Summary
هذا البروتوكول وصف تقنية للمراقبة في الوقت الحقيقي الأخضر Fluorescence البروتين (بروتينات فلورية خضراء) معلم البروتين الجلوكوز الناقل 4 (GLUT4) الاتجار بالأشخاص على تحفيز الأنسولين وتوصيف دور CCR5 البيولوجية في الأنسولين – GLUT4 يشير إلى مسار مع Deconvolution مجهرية.
Abstract
نوع 2 داء السكري (T2DM) هو أزمة صحية عالمية التي تتميز بالانسولين مما يشير إلى ضعف والتهاب مزمن في الأنسجة المحيطية. تحت المهاد في الجهاز العصبي المركزي (CNS) هو مركز التحكم للطاقة، والإنسولين إشارة استجابة النظام. التهاب مزمن في الأنسجة المحيطية والاختلالات من المستقطبات معينة (مثل CCL5، TNFα، وايل-6) المساهمة في مرض السكري والسمنة. ومع ذلك، أن الآليات الوظيفية يربط بين المستقطبات والإنسولين طائي إشارة التنظيم لا تزال لا تزال غير واضحة.
في المختبر العصبية الأولية ثقافة النماذج هي نماذج بسيطة ومريحة التي يمكن استخدامها للتحقيق في لائحة إشارة الأنسولين في الخلايا العصبية طائي. في هذه الدراسة، أدرجنا اكسوجينيوس GLUT4 البروتين مترافق مع التجارة والنقل (بروتينات فلورية خضراء-GLUT4) في الخلايا العصبية طائي الأولية لتعقب GLUT4 غشاء إزفاء إلى تحفيز الأنسولين. الوقت الفاصل بين الصور للتجارة والنقل-GLUT4 البروتين الاتجار سجلت deconvolution المجهري، مما يسمح للمستخدمين لتوليد صور عالية الجودة والسرعة دون إتلاف الخلايا العصبية إلى حد كبير أثناء إجراء التجربة. ولوحظ مساهمة CCR5 في الأنسولين وينظم GLUT4 إزفاء في CCR5 ناقصة طائي الخلايا العصبية، التي كانت معزولة ومثقف من الفئران خروج المغلوب CCR5. أظهرت النتائج التي توصلنا إليها أن خفض كفاءة إزفاء غشاء GLUT4 في الخلايا العصبية طائي ناقص CCR5 بعد تحفيز الأنسولين.
Introduction
نوع 2 داء السكري (T2DM) أزمة صحية عالمية. وتتميز T2DM بالانسولين مما يشير إلى ضعف والتهاب مزمن في الأنسجة المحيطية. تحت المهاد هو مركز التحكم الذي ينظم التوازن الطاقة في الجسم والشهية وايقاعات سيركاديان. الأهم من ذلك، تحت المهاد أيضا يتوسط الأنسولين إشارة استجابة لتنظيم الأيض النظامية1،2،3،،من45. تعطيل الأنسولين طائي مما يشير إلى مسار يمكن أن تحفز الأنسولين المقاومة6،7. تحت المهاد ينسق مركز الطاقة الخلوية وإفراز الهرمونات، مثل الأنسولين وأديبوكينيس (مثلاً، اللبتين) من الأنسجة المحيطية، تنظيم استقلاب الجلوكوز النظمية، واستجابة الأنسولين، وتناول الطعام. ينشط الأنسولين ملزمة لمستقبلات الأنسولين الأنسولين مستقبلات الركازة (IRS) البروتينات، وقم بتنشيط جزيئات الأنسولين مما يشير إلى المصب، مثل PI3K (فوسفاتيديلينوسيتول 3-كيناز) وعكة (بروتين كيناز ب (حزب/AKT))، لحمل GLUT4 إزفاء الغشاء. الخلايا العصبية ليست هدفا رئيسيا لامتصاص الجلوكوز في الاستجابة للأنسولين؛ ومع ذلك، قد حددت مستويات كبيرة من التعبير GLUT4 في منطقة طائي arcuate نواة (ARC). ولذلك، تنظيم GLUT4 في الخلايا العصبية طائي قد تلعب دوراً مهما في الأنسولين إشارات في محور الدماغ-الطرفية.
اقترحت العديد من الدراسات أن التهاب مزمن والتهاب المستقطبات في تحت المهاد أيضا دوراً هاما في تطوير مرض السكري والسمنة، وتثبيط الالتهاب طائي يمكن عكس مقاومة الأنسولين الناجمة عن النظام الغذائي 8 , 9 , 10-وعلاوة على ذلك، تشيموكيني-CCL5 (ج-C الحافز يجند 5، يعرف أيضا باسم رنتيس، ريجولاتيدوناكتيفاتيوننورمالتسيليكسبريسيداندسيكريتيد) ومستويات مستقبلات CCR5 ترتبط أيضا بتطوير T2DM11،12. أدوار CCL5 و CCR5 في الأيض وظيفة والجلوكوز الأنسولين لا تزال غير واضحة. أفادت إحدى الدراسات أن نقص CCR5 حماية الفئران من الالتهابات الناجمة عن السمنة والتوظيف بلعم الأنسولين المقاومة11؛ وفي المقابل، أفادت دراسة أخرى أن نقص CCR5 يضعف تحمل الجلوكوز النظامية، فضلا عن الأنسولين adipocyte والعضلات مما يشير إلى12. تم العثور على CCL5 لزيادة امتصاص الجلوكوز في خلايا تي ولتقليل تناول الطعام من خلال عملها في تحت المهاد13،14، غير أن إليه العمل والمستقبلات المعنية لم يتم بعد تحديد.
