Det här protokollet beskriver en teknik för observation av realtid grönt fluorescerande Protein (GFP) taggade glukos Transporter 4 (GLUT4) protein människohandel på insulin stimulans och karakterisering av CCR5 biologiska roll i det insulin – GLUT4 signalering utbildningsavsnitt med Deconvolution mikroskopi.
Diabetes mellitus typ 2 (T2DM) är en global hälsa kris som kännetecknas av insulin signalering njurfunktion och kronisk inflammation i perifera vävnader. Hypothalamus i det centrala nervsystemet (CNS) är ett kontrollcenter för energi och insulin signal svar förordning. Kronisk inflammation i perifera vävnader och obalanser i vissa chemokiner (t.ex. CCL5, TNFα och IL-6) bidra till diabetes och fetma. De funktionella mekanismerna ansluta chemokiner och hypotalamus insulin signal förordning fortfarande är dock fortfarande oklart.
In vitro primära neuron kultur modeller är bekväm och enkel modeller som kan användas för att undersöka insulin signal förordning i hypotalamus nervceller. I denna studie introducerade vi främmande GLUT4 protein konjugerat med GFP (GFP-GLUT4) till primära hypotalamus nervceller att spåra GLUT4 membran translokation vid insulin stimulering. Time-lapse bilder för GFP-GLUT4 protein människohandel spelades in av deconvolution mikroskopi, som får användare att generera höghastighetståg, högupplösta bilder utan att skada nervceller betydligt samtidigt genomför experimentet. Bidraget av CCR5 i insulin regleras GLUT4 translokation observerades i CCR5 bristfällig hypotalamus nervceller, som var isolerade och odlade från CCR5 knockoutmöss. Våra resultat visade att GLUT4 membran translokation effektivitet reducerades i CCR5 bristfällig hypotalamus nervceller insulin stimulation.
Diabetes mellitus typ 2 (T2DM) är en global hälsa kris. T2DM kännetecknas av insulin signalering njurfunktion och kronisk inflammation i perifera vävnader. Hypothalamus är Kontrollcenter som reglerar kroppens energi homeostas, aptit och dygnsrytm. Viktigast av allt, förmedlar hypotalamus också insulin signal lyhördhet för att reglera systemisk metabolism1,2,3,4,5. Störa hypotalamus insulin signalering utbildningsavsnitt skulle kunna framkalla insulin resistens6,7. Hypothalamus samordnar cellulär energistatus och utsöndringen av hormoner såsom insulin och adipokines (e.g., leptin) från perifera vävnader, att reglera systemisk glukosmetabolism, insulin lyhördhet och födointag. Insulin bindande till insulin receptor aktiveras insulin receptor substrat (IRS) proteiner, som sedan aktivera insulin nedströms signalmolekyler, såsom PI3K (fosfatidylinositol 3-Kinas) och AKT (proteinkinas B (PKB/AKT)), att framkalla GLUT4 membranet translokation. Nervceller är inte det stora målet för glukosupptag i svar till insulin; dock har betydande nivåer av GLUT4 uttryck identifierats i regionen hypotalamus arcuate nucleus (ARC). Regleringen av GLUT4 i hypotalamus nervceller kan därför spela en viktig roll i insulin signalering i hjärnan-perifera axeln.
Många studier har föreslagit att kronisk inflammation och inflammatoriska chemokiner i hypotalamus också spela en viktig roll i utvecklingen av diabetes och fetma, och hämning av hypotalamus inflammation kan återföra kost-inducerad insulinresistens 8 , 9 , 10. övrigt, chemokine-CCL5 (C-C motiv ligand 5, även känd som RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) och dess receptor CCR5 nivåer korrelerar också med utveckling av T2DM11,12. CCL5 och CCR5 roller i insulin funktion och glukos metabolism förblir oklart. En studie rapporterade att CCR5-brist skyddade möss från fetma-inducerad inflammation, makrofag rekrytering och insulin resistens11; Däremot rapporterade en annan studie att CCR5-brist försämrar systemisk glukostolerans, liksom fettceller och muskel insulin signalering12. CCL5 återfinns att öka glukosupptag i T-celler och minska födointaget genom sitt agerande på hypotalamus13,14, dock båda verkningsmekanismen och receptorerna som är inblandade är ännu identifieras.
Det är svårt att studera cellulära mekanismerna bakom effekten av perifer vävnadsinflammation på insulin funktion i hypotalamus nervceller. Detta beror på cellulära heterogenitet och neuron krets feedback förordningar. Av denna anledning ger en kultur i vitro cell modell en ren modell för att undersöka effekterna av chemokine på hypotalamus insulin signal förordning. Det finns många etablerade förevigade hypotalamus neuronala cellinjer för forskningsändamål, dessa cellinjer uttryckt olika markörer, och representerar därför olika typer av hypotalamus nervceller15. Även om primära hypotalamus kulturer kan vara svårt att upprätthålla, de kan ge den mest realistiska Svaren av hypotalamus nervceller vid insulin stimulering, och kan också undvika potential okända effekter som kommer in i spela vid underhåll celler långsiktig odlingsmedium med konstgjorda tillväxtfaktorer.
Häri, vi använda primära hypotalamus nervceller från både C57BL/6 vildtyp (WT) mus och CCR5 knockoutmus (CCR5– / –) och transfect båda typer av celler med GFP-GLUT4 konstruktion. För att undersöka CCR5 bidrag till insulin medierad GLUT4 membran människohandel, behandlades GFP-GLUT4 transfekterade nervceller med insulin eller rekombinant CCL5. Vi präglar sedan rörelsen av GFP-GLUT4 på plasmamembranet i primära hypotalamus nervceller med Deconvolution mikroskopi.
Möjlighet att övervaka levande celler, vid CCL5 eller insulin stimulering, är kritiskt viktigt för att studera snabba effekten av CCL5 eller insulin på GLUT4 rörelse. I själva verket tillåter det oss att visualisera den signifikanta skillnaden mellan WT och CCR5– / – hypotalamus nervceller vid insulin stimulering. Vi har utfört ytan märkning av endogena GLUT4 protein i WT och CCR5– / – hypotalamus nervceller vid olika tidpunkter efter insulin stimulering17. Märkning av cell ytproteiner kräver hög-specificitet antikroppar med låg bakgrund. Dessutom kan ytan fluorescens kvantifiering också vara utmanande och tidskrävande. Således, time-lapse recording tillåter oss att vara säker på att effekten av CCL5 eller insulin är en sann fysiologisk förändring baserat på experimentella förhållanden, i stället för en statistisk variation. Tillsammans med surface märkning av endogena GLUT4, erbjuder vi starka bevis och experiment för att visa hur CCL5 och CCR5 delta i GLUT4 translokation och insulin signalering.
I modern cellbiologi och molekylärbiologi studier kräver många experiment utnyttjandet av fluorescensmikroskopi. Denna teknik tillåter forskare att visualisera rumsliga förhållandet mellan proteiner och/eller cellulära organeller, förutom rörelseriktning och hastighet, stimulerande effekter, morfologiska förändringar och protein människohandel. Denna teknik har dock fortfarande sin begränsning: när fluorophores är upphetsad, signaler som sänds från målproteinet (eller område) kan bli överväldigad av bakgrunden fluorescens. Som ett resultat, kan fluorescens bilder suddiga med förväntade signaler begravd djupt i bakgrunden signaler. Detta fenomen är särskilt tydligt för observationen av membran-bundna proteiner.
Total inre reflektion Fluorescence mikroskopi (TIRFM) utvecklades för att övervinna denna svårighet. Det tillåter forskare att visualisera excitation av valda yta-bundna fluorophores utan att påverka den bakgrunden fluorophores. Det tillåter forskare att selektivt karakteriserar funktioner och händelser på en mycket tunn yta region som ett plasmamembran. Deconvolution mikroskopi är ett arbetsintensivt bildbehandling teknik som möjliggörs med hjälp av tekniska framsteg under de senaste åren. Det har ofta använts för att förbättra digital fluorescens bildupplösning. Som nämnts tidigare, när fluorophores exciteras av någon typ av belysning (såsom laser eller LED), avger alla fluorophores ljus signaler oavsett om de är i fokus eller inte, så bilden visas alltid suddiga. Detta oskärpa som orsakas av ett fenomen som kallas ”punkt sprida funktion” (PSF), eftersom ljus kommer från en liten fluorescerande källa (ljuspunkt) kommer att sprida ut ytterligare och bli ur fokus (oskärpa). I princip denna händelse kommer att producera en timglas-liknande formade fluorescerande signal och en fluorescens bild kan bestå av många sådana ljussignaler. Deconvolution processen kan omtilldela alla fluorescens signaler till dess ursprungliga ljusa spot form, och eliminera de flesta av out-of-fokus ljuset att förbättra bildens kontrast.
Under de senaste åren har deconvolution algoritmer genererade bilder med jämförbar upplösning som confocal Mikroskop. Dessutom i jämförelse med TIRFM, som förhindrar out-of-fokus oskärpa från att bli upptäckt av en begränsad excitation region, wide-fältet mikroskopi låter alla ljus signalerar att upptäckas och tilldelar dem tillbaka till deras källa genom deconvolution processen. Därför i praktiken blivit deconvolution mikroskopi inte bara en mer effektiv bild förvärvsmetod, men också en mer kostnadseffektiv metod jämfört med Frida mikroskopi.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för de bidrag som tillhandahålls av ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan – MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) och Socialstyrelsen avgiftsbelagd för tobaksvaror – MOHW106-TDU-B-212-144001 till S-Y C.
DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
Insulin | Actrapid, Denmark | ||
Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |