פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור השגחה של אמת ירוק פלורסצנטיות חלבון (GFP) מתויג גלוקוז טרנספורטר 4 (GLUT4) חלבון סחר על גירוי האינסולין, אפיון התפקיד הביולוגי של CCR5 ב האינסולין – GLUT4 איתות עם מיקרוסקופ Deconvolution.
סוכרת סוג 2 (T2DM) הוא משבר הבריאות העולמי אשר מאופיין על ידי אינסולין איתות ליקוי ודלקת כרונית ברקמות היקפיים. ההיפותלמוס במערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא מרכז הבקרה עבור אנרגיה, אינסולין ויסות התגובה האות. דלקת כרונית של רקמות היקפיים וחוסר איזון של נוגדנים מסוימים (כגון CCL5, TNFα ו- IL-6) לתרום סוכרת והשמנה. עם זאת, mechanism(s) תפקודית חיבור נוגדנים ורגולציה אינסולין היפותלמי האות עדיין אינן ברורות.
במבחנה נוירון ראשי תרבות הדוגמניות מודלים נוחה ופשוטה אשר יכול לשמש כדי לחקור אינסולין תקנה אות בנוירונים ההיפותלמוס. במחקר זה, הצגנו exogeneous GLUT4 חלבון מצומדת עם GFP (GFP-GLUT4) לתוך נוירונים היפותלמי העיקרי כדי לעקוב אחר GLUT4 רוברטסונית קרום על גירוי האינסולין. תמונות בצילום מואץ של סחר בבני אדם חלבון ה-GFP-GLUT4 נרשמו על ידי מיקרוסקופ deconvolution, אשר אפשרה למשתמשים להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה במהירות גבוהה ללא פגיעה הנוירונים משמעותית בעת ביצוע הניסוי. התרומה של CCR5 ב אינסולין מוסדר GLUT4 רוברטסונית נצפתה בנוירונים CCR5 לקוי היפותלמי, אשר היו מבודדים ותרבותית של עכברים knockout CCR5. התוצאות שלנו הראו היעילות של טרנסלוקציה ממברנה GLUT4 צומצם בנוירונים היפותלמי לקוי CCR5 לאחר גירוי האינסולין.
סוכרת סוג 2 (T2DM) הוא משבר הבריאות העולמי. T2DM מאופיין על ידי אינסולין איתות ליקוי ודלקת כרונית ברקמות היקפיים. ההיפותלמוס הוא מרכז הבקרה המסדירה הומאוסטזיס האנרגיה של הגוף, תיאבון, השעון הביולוגי. והכי חשוב, ההיפותלמוס שמתווכת גם אינסולין התגובה האות לווסת את חילוף החומרים מערכתית1,2,3,4,5. שיבוש היפותלמי אינסולין איתות לשביל שיכולים לזרז אינסולין ההתנגדות6,7. ההיפותלמוס מתאמת מצב האנרגיה התאית, הפרשת הורמונים, כגון אינסולין ו- adipokines (למשל, לפטין) של רקמות היקפיים, כדי לווסת את חילוף החומרים של הגלוקוז מערכתית תגובתיות אינסולין, צריכת המזון. אינסולין מחייב לקולטן האינסולין מפעילה אינסולין קולטן המצע (IRS) חלבונים, אשר לאחר מכן להפעיל מולקולות איתות במורד הזרם של אינסולין, כגון PI3K (phosphatidylinositol 3-קינאז), AKT (חלבון קינאז B (PKB/AKT)), לזירוז GLUT4 טרנסלוקציה ממברנה. נוירונים אינן המטרה העיקרי עבור ספיגת הגלוקוז בתגובה לאינסולין; עם זאת, רמות משמעותיות של GLUT4 ביטוי זוהו באזור arcuate ההיפותלמוס גרעין (ARC). לכן, ברגולציה של GLUT4 בנוירונים היפותלמי עשוי לשחק תפקיד חשוב אינסולין איתות בציר מוח-ציוד היקפי.
מחקרים רבים הראו כי דלקת כרונית של נוגדנים דלקתיות של ההיפותלמוס גם לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות סוכרת והשמנה, עיכוב של דלקת היפותלמי יכול להפוך דיאטה-induced תנגודת לאינסולין 8 , 9 , 10. Moreover, כימוקין-CCL5 (C-C מוטיב ליגנד 5, הידוע גם בשם RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted), רמות קולטן CCR5 שלה גם לתאם עם הפיתוח של T2DM11,12. התפקידים של CCL5 ושל CCR5 חילוף החומרים, פונקציה, גלוקוז, אינסולין נותרו בלתי ברורים. מחקר אחד דיווחו כי מחסור CCR5 מוגן עכברים דלקת הנגרמת השמנת יתר, גיוס macrophage, עמידות לאינסולין11; לעומת זאת, מחקר אחר דיווח כי CCR5 לקוי פוגע גלוקוזה מערכתית, כמו גם אינסולין adipocyte ושרירים איתות12. CCL5 נמצא כדי להגביר את ספיגת הגלוקוז בתאים-T וכדי להפחית את צריכת המזון דרך פעולתה על ההיפותלמוס13,14, לעומת זאת, הן מנגנון הפעולה, קולטני מעורב עדיין זוהו.
קשה ללמוד את המנגנונים התאיים המשמשים כבסיס ההשפעה של דלקת ברקמות היקפיים על האינסולין בתפקוד ההיפותלמוס בנוירונים. זאת בשל הסלולר הטרוגניות נוירון מעגל משוב לתקנות. מסיבה זו, מודל תרבות תא במבחנה מספק מודל נקי כדי לחקור את ההשפעות של כימוקין על תקנה האות ההיפותלמוס אינסולין. למרות שיש רבים הקימו שורות מונצחים תאים עצביים היפותלמי לשימוש מחקר, שורות תאים אלה הביעו סמנים שונים, לכן, מייצגים סוגים שונים של נוירונים היפותלמי-15. אף-על-פי תרבויות היפותלמי ראשי יכול להיות קשה כדי לשמור על, יכול לספק את התגובה ריאליסטי של נוירונים ההיפותלמוס על גירוי האינסולין והם יכולים גם למנוע את האפשרות תופעות לא ידוע, אשר נכנס לשחק בעת שמירה על תאים לטווח ארוך בינוני תרבות עם גורמי גדילה מלאכותית.
במסמך זה, אנו מנצלים נוירונים היפותלמי העיקרי הן C57BL/6 wildtype (WT) עכבר ועכבר CCR5 נוקאאוט (CCR5– / –), transfect שני סוגים של תאים עם GFP-GLUT4 לבנות. כדי לבדוק את התרומה של CCR5 אינסולין מתווכת GLUT4 ממברנה לסחר, נוירונים GFP-GLUT4 transfected טופלו אינסולין או CCL5 רקומביננטי. אנחנו מכן לאפיין את תנועת ה-GFP-GLUT4 על קרום פלזמה בנוירונים היפותלמי ראשי עם מיקרוסקופ Deconvolution.
היכולת לפקח על תאים חיים, על גירוי CCL5 או אינסולין, חשוב באורח קשה ללמוד את ההשפעה המהירה של CCL5 או אינסולין GLUT4 התנועה. למעשה, זה מאפשר לנו להמחיש את ההבדל המשמעותי בין WT ו CCR5– / – היפותלמי נוירונים על גירוי האינסולין. לנו יש לבצע תיוג משטח של חלבון GLUT4 אנדוגני בנוירונים WT ו CCR5– / – היפותלמי בנקודות זמן שונות לאחר גירוי האינסולין17. תיוג של חלבונים פני שטח התא מחייב נוגדנים גבוה-ירידה לפרטים עם רקע נמוך. בנוסף, משטח פלורסצנטיות כימות ניתן גם מאתגרת וגם זמן רב. כך, הקלטת זמן לשגות מאפשרת לנו להיות בטוח כי ההשפעה של CCL5 או אינסולין הוא שינוי פיזיולוגי אמיתי המבוסס על תנאי הניסוי, במקום וריאציה סטטיסטי. יחד עם השטח תיוג של GLUT4 אנדוגני, אנו מספקים ראיות חזקות, ניסויים כדי להדגים כיצד CCL5 ו CCR5 להשתתף GLUT4 רוברטסונית אינסולין איתות.
ביולוגיה של התא המודרני ולימודי ביולוגיה מולקולרית, ניסויים רבים דורשים את הניצול של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. טכנולוגיה זו מאפשרת מדענים להמחיש את היחסים המרחביים בין חלבונים ו/או organelles הסלולר, בנוסף בכיוון התנועה ואת מהירות, אפקטים מופחתים, שינויים מורפולוגיים, וסחר חלבון. עם זאת, הטכנולוגיה הזאת עדיין יש הגבלה שלה: כאשר fluorophores מתרגשים, אותות הנפלטים את חלבון המטרה (או אזור) ויכולים להיות בהלם רקע זריחה. כתוצאה מכך, תמונות פלורסצנטיות יכול להיראות מטושטשים עם הצפוי אות קבור עמוק לתוך הרקע אותות. תופעה זו בולטת במיוחד עבור התצפית של חלבוני ממברנה מאוגד.
סה כ פנימי השתקפות פלורסצנטיות מיקרוסקופ (TIRFM) פותחה כדי להתגבר על הקושי הזה. היא מאפשרת למדענים להמחיש את עירור של fluorophores מאוגד השטח שנבחר מבלי להשפיע על רקע fluorophores. היא מאפשרת למדענים לאפיין באופן סלקטיבי תכונות ואירועים על אזור משטח דק מאוד כמו קרום פלזמה. מיקרוסקופ deconvolution היא תמונה שהמפתחות אינטנסיבית עיבוד טכניקה התאפשר בעזרת הפיתוחים הטכנולוגיים של השנים האחרונות. היא הייתה לעתים קרובות ניצלה כדי לשפר את הרזולוציה של התמונה הדיגיטלית קרינה פלואורסצנטית. כפי שהוזכר קודם לכן, כאשר fluorophores להיות שמחים על ידי כל סוג של תאורה (כגון לייזר או LED), fluorophores כל פולט אותות אור ללא קשר אם הם בפוקוס או לא, לכן התמונה תמיד יופיעו מטושטשות. טשטוש נגרמת תופעה הנקראת “נקודת להפיץ” פונקציה (PSF), כמו אור מגיע ממקור פלורסנט קטנות (למזלנו) פרושים עוד יותר ולהיות בפוקוס (טשטוש). בעקרון, אירוע זה יהיה לייצר אות בצורת שעון חול דמוי פלורסנט, תמונת פלורסצנטיות יכול להיות מורכב של רבים אותות אור כזה. תהליך deconvolution יכול להקצות מחדש את כל הסימנים פלורסצנטיות לצורתו המקורית הספוט הבהירים, לחסל את רוב האור out-of-להתמקד כדי לשפר את הניגוד בתמונה.
בשנים האחרונות, אלגוריתמים deconvolution יצרו תמונות עם רזולוציה דומה לזה של מיקרוסקופ קונפוקלי. יתר על כן, בהשוואה TIRFM, אשר מונע out-of-להתמקד טשטוש מגילוי על ידי אזור מוגבל עירור, מיקרוסקופיית שדה רחב מאפשר כל האור אותות להתגלות מקצה מחדש אותם בחזרה למקור שלהם לאורך התהליך deconvolution. לפיכך, בפועל, מיקרוסקופ deconvolution הפך לא רק שיטה יעילה יותר של רכישת התמונה, אלא גם שיטה חסכונית יותר בהשוואה TIRF מיקרוסקופ.
The authors have nothing to disclose.
אנחנו אסירי תודה על המענקים הניתנים על ידי משרד המדע, הטכנולוגיה, טייוואן – היטל MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3), הבריאות והרווחה של מוצרי טבק – MOHW106-TDU-B-212-144001 S-Y. סי
DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
Insulin | Actrapid, Denmark | ||
Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |