינסולין. לנו יש לבצע תיוג משטח של חלבון GLUT4 אנדוגני בנוירונים WT ו CCR5- / - היפותלמי בנקודות זמן שונות לאחר גירוי האינסולין17. תיוג של חלבונים פני שטח התא מחייב נוגדנים גבוה-ירידה לפרטים עם רקע נמוך. בנוסף, משטח פלורסצנטיות כימות ניתן גם מאתגרת וגם זמן רב. כך, הקלטת זמן לשגות מאפשרת לנו להיות בטוח כי ההשפעה של CCL5 או אינסולין הוא שינוי פיזיולוגי אמיתי המבוסס על תנאי הניסוי, במקום וריאציה סטטיסטי. יחד עם השטח תיוג של GLUT4 אנדוגני, אנו מספקים ראיות חזקות, ניסויים כדי להדגים כיצד CCL5 ו CCR5 להשתתף GLUT4 רוברטסונית אינסולין איתות.
ביולוגיה של התא המודרני ולימודי ביולוגיה מולקולרית, ניסויים רבים דורשים את הניצול של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. טכנולוגיה זו מאפשרת מדענים להמחיש את היחסים המרחביים בין חלבונים ו/או organelles הסלולר, בנוסף בכיוון התנועה ואת מהירות, אפקטים מופחתים, שינויים מורפולוגיים, וסחר חלבון. עם זאת, הטכנולוגיה הזאת עדיין יש הגבלה שלה: כאשר fluorophores מתרגשים, אותות הנפלטים את חלבון המטרה (או אזור) ויכולים להיות בהלם רקע זריחה. כתוצאה מכך, תמונות פלורסצנטיות יכול להיראות מטושטשים עם הצפוי אות קבור עמוק לתוך הרקע אותות. תופעה זו בולטת במיוחד עבור התצפית של חלבוני ממברנה מאוגד.
סה כ פנימי השתקפות פלורסצנטיות מיקרוסקופ (TIRFM) פותחה כדי להתגבר על הקושי הזה. היא מאפשרת למדענים להמחיש את עירור של fluorophores מאוגד השטח שנבחר מבלי להשפיע על רקע fluorophores. היא מאפשרת למדענים לאפיין באופן סלקטיבי תכונות ואירועים על אזור משטח דק מאוד כמו קרום פלזמה. מיקרוסקופ deconvolution היא תמונה שהמפתחות אינטנסיבית עיבוד טכניקה התאפשר בעזרת הפיתוחים הטכנולוגיים של השנים האחרונות. היא הייתה לעתים קרובות ניצלה כדי לשפר את הרזולוציה של התמונה הדיגיטלית קרינה פלואורסצנטית. כפי שהוזכר קודם לכן, כאשר fluorophores להיות שמחים על ידי כל סוג של תאורה (כגון לייזר או LED), fluorophores כל פולט אותות אור ללא קשר אם הם בפוקוס או לא, לכן התמונה תמיד יופיעו מטושטשות. טשטוש נגרמת תופעה הנקראת "נקודת להפיץ" פונקציה (PSF), כמו אור מגיע ממקור פלורסנט קטנות (למזלנו) פרושים עוד יותר ולהיות בפוקוס (טשטוש). בעקרון, אירוע זה יהיה לייצר אות בצורת שעון חול דמוי פלורסנט, תמונת פלורסצנטיות יכול להיות מורכב של רבים אותות אור כזה. תהליך deconvolution יכול להקצות מחדש את כל הסימנים פלורסצנטיות לצורתו המקורית הספוט הבהירים, לחסל את רוב האור out-of-להתמקד כדי לשפר את הניגוד בתמונה.
בשנים האחרונות, אלגוריתמים deconvolution יצרו תמונות עם רזולוציה דומה לזה של מיקרוסקופ קונפוקלי. יתר על כן, בהשוואה TIRFM, אשר מונע out-of-להתמקד טשטוש מגילוי על ידי אזור מוגבל עירור, מיקרוסקופיית שדה רחב מאפשר כל האור אותות להתגלות מקצה מחדש אותם בחזרה למקור שלהם לאורך התהליך deconvolution. לפיכך, בפועל, מיקרוסקופ deconvolution הפך לא רק שיטה יעילה יותר של רכישת התמונה, אלא גם שיטה חסכונית יותר בהשוואה TIRF מיקרוסקופ.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנחנו אסירי תודה על המענקים הניתנים על ידי משרד המדע, הטכנולוגיה, טייוואן - היטל MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3), הבריאות והרווחה של מוצרי טבק - MOHW106-TDU-B-212-144001 S-Y. סי
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
| SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
| VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
| Insulin | Actrapid, Denmark | ||
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
| GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
| Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
| CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
| 12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
| micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
| curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
| 5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |
References
- Levin, B. E., Sherwin, R. S. Peripheral glucose homeostasis: does brain insulin matter? J Clin Invest. 121 (9), 3392-3395 (2011).
- Kleinridders, A., Ferris, H. A., Cai, W., Kahn, C. R. Insulin action in brain regulates systemic metabolism and brain function. Diabetes. 63 (7), 2232-2243 (2014).
- Duarte, A. I., Moreira, P. I., Oliveira, C. R. Insulin in central nervous system: more than just a peripheral hormone. J Aging Res. 2012, 384017 (2012).
- Vogt, M. C., Bruning, J. C. CNS insulin signaling in the control of energy homeostasis and glucose metabolism - from embryo to old age. Trends Endocrinol Metab. 24 (2), 76-84 (2013).
- Plum, L., Schubert, M., Bruning, J. C. The role of insulin receptor signaling in the brain. Trends Endocrinol Metab. 16 (2), 59-65 (2005).
- Lin, X., et al. Dysregulation of insulin receptor substrate 2 in beta cells and brain causes obesity and diabetes. J Clin Invest. 114 (7), 908-916 (2004).
- Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302. J Biol Chem. 279 (34), 35298-35305 (2004).
- Thaler, J. P., Guyenet, S. J., Dorfman, M. D., Wisse, B. E., Schwartz, M. W. Hypothalamic inflammation: marker or mechanism of obesity pathogenesis? Diabetes. 62 (8), 2629-2634 (2013).
- Milanski, M., et al. Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver. Diabetes. 61 (6), 1455-1462 (2012).
- Wang, X., et al. Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet. Exp Diabetes Res. 2012, 847246 (2012).
- Kitade, H., et al. CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status. Diabetes. 61 (7), 1680-1690 (2012).
- Kennedy, A., et al. Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (7), E897-E906 (2013).
- Chan, O., Burke, J. D., Gao, D. F., Fish, E. N. The chemokine CCL5 regulates glucose uptake and AMP kinase signaling in activated T cells to facilitate chemotaxis. J Biol Chem. 287 (35), 29406-29416 (2012).
- Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. Chemokines/intercrines and central regulation of feeding. Am J Physiol. 266 (5 Pt 2), R1711-R1715 (1994).
- Mayer, C. M., Fick, L. J., Gingerich, S., Belsham, D. D. Hypothalamic cell lines to investigate neuroendocrine control mechanisms. Front Neuroendocrinol. 30 (3), 405-423 (2009).
- Lizunov, V. A., et al. Insulin stimulates fusion, but not tethering, of GLUT4 vesicles in skeletal muscle of HA-GLUT4-GFP transgenic mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (8), E950-E960 (2012).
- Chou, S. Y., et al. CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5. Sci Rep. 6, 37659 (2016).