من الصعب دراسة الآليات الخلوية الكامنة وراء تأثير التهاب الأنسجة الطرفية على الأنسولين في الخلايا العصبية طائي. هذا سبب الأنظمة ردود فعل الدوائر عدم التجانس والعصبية الخلوية. ولهذا السبب، نموذج ثقافة خلايا في المختبر نموذجا نظيفة للتحقيق في آثار تشيموكيني على الأنسولين طائي إشارة التنظيم. على الرغم من أن هناك العديد من إنشاء خطوط الخلايا العصبية طائي مخلدة لاستخدام البحث، هذه خطوط الخلايا علامات مختلفة وأعرب عن، وتمثل بالتالي، أنواع مختلفة من الخلايا العصبية طائي15. على الرغم من أن الثقافات طائي الأولية يمكن أن تكون صعبة للحفاظ على، يمكن توفير الاستجابة الأكثر واقعية للخلايا العصبية طائي على تحفيز الأنسولين، ويمكن أيضا تجنب احتمال تأثيرات غير معروف التي تأتي في اللعب عندما الحفاظ على الخلايا الأجل المتوسط والثقافة مع عوامل النمو الصناعي.
هنا، علينا الاستفادة من الخلايا العصبية طائي الأولية من الماوس wildtype (WT) C57BL/6 وخروج المغلوب CCR5 (CCR5-/-) الماوس، وترانسفيكت كلا النوعين من الخلايا التي تحتوي على بروتينات فلورية خضراء-GLUT4 بناء. للتحقيق في مساهمة CCR5 GLUT4 الأنسولين بوساطة غشاء الاتجار، يعاملون بروتينات فلورية خضراء-GLUT4 transfected الخلايا العصبية مع الأنسولين أو CCL5 المؤتلف. ثم أننا تميز حركة التجارة والنقل-GLUT4 في غشاء البلازما في الخلايا العصبية طائي الأولية مع Deconvolution مجهرية.
Protocol
الموافقة على جميع البروتوكولات والأساليب المستخدمة في المواد الحيوانية "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجان (إياكوك) من جامعة الطب تايبيه (البروتوكول الأرقام: أمريكا اللاتينية والكاريبي-2013-0278؛ LAC-2015-0397)
1. ثقافة العصبية الأولية
- التحضير قبل الثقافة
- معطف أطباق الثقافة مع بولي-د-يسين (الجدول 1) يوم واحد قبل الثقافة. لطبق 6-حسنا، إضافة 1.5 مل بولي-د-يسين (0.05 مغ/مل) في كل بئر. للعيش-التصوير، ثقافة الخلايا الموجودة على ساترة 12 ملم × 12 ملم في صفيحة 6-جيدا مغلفة قياسية.
- إزالة/إعادة تدوير بولي-د-يسين وغسل الأطباق مرتين مع 2 مل ddH2o.
- إعداد الأدوات الجراحية: زوج من مقص تشريح الصغرى والملقط ذات الرؤوس المنحنية والملقط القياسية ذات الرؤوس على التوالي. تعقيم الأدوات الجراحية وإبقائهم في الإيثانول 75% أثناء الجراحة.
- ملء أطباق بيتري 10 سم مع 20 مل أغسل المتوسطة (الجدول 1) والحفاظ على الجليد.
- ملء أنبوب اختبار 15 مل مع 15 مل أغسل المتوسطة وإبقاء الأنبوب على الجليد.
- عزل أنسجة المخ من مناطق الدماغ المختلفة
- التضحية الفئران الإناث الحوامل يوم 16-19 القديمة مع البروتوكولات القياسية يوثانيزيشن عن طريق وضع الفئران في قفص غير التهوية ثم التسمم بأول أكسيد الكربون2. E15.5 ~ E16.5 الأجنة ينصح لثقافة العصبية طائي و E16.5 ~ E17.5 أكثر ملاءمة لثقافة العصبية هيبوكامبال والقشرية.
- تعقيم منصة ومجهر تشريح وأدوات الجراحة مع الإيثانول 75% لتجنب التلوث.
- قص حول منطقة الحبل السري (المنطقة الحمراء الداكنة، الشكل 1A، 1B خط متقطع) لعزل الجراء سهولة دون الأضرار بها (الشكل 1، 1 د).
- إزالة الجزء الرئيسي من كل ألجرو مع زوج من المقص (الشكل 1E، و)، ثم تأمين الجزء الرئيسي في مكان استخدام الملقط مستقيم غرامة ذات الرؤوس لمنطقة العين (الشكل 1). استخدام آخر غرامة مقلوب منحنى الملقط إزالة الجلد الخارجي والجمجمة من الجانبين وتقشر من الأمامي في اتجاه الظهرية (الشكل 1 ح، أسود يشير السهم إلى الاتجاه). ينبغي أن يكون الدماغ معزولة دون أي ضرر (1I الشكل).
ملاحظة: من الضروري المحافظة على سلامة الدماغ لضمان الدقة عند عزل مناطق مختلفة من الدماغ. - تبقى العقول معزولة في طبق بتري نظيفة مع المتوسطة يغسل المثلج للخطوات التالية.
- الوجه الدماغ والحفاظ على الجانب البطني. تحت المهاد بنية جولة في وسط الدماغ (الشكل 1J، يشير السهم إلى منطقة طائي). عزل الأنسجة طائي مع الملقط منحنى يميل الجميلة. إزالة السحايا (ذات لون أحمر مصفر) بعناية.
تنبيه: الإزالة الكاملة للسحايا خطوة حاسمة لتفادي التلوث تنتجها الخلايا الليفية. - عقد الفص شمي مع الملقط حادة وتقشر السحايا رقيقة المحيطة بالدماغ كله مع الملقط المنحنى (الشكل 1 K, L).
- الحصين هو شكل مثل الموز التي مضمن في الجزء السفلي من القشرة. الوجه إلى الجانب السفلي القشرة وفصل الحصين من القشرة بسحبه إلى الجانب مع الملقط المنحنى (الشكل 1 M، N، و O). تأكد من إزالة جميع السحايا المتبقية المحيطة بأنسجة المخ.
- عندما تم عزل جميع المناطق من الدماغ، ختم هذه الأنسجة في أنابيب 15 مل تحتوي على المتوسط يغسل المثلج بمساعدة الملقط (الخطوة 1.1.5).
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بأنسجة المخ في المتوسط يغسل المثلج ح 2-3.
- هضم الأنسجة، والطلاء والثقافة
- شطف الأنسجة بعكس أنبوب 15 مل الأنسجة التي تحتوي على 2-3 مرات، ومن ثم الاحتفاظ الأنبوب مستقيم للسماح للأنسجة ليستقر (1-3 دقيقة).
- إزالة المتوسطة العليا استخدام الزجاج ماصة باستور يعلق على نظام فراغ. غسل الأنسجة، إضافة 15 مل الجليد الغسيل البارد المتوسطة وعكس الأنبوب 2-3 مرات. كرر الخطوات الغسيل 3 مرات قبل الخطوة التالية.
تنبيه: أن تكون حذرة من الأنسجة في الجزء السفلي عند إزالة المتوسطة العليا باستخدام نظام الشفط. - بعد الغسيل النهائي، إزالة المتوسطة يغسل بمساعدة ماصة 1 مل.
- احتضان الأنسجة مع غراء-التربسين هضم المخزن المؤقت (الجدول 1) في حمام مائي 37 درجة مئوية ل 7-14 دقيقة يهز أنابيب كل دقيقة اثنين لضمان جميع الأنسجة تتعرض بشكل صحيح إلى المخزن المؤقت الهضم.
ملاحظة: وقت الحضانة وحجم المخزن المؤقت الهضم يمكن تعديلها استناداً إلى حجم الأنسجة. لطائي الأنسجة التي تم جمعها من 6-8 الجراء، ينصح 300 ميليلتر باباين-التربسين الهضم المخزن المؤقت ودقيقة 7 الحضانة مرة. سيتطلب المزيد من الأنسجة أكثر الهضم العازلة. - تحييد نشاط إنزيم بإضافة 1 حجم الجنين المصل البقري. اهتز أنبوبة الاختبار 3-5 مرات في درجة حرارة الغرفة.
- إبقاء الأنبوب على الرفوف، والانتظار لمدة 1-2 دقيقة للسماح للأنسجة ليستقر؛ إزالة المادة طافية بعناية مع ماصة 1 مل.
- إضافة 6 مل تصفيح المتوسطة (الجدول 1) في أنبوبة الاختبار وبيبيت الأنسجة صعودا ونزولاً 50 مرة مع ماصة 5 مل بلطف (للوحة 6، حسنا، 1.5 مل تصفيح المتوسطة الواحدة وكذلك هو مستحسن). وسوف ننأى بمعظم الخلايا في الخلايا المفردة بعد تكرار بيبيتينج.
ملاحظة: في محاولة لتجنب تكوين فقاعات أثناء قيامها بهذه الخطوة. تستخدم معظم المختبرات الزجاج ملتهب المراعي بيبيتس أن تنأى بالانسجة. ماصة 5 مل مع تلميح ضيقة يمكن أن يكون بديلاً جيدا لهذه الخطوة. - الاحتفاظ أنبوب على الرف، والانتظار لمدة 1-2 دقيقة للسماح للأنسجة مكتنزة، غير معزولة ليستقر. تأخذ المرحلة العليا التي تحتوي على فصل الخلايا إلى أنبوب جديد وتمييع مع تصفيح المتوسطة (5 × المتوسطة تصفيح حجم الواحدة 1 x حجم الخلايا منفصلان. على سبيل المثال، إضافة 5 مل تصفيح متوسطة 1 مل فصل الخلايا).
- حساب كثافة الخلية باستخدام هيموسيتوميتير والبذور العدد المطلوب من الخلايا إلى لوحة الثقافة المغلفة مع بولي-د-يسين كما في الخطوة 1.1.1. ونحن نوصي 2-4 × 105 خلايا كل بئر لطبق طبق جيدا 6/35 مم وأوصى بالتصوير الدراسات العصبية. يتطلب كثافة أعلى للبروتين جمع وتحليل.
ملاحظة: لا تضيف الكثير المتوسطة الطلاء، 1-1.5 مل تصفيح المتوسطة في صحن واحد 6-جيدا ما يكفي لمرفق. سوف يطيل كمية زائدة من متوسط الوقت اللازم لمرفق الخلية الصحيحة. - انتظر ح 2-3 والتحقق من الخلايا العصبية المبذورة تحت المجهر. سوف تبدأ الخلايا العصبية لنمو العصب عند توليها بشكل صحيح.
- إزالة المتوسطة والطلاء وإضافة 2 مل ارتفعت درجة حرارة الغسيل المتوسطة (37 درجة مئوية) في الطبق يغسل المتوسطة والطلاء. كرر هذه الخطوة مرتين.
- إضافة 2 مل كامل الثقافة المتوسطة (الجدول 1) إلى كل بئر في الطبق 6-جيدا.
- تغيير نصف المتوسط كل 3-4 أيام. إعداد متوسطة كاملة طازجة في كل مرة. سوف يكون مثقف من مناطق الدماغ ماوس مختلفة من الخلايا العصبية مورفولوجية مختلفة وخصائص (الشكل 2).
2-تعداء بلازميد الحمض النووي في الخلايا العصبية الأولية مع نظام الحويصلية
تنبيه: تعداء الخلايا العصبية، ينصح مجموعة مواد تنقية الحمض النووي بلازميد خالية من الذيفان (جدول المواد) لإعداد الحمض النووي. يمكن إزالة الزائدة مذيب الإيثانول إضافية هطول الأمطار ويعزز تركيز الحمض النووي.
-
على أساس الحويصلية تعداء الحمض النووي في الخلايا العصبية الأولية.
ملاحظة: يعتمد الوقت تعداء على حالة النضج المطلوب في التجارب. تم transfected الخلايا العصبية طائي في شعبة 7-10 (DIV، أيام في المختبر).- الحمض النووي: إعداد مزيج الحويصلية: تمييع بروتينات فلورية خضراء-GLUT4 بلازميد الحمض الخلوي الصبغي16 (2 ميكروغرام) في ميكروسينتريفوجي الأنبوبة التي تحتوي على 300 ميليلتر المصل منخفضة الثقافة المتوسطة. إعداد آخر أنبوب ميكروسينتريفوجي مع 2 ميليلتر الحويصلية في 300 ميليلتر المصل منخفضة الثقافة المتوسطة، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- دمج محتويات كلا أنابيب واحتضان لمدة 20-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة المتوسطة ثقافة العصبية من طبق الثقافة. إضافة 600 خليط الحمض النووي-الحويصلية ميليلتر في كل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية ح 4-6.
- بعد 4-6 ح، إزالة خليط الحمض النووي-الحويصلية وإضافة 2 مل الثقافة المتوسطة.
- ويمكن ملاحظة إشارات الفلورية، مثل GLUT4 البروتين مترافق مع العلامة التجارة والنقل (الشكل 3 و الشكل 4)، والتجارة والنقل وحدها بعد 18-72 ساعة.
3-تسجيل صورة العيش
-
تعيش إعداد الخلايا للتصوير
- الثقافة WT CCR5-/- طائي العصبية الخلايا والإعراب عن البروتينات الفلورية الخضراء المسمى جلوكوز الناقل 4 (التجارة والنقل-GLUT4) على #1.5 (أو سمك 0.17 ملم) ساترة الزجاج الذي تم مسبقاً المغلفة مع بولي-د-يسين في الخطوة 6-البئر 1.1.1 لوحة.
- بعناية إزالة كوفيرسليبس مع استخدام الملقط من الخلايا العصبية ووضعه على الشرائح الزجاجية بحذر.
- إزالة الزائدة المتوسطة/سائل مع مناديل المهمة الحساسة. طي مناديل مرتين، ووضعها بعناية على رأس ساترة. اضغط برفق إلى أسفل المناديل دون الانتقال ساترة.
تنبيه: لا تضغط ساترة ضد الشريحة الزجاجية عنوة. والغرض من هذه الخطوة هو التأكد من أن ساترة عدم نقل/الانجراف أثناء الحصول على الصور الناتجة عن قوة الطفو. - ضع كوفيرسليبس والشرائح في مرحلة مجهر deconvolution، مع مواجهة ساترة لأسفل، والمضمون بشكل صحيح. هذه الخطوة لضمان أن يظل موقف الشريحة ثابتة حيث يمكن للمستخدمين تتبع نفس مجموعة من الخلايا المستهدفة في وقت لاحق.
- مراقبة وزن و CCR5-/- العصبية طائي الخلايا مع 60 x/1.42 غ النفط غمر عدسة الهدف.
- التعامل مع العينات الخلية المحددة مع CCL5 (10 نانوغرام/مل) أو الأنسولين (10 U/mL) لدقيقة واحدة إضافة 1.5 ميليلتر للأنسولين المخفف على حافة ساترة.
- تصور وتسجيل العينات الخلية المحددة فورا. برنامج برنامج تسجيل الفيديو لتسجيل مدة 30 دقيقة.
-
Deconvolution مجهرية وتحليل
ملاحظة: يتطلب هذا الجزء من البروتوكول استخدام مجهر deconvolution والبرمجيات المتخصصة للتحليل.- تشغيل الطاقة لنظام التصوير، تسمح مجهر مرحلة التهيئة بشكل صحيح، وقم بتشغيل الصمام مصدر الضوء.
- إضافة زيت الغمر (الانكسار 1.520 لعينات حية في 37 درجة مئوية) في عدسة هدف نا 60 × 1.42. مكان الشريحة عينة على المجهر مع ساترة تواجه نحو الهدف العدسة، وتأمين الشريحة بشكل صحيح.
- استخدام إضاءة ساطعة الحقل أو الأسفار لتحديد الخلايا المستهدفة. ضبط التركيز حتى يمكن ملاحظة الخلايا الهدف الواضح. لا تقم بتحريك العدسة الهدف خارج منطقة ساترة لتجنب علامات الصفر لا لزوم لها.
- تحديد الأخضر البروتين fluorescence مترافق الجلوكوز الناقل 4 (التجارة والنقل-GLUT4) بإشارة التجارة والنقل. تحديد الخلايا الهدف المطلوب للحصول على الصور. يمكن حفظها موضع الخلية الهدف المحدد للرجوع إليها في المستقبل (الشكل 4).
- إعداد معلمات التجريبية المناسبة (بما في ذلك عدد بكسل والطول الموجي الإثارة، نسبة انتقال، وقت التعرض، وسمك المكدس، والفاصل الزمني وإجمالي وقت التصوير) على كل الخلية الهدف. لهذه التجربة، تم تعيين عدد البيكسل في الصورة في 512 × 512 (يمكن تعيينها في 1,024 x 1,024 لدقة أعلى) إشارات التجارة والنقل. تم تعيين وقت التعرض بين 0.025-0.05 s لكل دقيقة 5 ثانوية الأفقي x و y، و z التعديلات يمكن التحكم بواسطة البرنامج الموصى بها (مواد الجدول).
- تعيين المعلمة التعرض إلى حوالي 2,000 إلى 3,000 التهم الموجهة إليه لتحقيق كثافة بكسل كحد أقصى. لتصغير فوتوبليتشينج الأسفار، خفض النسبة المئوية الإثارة نقل الضوء بقدر الإمكان أثناء وقت التعرض حفظ أقل من 1 س. كرر هذه الخطوات لكل قناة (ق) الأسفار إضافية وكل مجال الفردية لمصلحة.
- تعيين الحد العلوي والسفلي من Z-المكدس في كل الخلية الهدف. يمكن تحقيق هذا عن طريق تحريك مرحلة مجهر حتى أعلى وأسفل الخلية الهدف وكلاهما قليلاً من التركيز. يمكن للمستخدمين ضبط دقة في محور ع بتعيين العدد الصور بين الحد العلوي والسفلي (الذي يمكن القيام به عن طريق تعيين المسافة بين كل صورة).
- ديكونفولفيد أكوام من الصور وتحليلها في وقت لاحق مع مساعدة البرمجيات ذات الصلة – السرعة من بيركينيلمير في هذه الحالة.
Representative Results
الخلايا العصبية طائي مثقف من الفئران كذلك حددت إيمونوستينينج مع البروتينات المرتبطة microtubule طائي البروتين محددة-جسم برو-أوبيوميلانوكورتين (بومك) وعلامة العصبية-2 (MAP2) (الشكل 2 أ). وأكد نحن الخلايا العصبية الأولية طائي مثقف وأعرب عن البروتين طائي بومك. التعبير عن مستقبلات CCR5 و CCL5 في الخلايا العصبية طائي وحددت مع الأجسام المضادة المحددة والمشترك المسمى بجسم بومك (الشكل 2 أ، 2).
وبعد 3 أيام من استزراع، تم transfected الخلايا العصبية مع "بروتينات فلورية خضراء الحمض النووي" (الشكل 3) أو بروتينات فلورية خضراء مترافق GLUT4 (الشكل 4). بروتينات فلورية خضراء التعبير يمكن عادة العثور على جميع أنحاء ستعرب الخلية دون نمط معين (الشكل 3) لكن GLUT4-بروتينات فلورية خضراء كبنية الشروريه تشبه في سيتوسول (الشكل 4). كيت تعداء المستخدمة في هذه الدراسة ليس هو الأسلوب الأكثر كفاءة تعداء الخلايا العصبية؛ ومع ذلك، هو أسلوب أقل صرامة لبقاء الخلية أفضل بعد تعداء، مما يسهم في أفضل العيش-خلية تصوير/التسجيل في وقت لاحق. أخذت صوراً للتجارة والنقل-GLUT4 إذ تعرب عن الخلايا العصبية قبل الوقت الفاصل بين الأفلام (الشكل 4A-ب، التكميلي فيديو 1، 2) على تحفيز الأنسولين أو تنشيط CCL5 (الشكل 4، 3 الفيديو التكميلية). الإشارات للتجارة والنقل والتجارة والنقل-GLUT4 واضحة وقوية في الخلايا العصبية.
كذلك يعاملون طائي الخلايا العصبية مع تعداء GLUT4-التجارة والنقل مع الأنسولين (40 ش) لوصف الاتجار GLUT4 التجارة والنقل. الفيديو ريبريهينسيفي من حركة GLUT4-التجارة والنقل على تحفيز الأنسولين في العصبية طائي WT و CCR5-/- ترد كفيديو 1 وفيديو 2، على التوالي.
رقم 1: عزل الأنسجة من مناطق مختلفة من الدماغ الماوس في المرحلة الجنينية (اليوم 16.5). (أ-د) الخطوات المتبعة في فصل الجراء عن المشيمة. (ه، و) تشريح رأس ألجرو من الجسم. (ز--أنا) الخطوات المتبعة في عزل كامل الدماغ من الجمجمة. يشير السهم الأسود في الاتجاه ليتم سحبها أثناء إزالة الجمجمة باستخدام الملقط. (ي) عزل تحت المهاد. السهم الأسود يشير إلى منطقة طائي بين الملقط. (K-L) عزل قشرة الدماغ الماوس. النجمة السوداء تشير إلى المنطقة القشرية في الدماغ الماوس ويشير السهم الأبيض لفصل القشرة من الدماغ كله. (م-س) فصل الجزء هيبوكامبال عن القشرة. السهم العلوي باللون الأبيض يمثل الأنسجة هيبوكامبال ويمثل السهم الأبيض أقل الأنسجة القشرية. تغيير حجم أشرطة = 1 سم (واو)، 200 ميكرومتر (ز-س). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: وصف العلامة العصبية طائي-بومك والتعبير المشترك عن CCL5 و CCR5- (أ) الابتدائية مثقف طائي الخلايا العصبية كانت المسمى مع علامة العصبية طائي-بومك (أحمر)، التعبير المشارك من علامة CCR5 (الأخضر)، والخلايا العصبية MAP2 (رمادي). (ب) CCL5 (الأخضر) التعبير في الخلايا العصبية بومك (أحمر) إيجابية طائي (مواءمة من البيانات التكميلية للمرجع17). وهنا، المسمى DAPI النواة باللون الأزرق. تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر في (أ) و (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تعبير البروتين بروتينات فلورية خضراء في الماوس الخلايا العصبية الأولية. بروتينات فلورية خضراء بلازميد الحمض النووي transfected إلى الخلايا العصبية مثقف الأولية بعد 4 أيام الثقافة (DIV4) مع الحويصلية وأعرب لآخر 3 أيام (DIV7). (أ-ب) يتم التعبير عن التجارة والنقل في العصب وسوما. (ج-د) الخلايا العصبية مع تعداء صورية؛ DAPI المسمى النواة في (ب، د). تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: لقطات للتجارة والنقل-GLUT4 في الخلايا العصبية طائي. (أ، ج) وأعرب عن التجارة والنقل-GLUT4 البروتين في الخلايا العصبية طائي Wildtype (WT) و (ب) CCR5-/- الخلايا العصبية طائي. وقد حفزت الخلايا العصبية مع الأنسولين (أ وب) أو CCL5 (ج). تشير الأسهم إلى بروتينات فلورية خضراء-GLUT4 الشروريه في العصب قبل (-) وبعد (+) الأنسولين أو التحفيز CCL5 والعلامات النجمية أشر إلى سطح GLUT4-التجارة والنقل قبل (-) وبعد (+) التحفيز CCL5 في (ج). (الشكل مقتبس من المرجع17). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| 5 x براد المخزن المؤقت | الشركة | رقم الكتالوج | وحدة التخزين |
| حمض البوريك | سيغما ألدريتش | B6768 | ز 1.55 |
| الحفر | سيغما ألدريتش | 71997 | ز 2.375 |
| ddH2O | 100 مل | ||
| تصفيتها، تبقى عند 4 درجة مئوية | |||
| 20 x الأسهم بولي-د-يسين | الشركة | رقم الكتالوج | وحدة التخزين |
| بولي-د-يسين | سيغما ألدريتش | P6407 | 100 ملغ |
| ddH2O | 100 مل | ||
| تصفيتها، تبقى في-20 درجة مئوية | |||
| 1 x بولي-د-يسين | وحدة التخزين | ||
| 20 x بولي-د-يسين | 5 مل | ||
| 5 x براد المخزن المؤقت | 20 مل | ||
| ddH2س | 75 مل | ||
| المجموع | 100 مل | ||
| تبقى عند 4 درجة مئوية | |||
| غسل المتوسطة | الشركة | رقم الكتالوج | وحدة التخزين |
| الجلوكوز عالية دميم | Gibco | 12800-017 | مل 495 |
| المضادات الحيوية--أنتيميوتيك | Gibco | 15240-062 | 5 مل |
| المجموع | 500 مل | ||
| تبقى عند 4 درجة مئوية | |||
| باباين-التربسين هضم المخزن المؤقت: | الشركة | رقم الكتالوج | تركيز وحدة التخزين النهائي |
| غراء (10 مغ/مل) | سيغما ألدريتش | P4762 | 200 ميليلتر (2 مغ/مل) |
| التربسين-يدتا (0.25%) | Gibco | 25200-072 | 200 ميليلتر (0.05%) |
| غسل المتوسطة | 600 ميليلتر | ||
| المجموع | 1,000 ميليلتر | ||
| تبقى في-20 درجة مئوية | |||
| تصفيح المتوسطة: | الشركة | رقم الكتالوج | وحدة التخزين |
| متوسطة نيوروباسال | Gibco | 21103-049 | مل 176 |
| مصل الدم البقري الجنين | Gibco | 10437-028 | 20 مل |
| لام-الغلوتامات (200 ملم) | Gibco | 25030 | 2 مل |
| المضادات الحيوية--أنتيميوتيك | Gibco | 15240-062 | 2 مل |
| المجموع | 200 مل | ||
| تبقى عند 4 درجة مئوية | |||
| اكتمال ثقافة متوسطة | الشركة | رقم الكتالوج | وحدة التخزين |
| متوسطة نيوروباسال | Gibco | 21103-049 | مل 95 |
| الملحق N2 (100 x) | Gibco | 17502-048 | 1 مل |
| B27 الملحق (50 س) | Gibco | 17504-04 | 2 مل |
| لام-الغلوتامات (200 ملم) | Gibco | 25030 | 1 مل |
| المضادات الحيوية--أنتيميوتيك | Gibco | 15240-062 | 1 مل |
| المجموع | 100 مل | ||
| طازج |
الجدول 1: الهضم المخزن المؤقت ووسائط التكوين المستخدمة في هذه الدراسة.
الفيديو التكميلي 1: الأنسولين وحفز حركة التجارة والنقل-GLUT4 في الخلايا العصبية طائي WT. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الفيديو التكميلي 2: الأنسولين وحفز حركة التجارة والنقل-GLUT4 في CCR5-/- الخلايا العصبية طائي. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الفيديو التكميلية 3: CCL5 حفز حركة التجارة والنقل-GLUT4 في وزن طائي الخلايا العصبية (فيديو مقتبس من المرجع17). اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
القدرة على رصد الخلايا الحية، على تحفيز CCL5 أو الأنسولين، من الأهمية بمكان لدراسة تأثير CCL5 أو الأنسولين السريع على حركة GLUT4. في الواقع، فإنه يسمح لنا بتصور الفرق الكبير بين WT و CCR5-/- طائي الخلايا العصبية على تحفيز الأنسولين. ونحن قد أدوا العلامات السطحية للذاتية GLUT4 البروتين في وزن و CCR5-/- طائي الخلايا العصبية في نقاط زمنية مختلفة بعد تحفيز الأنسولين17. تسمية الخلية البروتينات السطحية يتطلب جسم خصوصية عالية مع خلفية منخفضة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن القياس الكمي fluorescence السطحية صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً. وهكذا، يسمح لنا أن نكون على يقين من أن تسجيل الوقت الفاصل بين تأثير CCL5 أو الأنسولين تغيير حقيقي فسيولوجية على أساس الظروف التجريبية، بدلاً من اختلاف الإحصائي. جنبا إلى جنب مع وضع العلامات السطحية من GLUT4 الذاتية، نحن نقدم أدلة قوية وتجارب لإثبات كيفية المشاركة CCL5 و CCR5 في إزفاء GLUT4 وإشارات الأنسولين.
وفي دراسات البيولوجيا الجزيئية وبيولوجيا الخلية الحديثة تتطلب العديد من التجارب استخدام مجهر الأسفار. وتسمح هذه التكنولوجيا العلماء تصور العلاقة المكانية بين البروتينات و/أو العضيات الخلوية، بالإضافة إلى اتجاه الحركة والسرعة وآثار تنشيطية، التغييرات الشكلية، والاتجار بالبروتين. بيد أن هذه التكنولوجيا لا تزال بقصره: عندما تكون متحمس fluorophores، الإشارات المنبعثة من البروتين المستهدفة (أو المجال) يمكن أن تطغى عليها الأسفار الخلفية. كنتيجة لذلك، يمكن أن تظهر الصور fluorescence ضبابية مع إشارات المتوقعة دفنها عميقا في الإشارات الخلفية. هذه الظاهرة جليا على وجه الخصوص للمراقبة للبروتينات الغشاء زمنياً.
مجموع الداخلية انعكاس Fluorescence مجهرية (تيرفم) وضعت للتغلب على هذه الصعوبة. أنها تسمح للعلماء لتصور الإثارة من المحدد زمنياً على سطح فلوروفوريس دون أن يؤثر ذلك فلوروفوريس الخلفية. أنها تسمح للعلماء بصورة انتقائية تميز السمات والأحداث في منطقة سطحية رقيقة جداً مثل غشاء البلازما. Deconvolution المجهري هو صورة مكثفة حسابياً تجهيز الأسلوب الذي أصبح ممكناً بفضل التقدم التكنولوجي في السنوات الأخيرة. كثيرا ما استخدمت لتحسين دقة الصورة الرقمية الأسفار. كما ذكر سابقا، عندما يجري fluorophores متحمسون بأي نوع من الإضاءة (مثل الليزر أو LED)، فلوروفوريس جميع سوف تنبعث منها إشارات المرور الضوئية بغض النظر إذا كانوا في التركيز أو لا، حيث تظهر دائماً الصورة ضبابية. هذا التمويه بسبب ظاهرة تسمى "نقطة نشر الدالة" (PSF)، كما سوف تنتشر كذلك الضوء القادمة من مصدر فلورسنت صغيرة (المضيئة) وتصبح خارج نطاق التركيز (طمس). من حيث المبدأ، هذا الحدث سوف تنتج إشارة مضيئة على شكل يشبه الساعة الرملية، ويمكن أن تتكون صورة الأسفار العديدة مثل هذه الإشارات الخفيفة. عملية deconvolution يمكن إعادة تعيين كافة إشارات الأسفار إلى شكلها الأصلي بقعة مشرقة، والقضاء على معظم الضوء خارج نطاق التركيز لتحسين تباين الصورة.
في السنوات الأخيرة، أدت خوارزميات deconvolution الصور مع قرار مماثل للمجهر [كنفوكل]. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع تيرفم، مما يمنع طمس خارج نطاق التركيز من أن يتم اكتشافها بمنطقة محدودة إثارة، مجهرية واسع المجال يسمح لكل ضوء إشارات للكشف عنها ويعيد تعيين لهم العودة إلى مصدرها من خلال عملية deconvolution. ولذلك، أصبح deconvolution المجهري في الممارسة العملية، ليس فقط طريقة الحصول على صورة أكثر كفاءة، ولكن أيضا طريقة أكثر فعالية من حيث تكلفة بالمقارنة مع TIRF المجهري.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن ممتنون للمنح المقدمة من وزارة العلوم والتكنولوجيا، تايوان-إضافي MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) والصحة والرعاية الاجتماعية من منتجات التبغ-MOHW106-TDU-ب-212-144001 ص S c.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
| SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
| VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
| Insulin | Actrapid, Denmark | ||
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
| GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
| Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
| CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
| 12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
| micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
| curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
| 5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |
References
- Levin, B. E., Sherwin, R. S. Peripheral glucose homeostasis: does brain insulin matter? J Clin Invest. 121 (9), 3392-3395 (2011).
- Kleinridders, A., Ferris, H. A., Cai, W., Kahn, C. R. Insulin action in brain regulates systemic metabolism and brain function. Diabetes. 63 (7), 2232-2243 (2014).
- Duarte, A. I., Moreira, P. I., Oliveira, C. R. Insulin in central nervous system: more than just a peripheral hormone. J Aging Res. 2012, 384017 (2012).
- Vogt, M. C., Bruning, J. C. CNS insulin signaling in the control of energy homeostasis and glucose metabolism - from embryo to old age. Trends Endocrinol Metab. 24 (2), 76-84 (2013).
- Plum, L., Schubert, M., Bruning, J. C. The role of insulin receptor signaling in the brain. Trends Endocrinol Metab. 16 (2), 59-65 (2005).
- Lin, X., et al. Dysregulation of insulin receptor substrate 2 in beta cells and brain causes obesity and diabetes. J Clin Invest. 114 (7), 908-916 (2004).
- Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302. J Biol Chem. 279 (34), 35298-35305 (2004).
- Thaler, J. P., Guyenet, S. J., Dorfman, M. D., Wisse, B. E., Schwartz, M. W. Hypothalamic inflammation: marker or mechanism of obesity pathogenesis? Diabetes. 62 (8), 2629-2634 (2013).
- Milanski, M., et al. Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver. Diabetes. 61 (6), 1455-1462 (2012).
- Wang, X., et al. Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet. Exp Diabetes Res. 2012, 847246 (2012).
- Kitade, H., et al. CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status. Diabetes. 61 (7), 1680-1690 (2012).
- Kennedy, A., et al. Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (7), E897-E906 (2013).
- Chan, O., Burke, J. D., Gao, D. F., Fish, E. N. The chemokine CCL5 regulates glucose uptake and AMP kinase signaling in activated T cells to facilitate chemotaxis. J Biol Chem. 287 (35), 29406-29416 (2012).
- Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. Chemokines/intercrines and central regulation of feeding. Am J Physiol. 266 (5 Pt 2), R1711-R1715 (1994).
- Mayer, C. M., Fick, L. J., Gingerich, S., Belsham, D. D. Hypothalamic cell lines to investigate neuroendocrine control mechanisms. Front Neuroendocrinol. 30 (3), 405-423 (2009).
- Lizunov, V. A., et al. Insulin stimulates fusion, but not tethering, of GLUT4 vesicles in skeletal muscle of HA-GLUT4-GFP transgenic mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (8), E950-E960 (2012).
- Chou, S. Y., et al. CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5. Sci Rep. 6, 37659 (2016).
