Dieses Protokoll beschreibt eine Technik für die Beobachtung von Echtzeit-grüne Fluoreszenz Protein (GFP) Glucose Transporter 4 (GLUT4) Protein Menschenhandel auf Insulin-Stimulation und Charakterisierung der biologischen Rolle der CCR5 in Insulin-GLUT4 markiert Signalweg mit Dekonvolution Mikroskopie.
Diabetes Mellitus Typ 2 (T2DM) ist ein globaler Gesundheitskrise charakterisiert durch Insulin Signalisierung Beeinträchtigung und chronische Entzündungen in peripheren Geweben. Der Hypothalamus in das zentrale Nervensystem (ZNS) ist die Schaltzentrale für Energie und Insulin-Signal-Antwort-Verordnung. Chronischer Entzündung in peripheren Geweben und Ungleichgewichte von bestimmten Chemokinen (z. B. CCL5, TNF und IL-6) dazu beitragen, Diabetes und Fettleibigkeit. Allerdings sind die funktionale Mechanismen, die Verbindung von Chemokinen und Hypothalamus Insulin Signal Verordnung noch unklar.
In-vitro- primäre Neuron Kultur Modelle sind bequem und einfach einsetzbare Insulin-Signal-Verordnung im Hypothalamus Neuronen zu untersuchen. In dieser Studie haben wir exogene GLUT4 Protein konjugiert mit GFP (GFP-GLUT4) in primäre hypothalamische Neurone, GLUT4 Membran Translokation nach Insulin-Stimulation zu verfolgen. Zeitraffer-Bilder der GLP-GLUT4 Protein Menschenhandel verzeichneten Dekonvolution Mikroskopie, die Benutzern erlaubte, High-Speed, hochauflösende Bilder zu erzeugen, ohne Beschädigung der Neuronen deutlich während der Durchführung des Experiments. Der Beitrag des CCR5 in Insulin reguliert GLUT4-Translokation verzeichneten CCR5 mangelhaft Hypothalamus Neuronen, die isoliert und von CCR5-Knockout-Mäusen gezüchtet wurden. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die GLUT4 Membran Translokation Effizienz nach Insulin-Stimulation in CCR5 mangelhaft Hypothalamus Neuronen reduziert wurde.
Diabetes Mellitus Typ 2 (T2DM) ist ein globaler Gesundheitskrise. T2DM zeichnet sich durch Insulin Signalisierung Beeinträchtigung und chronische Entzündungen in peripheren Geweben. Der Hypothalamus ist das Control Center, das Energiehomöostase, Appetit und Biorhythmus des Körpers reguliert. Am wichtigsten ist, vermittelt der Hypothalamus auch Insulin Signal Reaktionsfähigkeit um systemische Stoffwechsel1,2,3,4,5zu regulieren. Störung der Hypothalamus Insulins Signalisierung, dass Weg Insulin Resistenz6,7führen könnte. Der Hypothalamus koordiniert zelluläre Energiezustand und Sekretion von Hormonen wie Insulin und Adipokine (z.B. Leptin) aus den peripheren Geweben, systemische Glukosestoffwechsel, Insulin Reaktionsfähigkeit und Nahrungsaufnahme regulieren. Bindung von Insulin an den Insulinrezeptor aktiviert Insulin Rezeptor Substrat (IRS) Proteine, die dann Insulin nachgelagerten Signalmoleküle, wie z. B. PI3K aktivieren (Phosphatidylinositol-3-Kinase) und AKT (Proteinkinase B (PKB/AKT)), induzieren GLUT4 Membran-Translokation. Neuronen sind nicht das große Ziel für die Glukoseaufnahme in Reaktion auf Insulin; jedoch wurden bedeutende Niveaus der GLUT4 Ausdruck im Bereich Hypothalamus Arcuate Kern (ARC) identifiziert. Daher kann die Regulierung der GLUT4 im Hypothalamus Neuronen in Insulin Signalisierung in der Gehirn-Peripheriegerät Achse eine wichtige Rolle spielen.
Viele Studien haben vorgeschlagen, dass chronische Entzündungen und entzündlichen Chemokine im Hypothalamus auch eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Diabetes und Fettleibigkeit spielen, und Hemmung der Hypothalamus Entzündung Diät-induzierten Insulinresistenz umkehren können 8 , 9 , 10. Außerdem, Chemokin-CCL5 (C-C Motif Ligand 5, auch bekannt als RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) und seinen Rezeptor CCR5-Ebenen auch mit der Entwicklung des T2DM11,12korrelieren. Die Rollen von CCL5 und CCR5 in Insulin-Funktion und Glukose-Stoffwechsel sind noch unklar. Eine Studie berichtet, dass CCR5-Mangel von Fettleibigkeit bedingte Entzündung, Makrophagen Rekrutierung und Insulin-Resistenz-11Mäusen geschützt; eine weitere Studie zufolge dagegen CCR5-Mangel systemische Glukosetoleranz sowie Adipocyte und Muskel Insulin Signalisierung12beeinträchtigt. CCL5 findet Glukoseaufnahme in T-Zellen zu erhöhen und Nahrungsaufnahme durch seine Wirkung auf den Hypothalamus13,14, jedoch sowohl der Wirkmechanismus zu reduzieren und die Rezeptoren beteiligt sind noch nicht identifiziert werden.
Es ist schwierig, die zellulären Mechanismen, die die Wirkung der peripheren Gewebe Entzündungen auf Insulin im Hypothalamus Neuronen funktionieren zu studieren. Dies ist aufgrund der zellulären Heterogenität und Neuron Schaltung Feedback Vorschriften. Aus diesem Grund bietet eine in-vitro- Kultur Zellmodell ein sauberes Modell um die Auswirkungen der Chemokin auf Hypothalamus Insulin Signal Verordnung zu untersuchen. Zwar es viele verewigt Hypothalamus neuronalen Zelllinien für Forschungszwecke hergestellt gibt, diese Zelllinien ausgedrückt verschiedene Markierungen und stellen daher verschiedene Arten von Hypothalamus Neuronen15. Obwohl Hypothalamus Primärkulturen schwer zu pflegen sein können, sie bieten die realistischste Reaktion des Hypothalamus Neuronen nach Insulin-Stimulation, und können auch das Potenzial, die unbekannte Effekte die kommen zu spielen, bei der Pflege der Zellen vermeiden langfristig in Kulturmedium mit künstlichen Wachstumsfaktoren.
Hierin, wir nutzen primäre hypothalamische Neurone von C57BL/6 Wildtyp (WT) Maus und CCR5 Ko (CCR5– / –) Maus, und beide Arten von Zellen mit GFP-GLUT4 Konstrukt transfizieren. Um den Beitrag der CCR5 Insulin vermittelte GLUT4 Membran Opfer des Menschenhandels zu untersuchen, wurden die GFP-GLUT4 transfiziert Neuronen mit Insulin oder rekombinante CCL5 behandelt. Dann zeichnen wir die Bewegung der GFP-GLUT4 an die Plasmamembran in primäre hypothalamische Neurone mit Dekonvolution Mikroskopie.
Die Möglichkeit, lebende Zellen, nach CCL5 oder Insulin Stimulation zu überwachen ist entscheidend für die schnelle Wirkung von CCL5 oder Insulin auf GLUT4 Bewegung zu studieren. In der Tat ermöglicht es uns, den signifikanten Unterschied zwischen WT und CCR5– / – Hypothalamus Neuronen nach Insulin-Stimulation zu visualisieren. Wir haben die Oberfläche Kennzeichnung der endogenen GLUT4 Protein in WT und CCR5– / – Hypothalamus Neuronen zu verschiedenen Zeitpunkten nach Insulin Stimulation17durchgeführt. Die Kennzeichnung der Zelle Oberflächenproteine erfordert hohe Spezifität Antikörper mit niedrigen Hintergrund. Darüber hinaus kann die Oberfläche Fluoreszenz Quantifizierung auch schwierig und zeitraubend sein. So Zeitrafferaufnahme ermöglicht es uns, sicher sein, dass die Wirkung von CCL5 oder Insulin ist eine wahre physiologische Veränderung basierend auf experimentellen Bedingungen, anstatt eine statistische Variation. Gemeinsam mit Oberfläche Kennzeichnung von endogenen GLUT4, bieten wir starke Beweise und Experimenten zu zeigen, wie CCL5 und CCR5 GLUT4-Translokation und Insulin-Signal teilnehmen.
In modernen Zellbiologie und Molekularbiologie Studien erfordern viele Experimente die Auslastung der Fluoreszenz-Mikroskopie. Diese Technologie ermöglicht es Wissenschaftlern, die räumliche Beziehung zwischen Proteinen und/oder zellulare Organellen, neben Bewegungsrichtung und Geschwindigkeit, stimulierende Wirkung, morphologische Veränderungen und Protein Menschenhandel zu visualisieren. Diese Technologie hat jedoch immer noch die Einschränkung: Wenn Fluorophore angeregt werden, können Signale aus dem Zielprotein (oder Fläche) von Hintergrundfluoreszenz überwältigt werden. Infolgedessen können Fluoreszenzbilder mit erwarteten Signale begraben tief in Hintergrund Signale verschwommen angezeigt. Dieses Phänomen zeigt sich vor allem für die Beobachtung der Membrane-springen Proteine.
Insgesamt interne Reflexion Fluoreszenz Mikroskopie (TIRFM) wurde entwickelt, um diese Schwierigkeit zu überwinden. Es ermöglicht es Wissenschaftlern, die Anregung von ausgewählten Oberfläche gebundene Fluorophore zu visualisieren, ohne den Hintergrund Fluorophore. Es ermöglicht es Wissenschaftlern, Eigenschaften und Ereignisse auf einen sehr dünnen Flächenbereich wie eine Plasmamembran selektiv zu charakterisieren. Dekonvolution Mikroskopie ist eine rechenintensive Bildverarbeitung-Technik, die mit Hilfe von technologischen Fortschritten in den letzten Jahren ermöglicht wird. Es ist häufig verwendet worden, um digitale Fluoreszenz Bildauflösung zu verbessern. Wie bereits erwähnt, wenn Fluorophore sind mit jeder Art von Beleuchtung (z. B. Laser oder LED) angeregt wird, werden alle Fluorophore Lichtsignale unabhängig davon emittieren wenn sie im Mittelpunkt oder nicht stehen, so dass das Bild immer verschwommen angezeigt werden. Diese Unschärfe entsteht durch ein Phänomen namens “Point Spread Function” (PSF), wie Licht, das aus einer kleinen fluoreszierenden Quelle (heller Punkt) wird weiter ausgebreitet und unscharf (verschwommen). Im Prinzip dieser Veranstaltung wird eine Sanduhr-ähnliche geformte Fluoreszenzsignal produzieren, und zahlreiche solche Lichtsignale eine Fluoreszenzbild wettgemacht werden kann. Dekonvolution Prozess kann die Fluoreszenz-Signale an seiner ursprünglichen hellen spot Form zuweisen und beseitigen die Out-of-Focus Licht Bildkontrast zu verbessern.
In den letzten Jahren haben Dekonvolution Algorithmen Bilder mit vergleichbarer Auflösung der confocal Mikroskop generiert. Darüber hinaus verhindert, dass im Vergleich zu TIRFM, die Out-of-Focus Unschärfe durch eine begrenzte Erregung Region erkannt Weitfeld-Mikroskopie ermöglicht alle Licht-Signale erkannt werden und ordnet sie zurück zu ihrer Quelle durch den Prozess der Entfaltung. Daher ist die Dekonvolution Mikroskopie in der Praxis nicht nur eine effizientere Bild Erwerbsmethode, sondern auch eine kostengünstigere Methode im Vergleich zu TIRF-Mikroskopie geworden.
The authors have nothing to disclose.
Wir sind dankbar für die Zuschüsse durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan – MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) und Gesundheit und das Wohlergehen Zuschlag von Tabakwaren – MOHW106-TDU-B-212-144001 bis S-Y C.
DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
Insulin | Actrapid, Denmark | ||
Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |