Denne protokollen beskriver en teknikk for observasjon av sanntids Green fluorescens Protein (GFP) merket glukose Transporter 4 (GLUT4) protein handel på insulin stimulering og karakterisering av biologiske rollen CCR5 i insulin-GLUT4 signalveien med Deconvolution mikroskopi.
Type 2 diabetes mellitus (T2DM) er en global helse-krise som er preget av insulin signalering verdifall og kronisk betennelse i perifere vev. Hypothalamus i sentralnervesystemet (CNS) er kontrollsenteret for energi og insulin signal svar regulering. Kronisk betennelse i perifere vev og ubalanser av visse chemokines (som CCL5, TNFα og IL-6) bidra til diabetes og fedme. Men forbli de funksjonelle mechanism(s) chemokines og hypothalamus insulin signal regulering fortsatt uklare.
In vitro primære Nevron kultur modeller er praktisk og enkel modeller som kan brukes til å undersøke insulin signal regulering i hypothalamus nevroner. I denne studien introdusert vi exogeneous GLUT4 protein konjugert med GFP (GFP-GLUT4) i primære hypothalamus nevroner spore GLUT4 membran translokasjon på insulin stimulering. Tid-lapse bilder av GFP-GLUT4 protein handel ble registrert av deconvolution mikroskopi, som tillot brukere å generere høy hastighet, høyoppløselige bilder uten skade neurons betydelig mens gjennomføre eksperimentet. Bidraget av CCR5 i insulin regulert GLUT4 translokasjon ble observert i CCR5 mangelfull hypothalamus nevroner, som var isolert og kultivert fra CCR5 knockout mus. Resultatene viste at GLUT4 membran translokasjon effektiviteten ble redusert i CCR5 mangelfull hypothalamus nevroner etter insulin stimulering.
Type 2 diabetes mellitus (T2DM) er en global helse-krise. T2DM er preget av insulin signalering verdifall og kronisk betennelse i perifere vev. Hypothalamus er kontrollsenteret som regulerer kroppens energi homeostase, appetitt og biologiske rytmer. Viktigst, formidler hypothalamus også insulin signal respons å regulere systemisk metabolisme,1,,2,,3,,4,,5. Forstyrre hypothalamus insulin signalering veien kan indusere insulin resistens6,7. Hypothalamus koordinerer celleenergien status og utskillelse av hormoner som insulin og endotelial (f.eks, leptin) fra perifere vev, å regulere systemisk glukose metabolisme, insulin respons og matinntaket. Insulin binding til insulin receptor aktiveres insulin receptor substrat (IRS) proteiner, som deretter aktivere insulin nedstrøms signalnettverk molekyler, som PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) og AKT (protein kinase B (PKB/AKT)), å indusere GLUT4 membran translokasjon. Neurons er ikke store målet for glukoseopptaket svar på insulin; Imidlertid er betydelige nivåer av GLUT4 uttrykk blitt identifisert i regionen hypothalamus arcuate nucleus (ARC). Regulering av GLUT4 i hypothalamus nevroner kan derfor spille en viktig rolle i insulin signalering i hjernen-tilleggsutstyr aksen.
Mange studier har antydet at kronisk betennelse og inflammatoriske chemokines i hypothalamus også spille en viktig rolle i utviklingen av diabetes og fedme, og hemming av hypothalamus betennelse kan reversere kosthold-indusert insulinresistens 8 , 9 , 10. videre, chemokine-CCL5 (C-C motiv ligand 5, også kjent som RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) og dens reseptor CCR5 nivåer også korrelerer med utviklingen av T2DM11,12. Rollene CCL5 og CCR5 i insulin funksjon og glukose metabolisme fortsatt uklare. En studie rapporterte at CCR5 mangel beskyttet mus fra fedme-indusert betennelser, macrophage rekruttering og insulin resistens11; i kontrast, rapporterte en annen studie at CCR5 mangel svekker systemisk glukosetoleranse, samt adipocyte og muskel insulin signalering12. CCL5 er funnet å øke glukose opptak i T-celler og redusere inntaket av mat gjennom sin handling på den hypothalamus13,14, men begge virkningsmekanismen og receptors involvert ennå identifiseres.
Det er vanskelig å studere mobilnettet mekanismene bak effekten av eksterne tissue betennelse på insulin fungerer i hypothalamus nevroner. Dette skyldes mobilnettet heterogenitet og Nevron krets tilbakemelding forskrifter. Derfor gir en i vitro celle kultur-modellen en ren modell for å undersøke effekten av chemokine på hypothalamus insulin signal regulering. Men det er mange etablerte udødeliggjort hypothalamus neuronal cellelinjer til forskningsbruk, disse cellelinjer uttrykt forskjellige markører, og derfor representerer ulike typer hypothalamus nevroner15. Selv om primære hypothalamus kulturer kan være vanskelig å vedlikeholde, de kan gi den mest realistiske responsen av hypothalamus nevroner på insulin stimulering, og kan også unngå potensialet ukjente effekter som kommer i spill når vedlikeholde celler langsiktig kultur medium med kunstig vekstfaktorer.
Her, vi anvende primære hypothalamus nevroner fra både C57BL/6 wildtype (WT) mus og CCR5 knockout (CCR5– / –) mus og transfect begge typer celler med GFP-GLUT4 konstruksjon. Undersøke bidrag av CCR5 insulin mediert GLUT4 membran smugling, ble GFP-GLUT4 transfekterte neurons behandlet med insulin eller rekombinant CCL5. Vi deretter karakteriserer bevegelse av GFP-GLUT4 på plasma membranen i primære hypothalamus nevroner med Deconvolution mikroskopi.
Evnen å dataskjerm lever celler, på CCL5 eller insulinresistens stimulering, er kritisk viktig for å studere rask effekten av CCL5 eller insulin på GLUT4 bevegelse. Faktisk tillater det oss å visualisere betydelig forskjellen mellom WT og CCR5– / – hypothalamus nevroner på insulin stimulering. Vi har utført overflaten merkingen av endogene GLUT4 protein i WT og CCR5– / – hypothalamus nevroner på ulike tidspunkt etter insulin stimulering17. Merking av celle overflaten proteiner krever høy spesifisitet antistoff med lav bakgrunn. I tillegg kan overflate fluorescens kvantifisering også være utfordrende og tidkrevende. Dermed tid-lapse innspillingen tillater oss å være sikker på at effekten av CCL5 eller insulin er en sann fysiologisk forandring basert på eksperimentelle forhold, i stedet for en statistiske variasjonen. Sammen med overflaten merking av endogene GLUT4, gir vi sterke bevis og eksperimenter for å demonstrere hvordan CCL5 og CCR5 delta i GLUT4 translokasjon og insulin signalering.
I moderne cellebiologi og molekylærbiologi studier krever mange eksperimenter bruken av fluorescens mikroskopi. Denne teknologien tillater forskere å visualisere romlige forholdet mellom proteiner og/eller cellular organeller, i tillegg til bevegelsesretning og hastighet, stimulerende effekter, morfologiske endringer og protein menneskehandel. Denne teknologien har imidlertid fortsatt sin begrensning: Når fluorophores er opphisset, signaler slippes ut fra målet protein (eller området) kan bli overveldet av bakgrunnen fluorescens. Resultatet kan fluorescens bilder vises uklart med forventet signaler begravd dypt inn i bakgrunnen signaler. Dette fenomenet er spesielt tydelig for observasjon av membran-bundet proteiner.
Total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM) ble utviklet for å overkomme dette problemet. Det tillater forskere å visualisere magnetisering av valgte overflaten-bundet fluorophores uten å påvirke bakgrunnen fluorophores. Det tillater forskere å selektivt karakterisere funksjonene og hendelser på en svært tynn overflaten regionen som en plasma membran. Deconvolution mikroskopi er en beregningsmessig intensiv bildebehandling teknikk som er gjort mulig ved hjelp av teknologiske fremskritt de siste årene. Det har vært ofte benyttet for å forbedre digitale fluorescens bildeoppløsning. Som nevnt tidligere, når fluorophores er å bli begeistret av alle typer belysning (som laser eller LED), vil alle fluorophores avgir signaler uansett om de er i fokus eller ikke, så bildet vil alltid vises uklare. Dette sløret skyldes et fenomen som kalles “Punkt spredning funksjon” (PSF), som lys kommer fra en liten fluorescerende kilde (lyspunkt) vil spredt videre og bli uskarpt (blur). Denne hendelsen vil produsere et timeglass-lignende formet fluorescerende signal i prinsippet, og et fluorescens bilde kan være laget av mange slike signaler. Deconvolution prosessen kan tilordne alle fluorescens signaler til sin opprinnelige lyse spot form, og eliminere de fleste av ut-av-fokus lyset å forbedre kontrasten i bildet.
De siste årene, har deconvolution algoritmer generert bilder med tilsvarende oppløsning for AC confocal mikroskop. Dessuten, med TIRFM, som hindrer ut-av-fokus uskarphet blir oppdaget av en begrenset eksitasjon region, wide-field mikroskopi lar alt lys signaler kan oppdages, og fordeler dem tilbake til kilden gjennom deconvolution prosessen. Derfor, i praksis deconvolution mikroskopi har blitt ikke bare en mer effektiv image oppkjøpet metode, men også en mer kostnadseffektiv metode sammenlignet med TIRF mikroskopi.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige for tilskudd gitt av departementet for vitenskap og teknologi, Taiwan – MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) og helse og velferd tillegg av tobakksvarer – MOHW106-TDU-B-212-144001 til S-Y C.
DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
Insulin | Actrapid, Denmark | ||
Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |