Summary
Dieses Protokoll untersucht die Rolle der Chemokin (C-C-Motiv) Liganden 5 (CCL5) im Hypothalamus durch die Bereitstellung von Antagonist MetCCL5, in das Gehirn der Maus mit einem Mikro-osmotischen Pumpe Gehirn Infusion System. Diese vorübergehende Hemmung der CCL5 Aktivität unterbrochen Hypothalamus Insulin Signalisierung, Glukoseintoleranz und periphere systemische Insulinsensitivität führen.
Abstract
Insulin reguliert den Stoffwechsel systematisch in den Hypothalamus und die peripheren Insulinreaktion. Eine Entzündungsreaktion im peripheren Fettgewebe trägt zu Typ-2 Diabetes Mellitus (T2DM) Entwicklung und Appetit Verordnung im Hypothalamus. Chemokine CCL5 und C-C-Chemokin-Rezeptor Typ 5 (CCR5) Stufen vorgeschlagen worden, um Arteriosklerose und Glukose-Intoleranz bei Typ 2 Diabetes Mellitus (T2DM) zu vermitteln. Darüber hinaus Rolle CCL5 eine neuroendokrine im Hypothalamus geregelt Essen Einnahme und die Körpertemperatur, so fordert uns, seine Funktion im Hypothalamus Insulin-Signal und die Regulierung der peripheren Glukose-Stoffwechsel zu untersuchen.
Das Mikro-osmotischen Pumpe Gehirn Infusion System ist eine schnelle und präzise Weise zu manipulieren CCL5 Funktion und seine Wirkung im Gehirn zu studieren. Es bietet auch eine bequeme alternative Herangehensweise zur Erzeugung einer transgenen Ko-Tieres. In diesem System wurde CCL5 Signalisierung von Intracerebroventricular (ICV) Infusion von seinen Gegenspieler, MetCCL5, mit einem Mikro-osmotischen Pumpe blockiert. Die peripheren Glukose-Stoffwechsel und Insulin Reaktionsfähigkeit wurde durch den oralen Glukose-Toleranz-Test (OGTT) und Insulin-Toleranz-Test (ITT) festgestellt. Insulin Signalisierung Aktivität wurde dann durch Protein-Blot aus Gewebeproben, die von den Tieren abgeleitet analysiert.
Nach 7-14 Tagen von MetCCL5 Aufguss, den Metabolismus von Glukose und Insulin wurde bei Mäusen, Reaktionsfähigkeit beeinträchtigt, wie in den Ergebnissen der OGTT und ITT gesehen. Die IRS-1 serine302 Phosphorylierung wurde erhöht und die Akt-Aktivität wurde in Mäusen Hypothalamus Neuronen nach CCL5 Hemmung reduziert. Insgesamt zufolge unsere Daten blockieren CCL5 in das Gehirn der Maus erhöht die Phosphorylierung des IRS-1 S302 und unterbricht Hypothalamus Insulin-Signal, führt zu einem Rückgang der Insulinfunktion in peripheren Geweben sowie die Beeinträchtigung der Glukose Stoffwechsel.
Introduction
Insulin wirkt sich eine Vielzahl von Geweben, einschließlich des Gehirns. Insulin führt durch die Blut - Hirn-Schranke, tritt in das zentrale Nervensystem (ZNS) und bindet mit Insulin-Rezeptor (IR) im Hypothalamus, Nahrungsaufnahme, Aktivität des sympathischen Nervensystems und periphere Insulin-Reaktion zu regulieren. Chronische Entzündungen im peripheren Fettgewebe soll dazu beitragen, Typ 2 Diabetes Mellitus (T2DM), aber wie diese Entzündungsreaktionen Insulin beeinflussen, systemische Insulin-Reaktion und Glukose-Intoleranz vermitteln im Hypothalamus Signale bleibt unklar. Einige Chemokine Teilnahme an Appetit Verordnung und Regulierung der Körpertemperatur im Hypothalamus1 wie Tumor-Nekrose-Faktor-Alpha (TNF), Interleukin (IL) -6, IL-1β, Monocyte Lockstoffgradient Protein-1 (MCP-1) und CCL5 (C-C Motif Ligand 5 ). Darüber hinaus führt die Entzündung im Hypothalamus zu einer Insulinresistenz bei T2DM2,3.
Unter diese Chemokine, die Änderung der Ausdruck Niveaus der Chemokin CCL5 und seinen Rezeptor wurde CCR5, in Fettgewebe mit Arteriosklerose und Glukose-Intoleranz in T2DM im Menschen als auch Tiere in Verbindung gebracht. CCL5 hat auch neuroendokrine Funktionen, einschließlich der Regulierung von Essen-Aufnahme und die Körpertemperatur, im Hypothalamus. Es ist daher wichtig zu untersuchen, ob CCL5 an Insulin Signal Aktivierung innerhalb der Hypothalamus oder der peripheren Geweben beteiligt ist.
Insulin-Signal ist streng in den Zellen reguliert. Die Bindung von Insulin, Insulin-Rezeptoren (IR) aktiviert Insulin Rezeptorproteine Substrat (IRS), gefolgt von Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) und Protein Kinase B (PKB/AKT) Aktivierung und Glukose-Transporter-4 (GLUT4) Membran Translokation4 . IRS-Proteine sind die wichtigsten Regulatoren in dieser Signalweg: sie haben mehrere Tyrosin und Serin Rückstände, die als Reaktion auf Positive phosphoryliert werden können oder negative Insulin signalisiert5. Zum Beispiel kann Serin 302 Phosphorylierung von IRS-1 führen zu die physische Trennung von IRS-1 von IR und Insulin-Signaltransduktion, führt zu Insulin-Resistenz-6zu blockieren. Die Aktivität Beeinträchtigung der IRS Proteine im Hypothalamus hat sich gezeigt, Insulin-Resistenz und Glukoseintoleranz in Mäusen7zu induzieren.
Eine gängige Methode, um die Funktion eines bestimmten Gens zu untersuchen ist die Manipulation des Ausdrucks der Zielgene verteilt über den gesamten Körper des Organismus. Dies kann jedoch einige Nachteile haben: (1) es könnte im Laufe der Zeit verschiedene Rückkopplungseffekte regulatorischen oder kompensatorische erzeugen und (2) diese Methode nicht hilft uns die Rolle des Zielproteins in bestimmten Gehirnregionen zu veranschaulichen. Auch Gewebe und zellspezifische gen Knockout Tiere sehr lange dauern, zu züchten und sind teuer. So verwenden wir eine kurzfristige Infusion osmotischen Pumpe Hirnsystem - eine relativ schnelle und bequeme Möglichkeit, stören die Signalisierung des Zielproteins in das Gehirn der Antagonist Droge verwenden, um die genannten Probleme zu überwinden. Stereotaktische Injektionen verwendet, um komplizierte chirurgische Kompetenz und umfangreiche Investitionen in Instrumentierung und Zeit erfordern. In diesem Protokoll bieten wir eine einfache und sichere Möglichkeit, stereotaktische Injektion und eine schnell, weniger schädlich und momentane Methode, um die Konzentration von Glukose im Blut zu erkennen und untersuchen die Rolle von CCL5 im Hypothalamus Insulin Signalisierung Verordnung durchführen.
Protocol
Hinweis: Alle Protokolle und Methoden der tierische Themen wurden von institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschüsse (IACUC) von Taipei Medical University genehmigt (Protokoll Zahlen: LAC-2014-0387)
1. Vorbereitung des Micro-osmotischen Pumpe Infusionssysteme
Hinweis: Bereiten Sie die Pumpe, künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS) Puffer und Medikament (Met-CCL5/RANTES Proteinlösung (10 ng/mL im ACFS)) unter sterilen Bedingungen mit Puffer mit 0,2 µm-Filter filtriert und führen Sie die Verfahren unter der Haube Kultur mit Handschuhen. Die Eingriffe werden wie folgt durchgeführt:
- Bereiten Sie die Mikro-osmotische Pumpen einen Tag vor der Operation: füllen Sie die Gehirn Mikro-osmotischen Pumpe mit künstlichen Liquor cerebrospinalis (ACFS) mit einer 1 mL Spritze und Nadel stumpf-Leiter zusammen mit dem Kit. Tauchen Sie die Mikro-osmotischen Pumpe in ACFS und legen Sie es auf einen Shaker und schütteln Sie es über Nacht.
Achtung: Die Pumpe sollte voller ACFS und Luftblasen im Inneren der Pumpe (Abbildung 1A) vermieden werden. - Bereiten Sie vor Beginn der Operation die rekombinante Met-CCL5/RANTES Proteinlösung (10 ng/mL, verdünnt in ACFS) in das Experiment verwendet werden. Entfernen Sie ACFS aus der Pumpe und füllen Sie die Pumpe mit der Wirkstofflösung langsam bis Übermaß austritt.
Hinweis: 15 mL ACFS oder Met-CCL5/RANTES Lösung ist ausreichend für 5-8 Pumpen.
Achtung: Wiederholen Sie den Vorgang, um sicherzustellen, dass die Pumpe mit dem Medikament ohne Luftblasen im Inneren vollständig gefüllt ist. - Die Katheter-Rohre in die gewünschte Länge geschnitten und mit der stumpfen Ende Gehirn Infusion Nadel im Gehirn Infusion Kit beifügen. Füllen Sie die Infusion Kit und Rohre mit dem Medikament.
- Zu guter Letzt montieren Sie und befestigen Sie das Gehirn Infusion Kit zur Mikro-osmotischen Pumpe.
Achtung: Keine Bläschen sollte in den Schlauch oder die Pumpe (Abbildung 1A) gebildet werden. - Tauchen Sie die gesamte osmotischen Pumpe-Gehirn-Fusion inmitten ACFS in eine sterilisierte 50 mL-Tube, die Pumpe vor dem Austrocknen zu verhindern. Das osmotischen Pumpe-Gehirn-Fusion-Set ist nun bereit für Chirurgie verwendet werden.
Hinweis: Die Mikro-osmotischen Pumpensysteme für langfristige Infusion der Droge einsetzbar. Dies sorgt für eine sichere und bequeme Art der Drug-Delivery in das Gehirn der Maus.
2. Intrazerebrale ventrikuläre Chirurgie-Implantation des osmotischen Mikropumpe
Achtung: Sterilisieren Sie der chirurgische Umgebung mit 75 % Ethanol zu und sicherzustellen Sie, dass die Menschen, die an der Studie beteiligten sterile Handschuhe und einen sauberen Kittel tragen. Chirurgische Instrumente / Instrumente autoklaviert und vor Gebrauch getrocknet und anschließend sterilisiert mit 75 % igem Ethanol dazwischen Mäuse Operationen sein müssen.
- Wiegen die Maus und betäuben sie mit Intra peritoneale Injektion (IP) mit Ketamin/Xylazin (Ketamin 50 mg/kg, Xylazin 10 mg/kg).
Achtung: Mäuse Körpergewicht niedriger als 24 g sind nicht für die osmotischen Pumpe Implantation Operation empfohlen. - Montieren Sie und befestigen Sie den Maus-Kopf auf die stereotaktische Apparatur (Abbildung 1 b).
- Verwenden Sie ein paar Chirurgische Scheren und Zangen die Außenhaut über den Schädel aufzuschneiden. Verwenden Sie Jod um zu den peripheren Schädel zu reinigen.
- Trennen Sie die äußerste Schicht der Haut von der subkutanen Haut mit Hilfe eines Paares von stumpfen Kopf Scheren in der Nähe von der Hals-Bereich für die osmotischen Pumpe-Gehirn Fusion Set Implantation (Abbildung 1).
- Markieren Sie den Punkt Infusion mit Bezug auf die Gehirn-Karte (Abbildung 1) mit der stereotaktische Apparatur. In diesem Experiment muss die Nadel in der Region 3rd Herzkammer implantiert werden (Bregma: 0.0 mm seitlichen, hinteren 1,3 mm, ventralen 5,7 mm).
- Bohren Sie ein Loch mit einem Nagel-Bohrer in der Umgebung auf den Schädel (Abbildung 1E) markiert.
Achtung: Achten Sie darauf, die Maus Hirnhäute und Blutgefäße, wodurch die Störung von Mikro-Blutgefäßen im Gehirn zu brechen. - Legen Sie die Mikro-osmotischen Pumpe-Gehirn-Fusion-Set mit ACFS (als Kontrolle) oder Medikamenten (Met-CCL5/RANTES Proteinlösung) unter die Haut hinter den Halsbereich und einfügen die Gehirn-Infusion Nadel in das Bohrloch, das Medikament in das Gehirn der Maus ( einfließen Abbildung 1E). Die Nadel wird der Hirnhäute eindringen und bekommen in den Ventrikel. Fixieren Sie die Nadel auf den Schädel mit Oberfläche desensibilisierende Gel (Abb. 1F) und warten Sie 1 – 2 min., bis der Leim trocknet. Als Nächstes schneiden Sie den überstehenden Teil auf die Nadel (Abbildung 1- H).
- Verwenden Sie ein Gewebe Klebstoff Leim, um den Betrieb, die Wunde am Kopf zu heilen. Gelten 50 µL des Klebers auf die Wunde, ziehen Sie beide Seiten der Haut zusammen und halten Sie für 30 s auf der Haut (Abb. 1I) versiegeln lassen.
Achtung: Verwenden Sie 100 % Alkoholtupfer reinigen die Wunde nach der Operation und 100 Ul Penicillin mit Streptomycin, Infektion zu verhindern. Hinweis: Maus Haut wird Narbengewebe zu bilden und heilen in wenigen Tagen nach der Verabreichung des chirurgischen Klebers. Der Hauptvorteil des Klebers ist die Vermeidung von chirurgische Nähte die Reizung der Haut oder Entzündungen hervorrufen können. - Statt die Maus in einem sauberen Käfig auf einem warmen Teller gehalten (bis zu 37 ° C erhitzt) und warten Sie, bis die Maus erholt sich von dem betäubenden Effekt.
Achtung: Es ist entscheidend für die Maus Körpertemperatur um die Chance des Überlebens nach der Operation zu erhöhen. - Nach einer einwöchigen Erholungsphase werden die Mäuse bereit für weitere Experimente, wie der orale Glukose-Toleranz-Test (OGTT) und Insulin-Toleranz-Test (ITT) sein.
(3) oralen Glukosetoleranztest (OGTT)
Hinweis: Führen Sie den oralen Glukosetoleranztest 7 Tage nach der Infusion der ACFS und MetCCL5/RANTES (10 ng/mL, 100 µL). Pflegen Sie einen 6 h schnell für die Mäuse vor OGTT mit ausreichender Wasserversorgung. Halten Sie die Tiere auf der gleichen Werkbank, wo die Experimente durchgeführt werden, so dass sie für die Umwelt zur Verringerung der Belastung während des Verfahrens akklimatisieren können.
- Vorbereitung der Glukose-Lösung: vor der Durchführung des Experiments, bereiten Sie die Glukoselösung durch Auflösen von 3,75 g Glukose in 15 mL destilliertem H2O.
- Richten Sie einen Zeitplan zum Aufzeichnen der Messwerte während der Versuchsdurchführung (Tabelle 1).
Hinweis: Es ist wichtig, einen Zeitplan mit richtigen Abstände zwischen jeder Blutuntersuchung erlaubt genaue Aufzeichnung während des Experiments einzurichten. - Wiegen Sie jede Maus nach dem Fasten und berechnen Sie die entsprechende Menge an Glukose injiziert werden.
- Blutzuckermessgerät (drücken Sie die Schaltfläche "Start" um den Akkuladestand, stellen Sie sicher, dass es funktioniert, bevor der Test.)
- Glukose-chip
- Insulin Spritze (0,3 mL Insulin Spritze)
- Rasierklingen
- Timer
Hinweis: Der Glukose-Chip erfordert nur einen Tropfen Blut. Wenn die Blutprobe mehr als einmal gesammelt werden muss, Druck einfach durch Ausführen Ihre Finger entlang der Maus Rute mehrmals halten Sie das Ende der Rute direkt auf den Chip, um Blut zu sammeln. Es ist nicht notwendig, am Ende jedes Mal beim Sammeln von Blutproben schneiden.
4. Insulin-Toleranz-Test (ITT)
Hinweis: Toleranztest Insulin und oralen Glukosetoleranztest sollte mindestens 7 Tage auseinander geplant werden, um das Fasten Wirkung auf Tiere zu reduzieren. Für die Insulin-Toleranz-Test (ITT) wird Humaninsulin (0,75 U/Kg) durch IP-Injektion verabreicht werden.
- Vorbereitung von 0,25 U Insulinlösung: 100U Humaninsulin, das Verhältnis von 1: 400 in Kochsalzlösung zu verdünnen.
- Wiegen jeder Maus nach dem Fasten, und entsprechend die eingespritzte Menge an Insulin berechnen: Volumen (µL) von 0,25 U Insulin sein injiziert IP = 3 X BW (0,75 U Insulin/Kg Körpergewicht). Zum Beispiel: für eine Maus mit einem Gewicht von 28,8 g, injizieren: 28,8 X 3 = 86,4 µL (0,25 U verdünnt Insulin) (Tabelle 2).
Achtung: Die gleichen Tiere möglicherweise unterschiedliche Körpergewichte nach 6 Stunden an verschiedenen Tagen Fasten. Daher ist es notwendig, das Körpergewicht zu messen, vor und nach dem Fasten und Verhalten, die die OGTT und ITT zu testen. Maus des Körpergewichts konnte je nach Spezies, Geschlecht und Fasten Dauer gelöscht werden. Höhere Dosen von Insulin Insulin Schock verursachen könnte und würde bis zum Tod des Tieres führen. - Einrichten einer Tabelle (Tabelle 2) zum Aufzeichnen der Messwerte während der Versuchsdurchführung. Wiederholen Sie die Schritte 3.4. auf 3.8. für die Messung des Blutzuckerspiegels.
Representative Results
Chirurgische Implantationen von osmotischen Infusionspumpen, enthalten entweder ACFS als Kontrolle oder CCL5 Antagonist MetCCL5 (zu CCL5 Wirkungen im Gehirn blockieren) wurden an den Mäusen durchgeführt. Bei 7 bis 14 Tage nach der Operation wurden die peripheren Glukosetoleranz und Insulin Reaktionsfähigkeit von Mäusen mit OGTT (nach 7 Tagen) und ITT (nach 14 Tagen), wie im Protokoll erwähnt analysiert. Die oralen Glukosetoleranztest (OGTT) und Insulin-Toleranz-Test (ITT) von Mäusen waren nach 6 Stunden Fasten durchgeführt. Mäuse wurden mit Glukose oral, mit dem Betrag anhand ihrer jeweiligen Körpergewicht verabreicht. Die Änderungen in den Blutzuckerspiegel wurden aufgezeichnet, wie in Abbildung 3dargestellt. Die Insulin-Empfindlichkeit-Test wurde von intraperitoneal (IP)-Insulin-Injektion in Mäusen durchgeführt und die Änderung des Blutzuckerspiegels wurde sofort gemessen. Die Veränderungen der Blutzuckerwerte nach Insulin-Stimulation bei Mäusen mit verschiedenen Infusion Medikamente wurden aufgezeichnet, wie in Abbildung 4dargestellt. Der Blutzuckerspiegel wurde nach Glukose-Verwaltung (Abb. 3 b) und Insulininjektion (Abbildung 4 b) bei Mäusen mit CCL5 Antagonist (MetCCL5) Infusion im Vergleich zu Mäusen mit ACFS Infusion nur geringfügig reduziert. Diese Ergebnisse zeigen Beeinträchtigungen der Insulinfunktion auf periphere Glukosestoffwechsel bei Mäusen mit MetCCL5 in das Gehirn verabreicht.
Als nächstes haben wir die Aktivierung der Insulin-Signal durch die Auswertung der IRS-1 Phosphorylierung und Akt Aktivierungsniveaus im Hypothalamus Gewebe analysiert. Die Serin-Phosphorylierung auf 302 des IRS-1 wurde hochreguliert bei Mäusen mit Antagonisten (MetCCL5) behandelt (Abbildung 5 b-C) als Mäuse normal gefüttert wurden. In der Kontrollgruppe wurde an Mäusen Hypothalamus ACFS verwaltet und die Insulin-Herausforderung aktiviert das nachgeschaltete Signalmolekül Akt (phosphorylierten Akt Serin 473) (Abbildung 5, F) ohne Erhöhung der IRS-1 (serine302) Aktivierung Abbildung 5 -E) und Akt serine473 Phosphorylierung. Im Gegensatz dazu das Akt-Signal wurde nicht erhöht, bei Mäusen mit MetCCL5 infundiert, aber stattdessen gab es eine Zunahme der Phosphorylierung des IRS-1 Serin 302. Unterdessen unterbrochen, blockiert das CCL5 Signal im Gehirn Maus Insulin Aktivität im Hypothalamus und beeinträchtigt peripheren Insulinfunktion. Von unserer generellen Feststellungen, z. B. die Ergebnisse von ITT, OGTT und ex Vivo Insulin Herausforderung schlossen wir, dass CCL5 im Hypothalamus zu Insulin Signal Aktivierung und peripheren Glukosestoffwechsel nach Insulin Stimulation beiträgt.
Abbildung 1: Osmotischen Pumpe Vorbereitung und Implantation chirurgischen Eingriff in Maus. (A) die Gehirn-Infusion Kit und Pumpe Vorbereitung mit Wirkstofflösung durchblutet. Rote Pfeile zeigen die Katheter-Röhrchen mit Flüssigkeit gefüllt. (B) Fix und montieren den Maus-Kopf auf die stereotaktische Apparatur. (C) trennen die äußerste Schicht der Haut von der subkutanen Haut für die Implantation von Mikro-osmotischen Pumpe-Gehirn-Infusions-Set; Strich-Linien geben den Standort der osmotischen Pumpe Implantate. (D) den Pfeil zeigt die Aufguss-Seite. (E) Bohrer ein Loch um den markierten Bereich auf dem Schädel. (F) Ort der osmotischen Pumpe-Gehirn-Infusion in der Rückseite der Maus und Nadel Gehirn Infusion in das gebohrte Loch (Strich eingekreist). (G) die Nadel auf den Schädel mit Gewebe-Klebeband Klebstoff befestigen und lösen die Spitze der Nadel (Schere spitz in G), wie in (H) gezeigt. (ich) die Wunde mit Klebstoff Gewebekleber. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2. Repräsentative Bilder des Bereichs Verbreitung Droge, wenn das Medikament in der ventrikulären Region mit der osmotischen Pumpe verabreicht wird. Evan blau ist das repräsentative Medikament in der osmotischen Pumpe Medikament Infusion Abbildung in der ventrikulären Region (A) und Diffusion in Seiten- und dritten Ventrikel (B) verwendet. Maßstabsleiste = 0,5 cm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Glukose-Stoffwechsel der Mäuse nach der Operation durch den oralen Glukosetoleranztest (OGTT) gemessen. Die Verteilung der Blutzuckerspiegel verändert folgt die orale Verabreichung von Glukose im WT Mäuse mit ACFS (A) und Antagonist, MCCL5 infundiert (B). Angaben als Mittelwert ± se. (Abbildung modifiziert aus:8). * p < 0,05, durch zwei-Wege-ANOVA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Insulinfunktion in Mäusen den Blutzucker - Insulin-Toleranztest (ITT). Die Verteilung der Blutzuckerspiegel verändert nach Insulininjektion bei WT-Mäusen mit ACFS (A) infundiert und infundiert mit Antagonist, MCCL5 (B). Angaben als Mittelwert ± SE (Abbildung modifiziert aus:8). p < 0,001, durch zwei-Wege-ANOVA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5. Insulin-Signal Aktivität bei Mäusen nach der Operation. (A) westliche Beflecken der hemmenden Serin 302 Phosphorylierung Form der IRS-1 (Insulin Antwort Substrat-1, pIRS1S302) in Mäusen Hypothalamus Gewebe mit ACFS oder CCL5 Antagonist, MetCCL5 behandelt (MCCL5) Infusionspumpe. (B) damit verbundenen Ebenen der Phosphor-IRS-1S302 nach der Infusion in Mäusen Hypothalamus mit der normalen Fütterung.(C) westliche Beflecken der S302 Phosphorylierung des IRS-1 und Akt Aktivierung (Phosphor-Akt S473, pAktS473) mit oder ohne Insulin Stimulation im Hypothalamus Gewebe nach ACFS oder METCCL5 Infusion. (D-E) Relativen Pegel der pIRS-1S302, pS6KT421und pAktS473. ("2" in jeder Bar Graph steht für: n = 2 für alle Quantifizierungen). (Die leere Balken 5D-e, Links: die Streifen-Bars in 5D-E, ohne Insulin; rechts: mit Insulin). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| # | Maus-ID | Körper | Glukose | Start | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| Gewicht | Μl = 10xBW | Zeit | min. | min. | min. | min. | min. | ||
| 1 | 501 | 25,8 g | 258 | 09:00 | 09:00 | 09:00 | 09:15 | 09:30 | 10:00 |
| 2 | 502 | 25,3 g | 253 | 09:07 | 09:07 | 09:07 | 09:22 | 09:37 | 10:07 |
Tabelle 1. Zeitplan für oraler Glucose-Toleranz-Test (OGTT) Aufnahme
| # | Maus-ID | Körper | Insulin 0,25 IU | Start | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| Gewicht | Μl = 3xBW | Zeit | min. | min. | min. | min. | min. | ||
| 1 | 501 | 28,8 g | 86,4 | 09:00 | 09:00 | 09:15 | 09:30 | 10:00 | 10:30 |
| 2 | 502 | 25,3 g | 75,9 | 09:07 | 09:07 | 09:22 | 09:37 | 10:07 | 10:37 |
Tabelle 2. Zeitplan für die Insulin-Toleranz-Test (ITT) Aufnahme
Discussion
Der Mechanismus der chronischen Entzündung und damit verbundenen Chemokine wie CCL5 und seinen Rezeptor – unklar CCR5 bei der Entwicklung von Typ-2-Diabetes. Chronischer Entzündung verursacht Makrophagen Eindringen in Fettgewebe und wirkt sich auf die Regulierung der Adipokine; in der Zwischenzeit außerdem zieht β-Zellen und beeinträchtigt die Insulin-Sekretion von Langerhans-Inseln in Reaktion auf den Blutzucker. Hypothalamus im Gehirn spielt eine wichtige Rolle als ein Control-Center bei der Koordinierung von Insulin und Adipokine Signale aus dem systemischen peripheren Gewebe bei der Regulierung der Appetit, periphere Blut-Glukose-Stoffwechsel und Insulin-Reaktion. Viele Studien zeigen auch, dass Hypothalamus Entzündung zu mangelhaften Regulierung der Energiehomöostase sowie defekte Pankreas Inselchen und Leberfunktion2,3,9,10 führt. CCL5 im Gehirn trägt zur Aufnahme und Körper Temperatur Lebensmittelverordnung in den Hypothalamus11,12; die Korrelation von CCL5, Hypothalamus und systemische Insulin-Signal ist jedoch unklar. CCL5 Ganzkörper Knockout Maus (CCL5- / -) wurde erstellt, um die ein Insulin Widerstand Phänotyp mit höheren Insulinspiegel und hohe Blutzuckerwerte im Blut8zeigt mit dieser Frage beschäftigen. Allerdings erfordert es eine lange Zeit den T2DM-Phänotyp zu entwickeln und es ist schwierig, die Rolle und CCL5 im Hypothalamus Insulin-Signal durch mögliche Langzeitwirkungen kompensatorische Mechanismus zu untersuchen. Daher ist eine direkte Manipulation der CCL5 signalisieren in den Hypothalamus Neuronen der beste Ansatz. Allerdings gibt es mehrere Arten von Neuronen im Hypothalamus Region und es ist ziemlich teuer und zeitaufwendig, Zelle spezifische Knockout-Mäusen zu generieren. Unter Verwendung einer ICV kann Infusion System so sparen Sie Zeit und einen konkreteren Ansatz um CCL5 Funktion direkt in das Gehirn unter Umgehung mögliche peripheren Entzündungsreaktionen zu manipulieren.
Studien unter Verwendung osmotische Pumpen wurden bereits zuvor veröffentlicht bietet großartige Beispiele und Demonstrationen von Techniken die Implantation der osmotische Pumpen in Nagetieren13beteiligt. Allerdings standen wir ein paar Herausforderungen während im Anschluss an diese Protokolle in unserer Studie. Erstens ist ein Teil der Ausrüstung benutzt im Protokoll recht teuer, einschließlich (1) die elektrische Anlage zu erreichen, zeichnen und einsetzen der Nadel ins Gehirn der Maus, (2) das Thermo-System für die Aufrechterhaltung der Körpertemperatur Maus und (3) die Sauerstoff-Isofluran System für die Verwaltung der Anästhesie zu Mäusen zu liefern. Zweitens waren die Techniken, die in anderen Artikeln beschrieben schwer nachzuahmen, da wir nur Tiere innerhalb eines kleinen Bereichs von Körpergewicht und in bestimmten Altersstufen für unsere Studie nutzen konnten. Wir sind uns bewusst, dass größere Mäuse für Chirurgie und Implantation besser geeignet sind. Allerdings mussten wir in unserer Studie, kleinere und jüngere Mäuse verwenden Sie zur Vermeidung von Übergewicht und Alterungseffekte auf Insulin und Blut-Glukose-Verordnung: nur männliche Mäuse mit Körper 25 ± 2 g und Alter Gewicht ca. 2 Monate alt wurden in der Studie ausgewählt. Daher ist es schwierig zu operieren und Naht die Wunde auf den Maus-Kopf. Drittens muss die entzündliche Reaktion nach der Operation minimiert werden, da eine entzündliche Cytokine das Ziel dieser Studie ist. Mäuse und Ratten können Naht zu entfernen und offenen Wunden leicht nach der Operation, die führt zu Entzündungen und Chemokin Reaktionen zu erhöhen. Daher ist eine Strategie, die Position erreichen und ziehen und stechen die Nadel ins Gehirn der Maus, der Sekundärinfektion vermeidet notwendig. Daher haben wir die zuvor beschriebenen Protokolle, um diese Technik kostengünstiger, einfacher und weniger schädlich für die Tiere machen, wie im folgenden Absatz beschrieben geändert.
Erstens haben wir einen Nagel bohren um manuell ein Loch um den Zielbereich markiert auf dem Schädel zu bohren, wie unter Punkt 2.6 beschrieben. Diese Methode ist kostengünstig und ermöglicht es uns, das gesamte Verfahren um nicht zu beschädigen die Maus Hirnhäute und Blutgefäße zu überwachen. Blut-Glukose-Verordnung wird nach akutem Schlaganfall, wie z. B. eine Blutung im Gehirn beeinträchtigt. Akuten Hyperglykämie und Diabetes-ähnliche Syndrome wurden auch nach einem Schlaganfall im klinischen Umfeld14,15beobachtet. Ebenso fanden wir auch wertgemindert Glukose-Ebene und Insulin-Reaktion bei Mäusen mit Blutungen und Eiter im Gehirn. Wir sind uns bewusst, dass bessere Kontrolle der Handbuch-basierte Chirurgie zur Sicherstellung der Konsistenz der Ergebnisse notwendig ist. Zweitens, nutzten wir eine neu entwickelte medizinische Biomaterial allgemein verwendet in Kliniken, Gewebe Klebstoff Leim (Schritt 2,8), um die Haut zu versiegeln auf den Maus-Kopf nach der Operation, daher Stiche zu vermeiden und die Rate der Heilung zu beschleunigen. Dies erleichtert chirurgische Eingriffe durchführen und verringert die Gefahr von sekundären Entzündung. Drittens ist der Zeitaufwand für das gesamte chirurgische Verfahren durchzuführen vergleichsweise kürzer, das erhöht die Chance des Überlebens für die Mäuse und senkt die Dosierung der betäubende Droge injiziert intraperitoneal. Wir beobachteten eine hohe Überlebensrate (95 %) und relativ genaue Ergebnisse durch Anschluss an diese geänderte Protokoll erhalten.
Die Einschränkung dieser Technik ist die relativ kurzen Zeitrahmen der Drug-Delivery. Obwohl eine osmotische Pumpe in den Körper der Maus Alternativ platziert werden kann ohne erneute Öffnung des Gehirns, unsere Studie nur konzentriert sich auf die entzündlichen Chemokin-Wirkung auf das Gehirn, die peripheren systemischen Insulin Signalisierung zu regulieren. Zusätzliche Operation in peripheren Geweben könnte möglicherweise eine Entzündungsreaktion in peripheren Geweben, induzieren, die dann entzündliche Chemokin Ausdruck zu erhöhen und die Ergebnisse beeinflussen. Zweitens, die Halbwertszeit des Medikaments schränkt auch die Dauer der Studie. Rekombinante Proteine wie Chemokin haben in der Regel eine kürzere Halbwertszeit, die ihre Tätigkeit im Laufe der Zeit verliert, obwohl es auch erlaubt, die Wirkung von blockierenden CCL5 Signalisierung im Gehirn kurzfristig zu untersuchen. Unsere früheren Studien haben auch einen genetische Veränderung Ansatz zur Generierung von CCL5 Knockout Maus, bietet ein Modell mit langfristigen Auswirkungen8beschrieben.
Es gibt einige neue Techniken und alternative Methoden, Drogen ins Gehirn zu liefern. Nanotechnologie ist eine leistungsstarke Technik, die verwendet werden können, um Drogen in das zentrale Nervensystem zu liefern. Viele Medikamente sind wärmeempfindlichen jedoch und können zerstört werden, wenn Sie versuchen, sie in Nanopartikel16zu verpacken. Darüber hinaus Nanopartikel können BBB durchlaufen und werden Uptaken von Zellen, die für SiRNA oder am häufigsten verwendeten Medikamente geeignet sind, aber es ist keine ideale Methode für Ligand-Rezeptor-Bindung.CCL5 erfordert Bindung an seinen Rezeptor CCR5, in den Hypothalamus ARC Neuronen zu Effekt8, und die Lieferung von CCL5 Antagonist MetCCL5 in Neuronen durch Nanopartikel könnten dazu führen, dass einen Verlust der Fähigkeit zu binden und CCR5 auf der Zelle blockieren Oberfläche.
Der Blutzuckerspiegel war signifikant höher bei Mäusen in der oralen Glukosetoleranztest mit CCL5-Antagonist MetCCL5 im Vergleich zu den Steuerelementen (Mäuse mit ACFS verabreicht) verabreicht. Zusätzliche Insulingaben (Insulin-Toleranz-Test) war auch nicht in der Lage, den Blutzuckerspiegel in MetCCL5 erhalten Mäuse (Abbildung 4 b), zu senken, was darauf hindeutet, dass endogene und externe Insulin den Blutzuckerspiegel senken können beim Hypothalamus CCL5 Signalisierung blockieren. Mäuse wurden Insulin resistent ohne CCL5 Aktivität im Hypothalamus. Erhöhte serine302 Phosphorylierung des IRS-1 wurde bei den Mäusen, die Met-CCL5 im Vergleich zu Kontroll-Mäusen erhalten ACFS (Abbildung 5A-B) Eingang gefunden. Serin 302 Phosphorylierung des IRS-1 hat gezeigt, dass eine physikalische Dissoziation des IRS-1 aus der Insulinrezeptor, induzieren, die eine der Hauptursachen der Insulin-Resistenz-6; Insulin ist nicht nachgelagerten Signale wie der PI3K-Akt-Signalweg aktivieren. Eine ex-Vivo -Insulin-Stimulation-Studie bestätigt das Insulin, die nachgeschalteten Signalmolekül Akt (p-AktS473) nicht durch Insulin im Hypothalamus Gewebe Maus aktiviert wurde angereichert mit Met-CCL5 und stattdessen die Serin 302 Phosphorylierung erhöht. Insgesamt zeigen physiologische Daten (OGTT und ITT) und molekulare Studie, dass Hypothalamus CCL5 Signalisierung die Hypothalamus Insulin-Signal-Verordnung, vermittelt die systematische Insulin-Resistenz und Glukose-Stoffwechsel beiträgt.
Die Rolle und die Mechanismen der CCL5 und CCR5 bei Adipositas-assoziierten Diabetes bleibt unklar. Kitade Et Al. berichteten, dass CCR5-Mangel von Fettleibigkeit bedingte Entzündung, Makrophagen Rekrutierung und Insulin-Resistenz-17Mäusen geschützt. Jedoch haben andere Studien von Kennedy Et Al. entgegengesetzte Ergebnisse darauf hinweist, dass CCR5-Mangel beeinträchtigt systemische Glukosetoleranz sowie Adipocyte und Muskel Insulin Signalisierung18gefunden. Beide Studien angewendet eine fettreiche Ernährung, Übergewicht, induzieren die Ganzkörper chronische Entzündung und kompensatorische Reaktion führt. Diese Studien haben keine saubere und klare Mechanismen von CCL5 und CCR5 in Insulin Signalisierung Verordnung vorgelegt. Auf der anderen Seite die osmotischen Pumpe-Technik ermöglicht eine Gehirn-spezifische-Infusion und vermeidet kompensatorische Reaktion mit der zeitlich befristeten Lieferung.
Zusammenfassend, obwohl die osmotische Pumpe mit dem Gehirn Infusion System eine "altmodische" Technik zu sein scheint, bietet es eine billigere, einfachere und weniger schädliche Methode der Drug-Delivery und hilft untersuchen die Funktion des Ligand-Rezeptor Signalgebung der Gehirn.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir sind dankbar, unterstützt vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan – MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) und Gesundheit und das Wohlergehen Zuschlag von Tabakwaren - MOHW106-TDU-B-212-144001 bis S-Y C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | #1049SB | The glue used to seal the lesion site on the mouse head |
| LOCTITE 454 instant adhesive | Durect Corporation | #8670 | The glue used to fix the needle on the mouse skull |
| Alzet Micro- Osmotic Pump | Durect Corporation | #9922 | 0.11 μl per hour, 28 days |
| Brain infusion system | Durect Corporation | #8851 | 1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain |
| Glucometer | Roche | #06870244001 | Used to measure the blood glucose level |
| Glucose chip | Roche | #06454011020 | Used to load the blood sample |
| Evan's blue | Sigma | #MKBK0523V | To demonstrate the drug infusion area |
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | #3232145 C | Used to administer insulin intraperitoneally |
| MIO NE116 CONTROL UNIT (nail drill) |
Mio System | #E235-015 | To drill a hole in the skull of the mouse |
| CCL5/Met-RANTES Protein | R&D | #ADB0111081 | Recombinant Human CCL5, E-coli derived |
| aCSF formula | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
Filter sterilize with a 0.22 μm filter apparatus, and store at 4°C. aCSF is stable for 3-4 weeks |
|
| Phospho-IRS-1 Serine302 antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
| IRS-1 (D23G12) antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
| Phospho-Akt Serine 473 antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:2000 dilution |
| Akt (pan) (C67E7) antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:1000 dilution |
| Animals: C57BL/6 | NAR Labs | Wild type mice strain used in the study |
References
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