このプロトコルは、マイクロ浸透圧ポンプ脳輸液システムを使用してマウスの脳に拮抗、 MetCCL5 を提供することによって視床下部におけるケモカイン (C C モチーフ) リガンド 5 (CCL5) の役割を研究します。CCL5 活動のこの一時的な抑制は、視床下部のインスリン シグナル伝達、周辺の全身のインスリン感受性と耐糖能異常につながる中断。
インスリンは、視床下部と末梢インスリン応答の体系的な代謝を調節します。末梢の脂肪組織における炎症反応は、2 型糖尿病 (2 型糖尿病) の開発と、視床下部の食欲調節に貢献します。ケモカイン CCL5 と C-C ケモカイン受容体タイプ 5 (CCR5) レベル 2 型糖尿病 (2 型糖尿病) の動脈硬化症、グルコース不耐症を仲介することが提案されています。さらに、CCL5 役割を果たしている神経内分泌視床下部の食品摂取量と体温、したがってを調節することによって視床下部のインスリン シグナルの機能と末梢グルコース代謝の調節を調査するよう求められます。
マイクロ浸透圧ポンプ脳注入システムは CCL5 関数を操作し、脳でその効果を研究の迅速かつ正確な方法。また、遺伝子ノックアウト動物を生成する便利な方法を提供します。このシステムで CCL5 信号は、マイクロ浸透圧ポンプを使用してその拮抗薬、 MetCCL5 (ICV) 脳室内注入によってブロックされました。末梢グルコース代謝とインスリンの応答性は、経口ブドウ糖耐性試験 (OGTT)、インスリン耐性テスト (ITT) によって検出されました。動物由来組織サンプルからタンパク質のしみによってインスリン シグナル伝達活動を分析しました。
MetCCL5 注入、糖代謝とインスリンの 7 〜 14 日後 OGTT と ITT の結果に見られるように、応答性はマウスで障害者。IRS 1 serine302 のリン酸化は増大し、Akt 活動マウス視床下部ニューロンの抑制 CCL5 で低下していた。完全に、私達のデータ提案するマウス脳における CCL5 をブロック IRS 1 S302 のリン酸化を増加し、割り込みの視床下部のインスリン シグナル、グルコースの障害と同様に、末梢組織でのインスリン機能の低下につながる代謝。
インスリンは、脳を含む組織のさまざまなを影響します。インスリンは血液脳関門を通過する、中枢神経系 (CNS) に入るし、末梢インスリン応答、交感神経活性は、食品の摂取量を調節する視床下部におけるインスリン受容体 (IR) と結合します。タイプ 2 の糖尿病 (2 型糖尿病) に貢献する末梢の脂肪組織における慢性炎症が提案されているが、全身のインスリン反応とブドウ糖の不寛容を仲介する視床下部に信号をインスリンに影響を与えるこれらの炎症反応不明のまま。いくつかのケモカインが食欲調節と腫瘍壊死因子-アルファ (tnf α)、インターロイキン (IL)-6、il-1 β などの視床下部1で体温調節に参加単球走化性因子蛋白質 1 (MCP-1)、および CCL5 (C C モチーフ リガンド 5).さらに、視床下部の炎症は、インスリン抵抗性 2 型糖尿病2,3に します。
これらのケモカイン、CCL5 ケモカインの発現レベルの変化とその受容体の中で CCR5、脂肪組織に関連付けられている動物と同様、人間に 2 型糖尿病の動脈硬化症、グルコース不耐症。CCL5 視床下部における食品摂取量と体温の調節を含む神経内分泌機能があります。つまり、CCL5 が視床下部または末梢組織内でインスリン シグナル活性化に参加するかどうかを調査することが重要。
インスリン シグナルは、細胞内でしっかりと規制されています。インスリン、インスリン受容体 (IR) のバインディングは、インスリン受容体基質 (IRS) タンパク質、フォスファチジルイノシトール 3-キナーゼ (PI3K) とタンパク質キナーゼ B (PKB/AKT) 活性化と糖トランスポーター 4 (GLUT4) 膜輸送4 続いてをアクティブに.IRS の蛋白質がこのシグナル伝達経路の主要規制: 肯定的な応答でリン酸化されることができる複数チロシンおよびセリーンの残余があるまたは否定的なインシュリン信号5。たとえば、IRS – 1 302 セリンのリン酸化は、IR から IRS 1 の物理的な解離につながるし、インスリン抵抗6につながる、インスリン シグナル伝達をブロックできます。視床下部の IRS の蛋白質の活動障害マウス7での耐糖能およびインスリン抵抗性を誘導するために示されています。
特定の遺伝子の機能を研究する一般的な方法の 1 つは、全体の生物の全身配布ターゲット遺伝子の表現の操作です。ただし、これはいくつかの欠点があります: 1) それは時間をかけて異なるフィードバック規制や代償的な効果を生成可能性があります、2) このメソッドは特定の脳領域のターゲット蛋白質の役割を示すことには役立ちません。また、組織・細胞特異遺伝子ノックアウト動物が繁殖のために長い時間がかかる、高価。したがって、我々 は短期的な脳輸液浸透圧ポンプ システムは前述の問題を克服するために拮抗薬を使用して脳のターゲット蛋白質のシグナル伝達を妨害する比較的迅速かつ便利な方法 – を使用します。定位注射手術、複雑なスキルと実装および時間における大規模な投資を必要とするために使用します。このプロトコルでは、定位注射と血糖の濃度を検出し、視床下部のインスリン シグナル伝達制御における CCL5 の役割を調査する、以下の有害な迅速かつ瞬時メソッドを実行する簡単で安全な方法を提供します。
慢性的な炎症と関連ケモカイン受容体-CCL5 などのメカニズム 2 型糖尿病の開発の CCR5 は不明のまま。慢性的な炎症により、脂肪組織へのマクロファージ浸潤とアディポカイン; の規制に影響を与える一方で、それはまた β 細胞を集めて、血糖値に応じてランゲルハンス島からのインスリン分泌を損ないます。脳の視床下部は食欲不振、末梢血ブドウ糖の新陳代謝およびインスリン反応の調節に全身の末梢組織からのインスリンおよびアデポカイン信号の調整のコントロール センターとしての重要な役割を果たしています。多くの研究はまた視床下部の炎症がエネルギー恒常性維持と同様に欠陥のある膵肝機能2,3,9,10欠陥規制につながることを示します。CCL5 脳内視床下部11,12; 食品摂取量と体の体温調節に貢献します。しかし、CCL5 の視床下部と全身のインスリン シグナルに相関関係は明確ではありません。CCL5 全身のノックアウト マウス (CCL5-/-) は、血8高いインスリン レベルと高血糖値とインスリン抵抗性の表現型を示していますこの問題に対処するため生成されています。しかし、2 型糖尿病の表現型を開発する長い時間を必要とする、役割と可能性のある長期的な代償的な影響による視床下部インシュリン信号 CCL5 のメカニズムを調査することは困難です。そのため、視床下部ニューロンの信号 CCL5 の直接操作が最適です。ただし、複数の種類の視床下部領域のニューロン、それはかなり高価なセル特定のノックアウト マウスを生成に時間がかかります。ICV を利用した輸液システム従って時間を節約でき可能な末梢炎症性反応をバイパスして直接脳内 CCL5 関数を操作するより具体的なアプローチを提供します。
浸透圧ポンプを利用した研究既に公開されている以前は、偉大な例および齧歯動物13の浸透圧ポンプの注入する方法のデモンストレーションを提供します。しかし、本研究ではこれらのプロトコルに従いながらいくつかの課題を直面しました。まず、プロトコルで使用される機器のいくつかは非常に高価、1) 描画、マウス脳、2) 3) の酸素-イソフルラン マウスの体の温度を維持するための熱システムに針を挿入する場所に到達する電気システムを含むマウスに麻酔を管理するためのシステムを提供します。第二に、他の記事で説明した方法のみが我々 の研究の特定の年齢、体重の小さな範囲内で動物を使用することができなために、レプリケートする困難であった。大きいマウスが手術と注入に適していることがあります。私たちの研究では、肥満とインスリンと血の血糖調節の加齢変化を避けるために小さく、若いマウスを使用していた: 2 ヶ月ごろが研究で選ばれたボディを持つ男性マウス重量 25 ± 2 g と年齢だけ。したがって、手術を行うし、マウスの頭の傷を縫合することは困難です。第三に、炎症の反応は炎症性サイトカインが本研究でターゲット行うので手術後最小化します。マウスやラットは、縫合を削除し、傷口の炎症とケモカイン反応を高める手術後簡単にできます。したがって、場所に到達、描画し、二次感染を回避マウス脳に針を挿入するための戦略が必要です。したがって、我々 はこの手法を作るコスト効果の高い、簡単、かつ、動物に有害である次の段落で説明したように上記プロトコルを変更しました。
まず、2.6 の手順の説明に従って手動で、頭蓋骨に記されているターゲット周辺穴をドリルダウンするのに爪ドリルを使用します。このメソッドは、費用対効果、マウス髄膜・血管の損傷を避けるために全体の手順を監視することができます。脳内出血などの急性期脳卒中後血糖値制御が損なわれます。急性高血糖や糖尿病のような症候群も脳卒中臨床14,15で観察されました。同様に、また分かった糖レベル、インスリン応答出血と膿を持つマウスで脳内。マニュアルに基づく手術のよりよい制御結果の一貫性を確保するため必要があると認識しております。第二に、術後、それ故に、ステッチを回避し、治癒率を加速マウスの頭の皮膚を密封する診療所、組織接着剤 (手順 2.8) でよく使用される新開発医療生体材料の利用をしました。これは簡単に手術の手順を実行して二次炎症の発生を抑えます。第三に、全体の外科的処置の実行に要する時間は比較的短く、マウスの生存の可能性が高くなり、腹腔内に注入される麻酔薬の投与量を下げます。高生存率 (95%) を観察し、この変更されたプロトコルに従うことによって比較的正確な結果が得られました。
この技法の制限は、ドラッグデリバリーの比較的短い時間枠です。ただし、浸透圧ポンプに全身末梢のインスリン シグナル伝達を調節する脳の炎症性ケモカイン効果に焦点を当てて脳、当社の調査だけを再び開くことがなく、マウスの体にまたテーブルを配置できます。末梢組織で追加手術はおそらく炎症性ケモカインの発現を増加し、結果に影響を与える周辺の組織の炎症反応を引き起こすことができます。第二に、薬の半減期はまた調査の期間を制限します。組換えタンパク質ケモカインなど通常短い期間の脳内伝達ブロック CCL5 の影響を検討することもできますが、時間をかけて、活性を失い短い半減期があります。私たちの以前の研究は、長期効果8モデルを提供する CCL5 ノックアウト マウスを生成する遺伝的変更方法も説明しています。
いくつかの新しい技術や脳に薬を提供する別の方法があります。ナノテクノロジーは、中枢神経に薬物を提供する使用ことができる強力な手法です。ただし、多くの医薬品は感温、ナノ粒子16にそれらをパッケージ化しようとしたときに破壊することができます。また、ナノ粒子は BBB を通過でき、siRNA や最も一般的な薬に適している細胞内へ取り込まれるがリガンド-受容体結合のための理想的な方法ではありません。CCL5 効果8を視床下部 ARC ニューロンで、CCR5 レセプターへのバインドが必要ですあり CCL5 拮抗薬MetCCL5 ナノ粒子によるニューロンに配信場合がありますバインドし、セルに CCR5 をブロックする能力の損失表面。
血糖値コントロール (アプライドで投与マウス) と比較して CCL5 拮抗薬MetCCL5 経口ブドウ糖負荷試験で投与したマウスで有意に高値だった。追加インスリン投与 (インスリン負荷試験) はまた下げる血糖値MetCCL5 で受信マウス (図 4 b)、内因性と外部の両方のインスリンが血糖値を減らすことができないことを示唆していることときに CCL5 の視床下部信号をブロックします。マウスは、インスリン抵抗性の視床下部における CCL5 活動がないなった。IRS 1 の増加 serine302 のリン酸化は、受信 Met CCL5 アプライド (図 5 a・ B) を受け取るコントロール マウスと比較されたマウスで発見されました。リン酸化セリン 302 IRS 1 インスリン抵抗6の主な原因は、インスリン受容体から IRS 1 の物理的な解離を誘導するために示されています。インスリンは PI3K Akt 経路など下流の信号をアクティブにすることができます。マウス視床下部組織でインスリンがアクティブではなかった下流シグナル分子である Akt (p AktS473) インスリン注入 Met CCL5、302 セリンのリン酸化が増加した代わりに前のヴィヴォインスリン刺激研究を確認しました。全体で、生理データ (OGTT と ITT) と分子研究、体系的なインスリン抵抗性およびグルコース代謝に寄与する視床下部のインスリン シグナル調節を仲介する視床下部 CCL5 シグナルを示しています。
糖尿病の肥満関連の CCL5 と CCR5 の機構と役割は不明のまま。北出らは、CCR5 の欠乏が肥満誘起性炎症、マクロファージの採用およびインスリン抵抗性17からマウスを保護することを報告しました。しかし、ケネディらによって他の研究は、CCR5 不足が脂肪細胞と筋肉のインスリン シグナル18と同様、全身のグルコース耐性を損なうことを示す反対の結果を発見します。両方の調査には、全身慢性炎症や代償的な応答につながる肥満を誘発する高脂肪の食事療法が適用されます。これらの研究は、インスリン シグナル伝達制御に CCL5 と CCR5 のクリーンでクリアなメカニズムを提供していません。その一方で、浸透圧ポンプ技術により、脳の特定輸液しその期間限定配信で代償的な応答を回避できます。
結論として、脳の輸液システムと浸透圧ポンプ「昔ながら」の手法であるように思われますが、それは安く、簡単に、そしてより少なく有害な薬物送達法を提供して役立ちますリガンド-受容体のシグナル伝達の機能を調査、脳。
The authors have nothing to disclose.
感謝しております S Y C に省の科学と技術, 台湾-たばこ製品の MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) と保健医療福祉有料 – MOHW106-TDU-B-212-144001 からサポート
Vetbond Tissue Adhesive | 3M | #1049SB | The glue used to seal the lesion site on the mouse head |
LOCTITE 454 instant adhesive | Durect Corporation | #8670 | The glue used to fix the needle on the mouse skull |
Alzet Micro- Osmotic Pump | Durect Corporation | #9922 | 0.11 μl per hour, 28 days |
Brain infusion system | Durect Corporation | #8851 | 1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain |
Glucometer | Roche | #06870244001 | Used to measure the blood glucose level |
Glucose chip | Roche | #06454011020 | Used to load the blood sample |
Evan's blue | Sigma | #MKBK0523V | To demonstrate the drug infusion area |
Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | #3232145 C | Used to administer insulin intraperitoneally |
MIO NE116 CONTROL UNIT (nail drill) |
Mio System | #E235-015 | To drill a hole in the skull of the mouse |
CCL5/Met-RANTES Protein | R&D | #ADB0111081 | Recombinant Human CCL5, E-coli derived |
aCSF formula | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
Filter sterilize with a 0.22 μm filter apparatus, and store at 4°C. aCSF is stable for 3-4 weeks |
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Phospho-IRS-1 Serine302 antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
IRS-1 (D23G12) antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
Phospho-Akt Serine 473 antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:2000 dilution |
Akt (pan) (C67E7) antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:1000 dilution |
Animals: C57BL/6 | NAR Labs | Wild type mice strain used in the study |