Summary
هذا البروتوكول الدراسات دور chemokine يجند (ج-C عزر) 5 (CCL5) في تحت المهاد بتقديم خصم، يلتقيCCL5، في الدماغ الماوس باستخدام نظام ضخ مضخة صغيرة ناضح الدماغ. هذا تثبيط النشاط CCL5 عابرة مقاطعة الأنسولين طائي الإشارات، مما يؤدي إلى التعصب الجلوكوز وحساسية الأنسولين المحيطية الجهازية.
Abstract
وينظم الأنسولين الأيض المنهجي في تحت المهاد واستجابة الأنسولين المحيطية. فعل التهاب في الأنسجة الدهنية المحيطة يسهم في تطوير نوع 2 السكري (T2DM) وتنظيم الشهية في تحت المهاد. اكتب مستقبلات تشيموكيني CCL5 تشيموكيني وج-ج 5 (CCR5) مستويات قد اقترحت التوسط التعصب تصلب الشرايين والسكر في نوع 2 السكري (T2DM). وبالإضافة إلى ذلك، CCL5 دوراً الجهاز الهرموني في تحت المهاد عن طريق تنظيم الغذاء المدخول والجسم درجة الحرارة، وهكذا، مما دفع بنا التحقيق في وظيفتها في إشارات الأنسولين طائي وتنظيم استقلاب الجلوكوز المحيطية.
نظام ضخ الدماغ المضخة الصغيرة ناضح طريقة سريعة ودقيقة للتعامل مع الدالة CCL5 ودراسة أثره في الدماغ. كما يوفر نهج بديلة ملائمة لتوليد من الحيوانات المحورة وراثيا بالضربة قاضية. في هذا النظام، مما يشير إلى CCL5 تم حظره بواسطة ضخ إينتراسيريبروفينتريكولار (ICV) خصم، يلتقيCCL5، استخدام مضخة صغيرة ناضح. تم الكشف عن استجابة الأيض والإنسولين الجلوكوز المحيطية باختبار التسامح الجلوكوز عن طريق الفم (OGTT) واختبار التسامح الأنسولين (ITT). وقد تم تحليل الأنسولين مما يشير إلى النشاط ثم بوصمة عار البروتين من عينات الأنسجة المشتقة من الحيوانات.
بعد 7-14 يوما وضخ MetCCL5، واستقلاب الغلوكوز والإنسولين كان ضعف الاستجابة في الفئران، كما يتبين من نتائج OGTT وأي تي تي. زيادة الفسفرة serine302 مصلحة الضرائب-1 وتم تخفيض النشاط أكت في الفئران طائي عقب CCL5 تثبيط الخلايا العصبية. إجمالاً، لدينا البيانات توحي بأن حجب CCL5 في الدماغ الماوس يزيد الفسفرة من مصلحة الضرائب-1 S302 ويقطع إشارات الأنسولين طائي، مما يؤدي إلى انخفاض في وظيفة الأنسولين في الأنسجة المحيطية، فضلا عن الأضرار الجلوكوز الأيض.
Introduction
يؤثر الأنسولين على مجموعة متنوعة واسعة من الأنسجة بما في ذلك الدماغ. الأنسولين يمر عبر حاجز الدم في الدماغ، ويدخل في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، ويربط مع مستقبلات الأنسولين (الأشعة تحت الحمراء) في تحت المهاد لتنظيم تناول الطعام والنشاط متعاطفة واستجابة الأنسولين المحيطية. واقترح التهاب مزمن في الطرفية الأنسجة الدهنية للمساهمة في نوع السكري 2 (T2DM)، ولكن كيف تؤثر هذه التفاعلات التحريضية على الأنسولين إشارات في تحت المهاد للتوسط من أجل التعصب واستجابة والجلوكوز الأنسولين الجهازية لا يزال غير واضح. بعض المستقطبات المشاركة في تنظيم الشهية وتنظيم درجة حرارة الجسم في تحت المهاد1 مثل عامل نخر الورم-ألفا (TNFα)، انترلوكين (إيل)-6، إيل-1β، الوحيدات chemoattractant البروتين-1 (العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1)، و CCL5 (ج-C الحافز يجند 5 ). وباﻹضافة إلى ذلك، التهاب في تحت المهاد يؤدي إلى مقاومة الأنسولين في T2DM2،3.
بين هذه المستقطبات، وتغيير مستويات التعبير من تشيموكيني CCL5 ولها مستقبلات، CCR5، في الأنسجة الدهنية ارتبطت بالتعصب تصلب الشرايين والسكر في T2DM في البشر، فضلا عن الحيوانات. وقد CCL5 أيضا وظائف الغدد الصم العصبية، بما في ذلك تنظيم درجة حرارة الجسم وتناول الطعام، في تحت المهاد. وبالتالي من المهم للتحقيق في ما إذا كان CCL5 وتشارك في تنشيط إشارة الأنسولين داخل تحت المهاد أو الأنسجة المحيطة.
وينظم الأنسولين مما يشير إلى محكم داخل الخلايا. ربط مستقبلات الأنسولين إلى الأنسولين (الأشعة تحت الحمراء) ينشط مستقبلات الأنسولين الركازة (IRS) البروتينات، تليها فوسفاتيديلينوسيتول 3-كيناز (PI3K) وبروتين كيناز ب (حزب/AKT) التنشيط والجلوكوز الناقل-4 (GLUT4) غشاء إزفاء4 . هي بروتينات IRS المنظمين الرئيسيين في هذا المسار مما يشير إلى: لديهم بقايا تيروزين وسيرين متعددة، التي يمكن أن تكون فوسفوريلاتيد في الاستجابة بإيجابية أو سلبية الأنسولين إشارات5. على سبيل المثال، يمكن أن يؤدي إلى الانفصال الجسدي لمصلحة الضرائب-1 من الأشعة تحت الحمراء الفسفرة سيرين 302 في مصلحة الضرائب-1 وعرقلة توصيل الإشارة الأنسولين، مما يؤدي إلى مقاومة الأنسولين6. لقد ثبت إعاقة نشاط البروتينات IRS في تحت المهاد للحث على مقاومة الأنسولين وتعصب الجلوكوز في الفئران7.
إحدى الطرق الشائعة لدراسة وظيفة جين معين يتم التلاعب بالجينات المستهدفة موزعة في جميع أنحاء الجسم بأكمله في الحي. ومع ذلك، قد يكون لعيوب عدة: 1) فإنه يمكن أن تولد آثار ردود فعل مختلفة التنظيمية أو تعويضية على مر الزمن ولم تساعدنا 2) هذا الأسلوب في توضيح دور البروتين المستهدفة في مناطق محددة من الدماغ. أيضا، الخاصة بالانسجة والخلايا الجينات خروج المغلوب الحيوانات تستغرق وقتاً طويلاً لتربية وباهظة التكلفة. وهكذا، نستخدم مضخة ناضح الدماغ قصيرة الأجل ضخ نظام-بطريقة سريعة ومريحة نسبيا تتداخل مع إشارات من البروتين المستهدف في الدماغ باستخدام الدواء مضاد للتغلب على المسائل المذكورة أعلاه. حقن المناظير باستخدام الأشعة المستخدمة لتتطلب مهارة جراحية معقدة واستثمارات واسعة النطاق في الأجهزة والوقت. في هذا البروتوكول، نحن نقدم طريقة بسيطة وآمنة لإجراء حقن المناظير باستخدام الأشعة وأسلوب أقل ضررا وسريعة وفورية للكشف عن تركيز الجلوكوز في الدم، والتحقيق في دور CCL5 في طائي الأنسولين مما يشير إلى التنظيم.
Protocol
ملاحظة: جميع البروتوكولات والأساليب المستخدمة في المواد الحيوانية قد تمت الموافقة "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجان (إياكوك) من جامعة الطب في تايبيه (البروتوكول الأرقام: 0387-أمريكا اللاتينية والكاريبي-2014)
1-إعداد أنظمة ضخ المضخة الصغيرة ناضح
ملاحظة: تعد مضخة، المخزن المؤقت للسائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (قام)، والمخدرات (Met-CCL5/رنتيس البروتين الحل (10 نانوغرام/مل في قام)) تحت ظروف معقمة باستخدام المخازن المؤقتة التي تمت تصفيتها مع 0.2 ميكرون المرشحات والقيام بجميع الإجراءات تحت غطاء محرك السيارة مع الثقافة قفازات. وتجري إجراءات الجراحة على النحو التالي:
- إعداد المضخات الصغيرة ناضح بيوم واحد قبل الجراحة: ملء المضخة الصغيرة ناضح الدماغ مع السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (قام) مع 1 مل حقنه وابرة رئيس بلانت قدمت جنبا إلى جنب مع هذه المجموعة. تزج المضخة الصغيرة ناضح في قام ووضعه على شاكر وهزه بلطف بين عشية وضحاها.
تنبيه: ينبغي أن تملأ المضخة قام، وينبغي تجنب فقاعات الهواء داخل المضخة (الشكل 1A). - قبل البدء بعملية جراحية، إعداد حل البروتين Met-CCL5/رنتيس المؤتلف (10 نانوغرام/مل، قام المخفف في) لاستخدامها في التجربة. إزالة قام من المضخة وملء المضخة مع الحل المخدرات ببطء حتى التسريبات الزائدة.
ملاحظة: قام 15 مل أو حل Met-CCL5/رانتيس يكفي لمضخات 5-8.
تنبيه: كرر الإجراء للتأكد من أن المضخة تماما مليئة المخدرات دون فقاعات داخل. - قطع أنابيب القسطرة إلى الطول المطلوب وإرفاقها مع إبرة ضخ بلانت-نهاية الدماغ في الدماغ ضخ عدة. ملء مجموعة ضخ وأنابيب مع المخدرات.
- وأخيراً، تجميع وإرفاق الدماغ عدة ضخ المضخة الصغيرة ناضح.
تنبيه: ينبغي تشكيل لا فقاعات في الأنبوب أو المضخة (الشكل 1A). - تزج الانصهار مضخة ناضح كامل-الدماغ تعيين في قام في أنبوب 50 مل معقمة لمنع المضخة من الجفاف. مجموعة الانصهار ناضح والدماغ مضخة جاهز الآن لاستخدامها لإجراء عملية جراحية.
ملاحظة: يمكن استخدام نظم المضخات الصغيرة ناضح لحقن المخدرات طويلة الأجل. هذا يضمن بطريقة آمنة ومريحة لإيصال المخدرات إلى الدماغ الماوس.
2-إينتراسيريبرال جراحة البطين – غرس مضخة ناضح الصغرى
تنبيه: تعقيم البيئة الجراحية مع الإيثانول 75%، والتأكد من أن الأشخاص المشاركين في الدراسة هي ارتداء قفازات معقمة ومعطف مختبر نظيفة. الأدوات الجراحية يجب أن تكون الصكوك يعقم والمجففة قبل الاستخدام، وتعقيم في وقت لاحق مع العمليات الجراحية في الفترات الفاصلة بين الفئران الإيثانول 75%.
- وزن الماوس وتخدير باستخدام الحقن داخل البريتوني (IP) مع الكيتامين/إكسيلازيني (الكيتامين 50 مغ/كغ، Xylazine 10 مغ/كغ).
تنبيه: لا ينصح بالفئران الهيئة أوزان أقل من 24 ز لجراحة زرع مضخة ناضح. - تركيب وإصلاح رأس الماوس على جهاز المناظير باستخدام الأشعة (الشكل 1B).
- استخدام زوج من كماشة ومقص الجراحية لقطع الجلد الخارجي تغطي الجمجمة مفتوحة. استخدام مادة اليود لتنظيف الجمجمة المحيطية.
- فصل الطبقة الخارجية من الجلد من الجلد تحت الجلد مع المساعدة من زوج من كماشة رئيس بلانت قرب منطقة الرقبة لغرس مجموعة الانصهار ناضح مضخة-الدماغ (الشكل 1).
- علامة النقطة التسريب بالإشارة إلى خريطة الدماغ (الشكل 1) باستخدام أجهزة المناظير باستخدام الأشعة. في هذه التجربة، الإبرة يحتاج إلى أن يكون مزروع في منطقة البطين 3rd (بريجما: 0.0 ملم الجانبي، 1.3 مم الخلفي، البطني 5.7 مم).
- حفر حفرة استخدام حفر أظافر حول منطقة علامة الجمجمة (الشكل 1E).
تنبيه: كن حريصا على عدم كسر السحايا الماوس والأوعية الدموية، وبالتالي تجنب انقطاع الأوعية الدقيقة في الدماغ. - ضع مجموعة الانصهار الجزئي ناضح والدماغ مضخة تحتوي على المخدرات (Met-CCL5/رنتيس البروتين الحل) تحت الجلد وراء منطقة الرقبة وإدراج إبرة حقن الدماغ في حفر حفرة ضخ المخدر في الدماغ الماوس ( أو قام (كعنصر تحكم) الشكل 1E). سوف تخترق السحايا الإبرة وندخل البطين. إصلاح الإبرة في مكان في الجمجمة باستخدام جل الفلورايد السطحية (الشكل 1F) والانتظار 1-2 دقيقة حتى يجف الغراء. وبعد ذلك، قطع الجزء إسقاطات على رأس الإبرة (الشكل 1-ح).
- استخدام غراء لاصق أنسجة لتلتئم العملية الجرح على رأسه. تطبيق 50 ميليلتر من الغراء على رأس الجرح، وسحب كلا الجانبين من الجلد معا، وعقد 30 ثانية للسماح للجلد لختم (1I الشكل).
تحذير: استخدام منصة الكحول 100% لتنظيف الجرح بعد الجراحة و 100 إبري بنسلين مع ستربتوميسين للوقاية من العدوى. ملاحظة: سيتم تشكيل ندبا الجلد الماوس وتلتئم في غضون بضعة أيام بعد إقامة الغراء الجراحي. والميزة الرئيسية للغراء هو تجنب غرز العمليات الجراحية التي قد تسبب تهيج الجلد أو التهاب. - مكان الماوس في قفص نظيف أبقى على طبق دافئ (ساخنة تصل إلى 37 درجة مئوية) وانتظر حتى يستعيد الماوس من تأثير مخدر.
تنبيه: من المهم للحفاظ على درجة حرارة الجسم للماوس لتعزيز فرصة للبقاء على قيد الحياة بعد الجراحة. - بعد فترة نقاهة مدتها أسبوع واحد، ستكون جاهزة لمزيد من التجارب، مثل اختبار التسامح الجلوكوز عن طريق الفم (OGTT) واختبار التسامح الأنسولين (ITT) الفئران.
3-اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم (OGTT)
ملاحظة: إجراء اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم 7 أيام بعد ضخ قام و MetCCL5/رنتيس (10 نانوغرام/مل، 100 ميليلتر). الحفاظ على ح 6 سريعة للفئران قبل OGTT بإمدادات كافية من المياه. الحفاظ الحيوانات على مقاعد البدلاء نفس العمل حيث سيتم إجراء التجارب حيث أن أنها يمكن التأقلم على البيئة الحد من التوتر أثناء الإجراء.
- إعداد الحل الجلوكوز: قبل إجراء التجربة، إعداد الحل الجلوكوز بتذويب 3.75 g الجلوكوز في 15 مل المقطر H2o.
- إعداد جدول زمني لتسجيل القراءات أثناء الإجراء التجريبي (الجدول 1).
ملاحظة: من المهم إعداد جدول زمني مع فترات مناسبة بين كل فحص الدم للسماح بدقة تسجيل أثناء التجربة. - تزن كل الماوس بعد الصيام وحساب المقدار المناسب من السكر بالحقن.
- السكر (اضغط على زر ابدأ للتحقق من حالة البطارية، تأكد من أنه يعمل قبل الاختبار.)
- رقاقة الجلوكوز
- الأنسولين المحاقن (0.3 مل الأنسولين المحاقن)
- شفرات الحلاقة
- جهاز ضبط الوقت
ملاحظة: يتطلب رقاقة الجلوكوز فقط قطره واحدة من الدم. عندما عينة الدم يحتاج إلى جمع أكثر من مرة، ببساطة تطبيق الضغط عن طريق تشغيل أصابعك على طول ذيل الماوس عدة مرات أثناء الضغط بنهاية الذيل مباشرة أعلى شريحة لجمع الدم. فإنه ليس من الضروري قطع ذيل كل الوقت في جمع عينات من الدم.
4-الأنسولين التسامح اختبار (ITT)
ملاحظة: اختبار تحمل الأنسولين واختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم يجب جدولة عدا 7 أيام على الأقل للحد من تأثير الصيام على الحيوانات. لاختبار تحمل الأنسولين (ITT)، سوف تدار الأنسولين البشري (0.75 يو/كغ) عن طريق الحقن بالملكية الفكرية.
- إعداد الحل الأنسولين يو 0.25: تمييع 100U الأنسولين البشري بنسبة 1: 400 في المحلول الملحي.
- وزن كل الماوس بعد الصيام، وحساب كمية حقن الأنسولين تبعاً لذلك: وحدة التخزين (ميليلتر) من 0.25 الأنسولين يو أن حقن IP = 3 X BW (0.75 يو الأنسولين/كغ من وزن الجسم). فعلى سبيل المثال: ماوس وزنها ز 28.8، حقن: 28.8 X 3 = 86.4 ميليلتر (0.25 يو المخفف الأنسولين) (الجدول 2).
تنبيه: قد الحيوانات نفس أوزان الجسم المختلفة بعد ح 6 الصيام في أيام مختلفة. وبالتالي، من الضروري قياس وزن الجسم قبل وبعد الصيام وإجراء اختبار OGTT وشركة ITT. يمكن إفلات الماوس من وزن الجسم تبعاً للأنواع، والجنس، ومدة الصيام. يمكن أن يسبب صدمة الأنسولين جرعات أعلى من الأنسولين ويؤدي إلى موت الحيوان. - قم بإعداد جدول (الجدول 2) بتسجيل القراءات أثناء إجراء التجارب. كرر الخطوتين 3، 4. إلى 3.8. لمستويات السكر في الدم قياس.
Representative Results
عللها الجراحية لمضخات التسريب ناضح تتضمن أما قام كعنصر التحكم أو خصم CCL5 MetCCL5 (لمنع الآثار CCL5 في الدماغ) أجريت على الفئران. في 7 و 14 يوما بعد الجراحة، حللت تحمل الجلوكوز المحيطية واستجابة الأنسولين للفئران باستخدام OGTT (بعد 7 أيام) وشركة ITT (بعد 14 يوما) كما ورد في البروتوكول. اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم (OGTT) واختبار تحمل الأنسولين (ITT) من الفئران أجريت بعد 6 ساعات الصوم. الفئران كانت تدار مع الجلوكوز شفويا، مع المبلغ استناداً إلى أوزانها الهيئة المعنية. وسجلت التغييرات في مستويات الجلوكوز في الدم، كما هو مبين في الشكل 3. تم إجراء اختبار حساسية الأنسولين بحقن الأنسولين (الملكية الفكرية) داخل في الفئران وتم قياس تغير مستوى الجلوكوز في الدم فورا. وسجلت تغيرات مستويات الجلوكوز في الدم عند تنشيط الأنسولين في الفئران مع المخدرات ضخ مختلفة، كما هو مبين في الشكل 4. تم تخفيض مستوى الجلوكوز في الدم إلا قليلاً بعد إدارة الجلوكوز (الشكل 3B) وحقن الأنسولين (الشكل 4 باء) في الفئران مع ضخ خصم (MetCCL5) CCL5 مقارنة بالفئران مع ضخ قام. هذه النتائج تشير إلى ضعف في وظيفة الأنسولين على استقلاب الجلوكوز الطرفية في الفئران مع MetCCL5 التي تديرها في الدماغ.
بعد ذلك، قمنا بتحليل تنشيط إشارة الأنسولين بتقييم مصلحة الضرائب-1 الفسفرة ومستويات التفعيل Akt في الأنسجة طائي. وكان الفسفرة سيرين في 302 من مصلحة الضرائب-1 أوبريجولاتيد في الفئران تعامل مع خصم (MetCCL5) (الشكل 5-ج) عندما تم تغذية الفئران عادة. في مجموعة المراقبة، وكان يديرها قام إلى تحت المهاد الفئران والتحدي الأنسولين تنشيط جزيء إشارة المصب Akt (473 سيرين Akt فوسفوريلاتيد) (الشكل 5، و) دون زيادة ضريبة الدخل-1 serine302 (التنشيط الشكل 5 -E) والفسفره serine473 عكة. وفي المقابل، إشارة Akt كان لم يزد في الفئران يملؤه MetCCL5، ولكن كانت هناك زيادة في الفسفرة من مصلحة الضرائب-1 سيرين 302 بدلاً من ذلك. وفي الوقت نفسه، حجب إشارة CCL5 في الدماغ الماوس توقف نشاط الأنسولين في تحت المهاد ووظيفة الأنسولين المحيطية البصر. من موجوداتنا عموما، مثل النتائج من ITT، OGTT، و السابقين فيفو التحدي الأنسولين، خلصنا إلى أن CCL5 في تحت المهاد يسهم في تنشيط إشارة الأنسولين واستقلاب الجلوكوز الطرفية على تحفيز الأنسولين.
رقم 1. مضخة ناضح إعداد وزرع العملية الجراحية في الماوس- (أ) ضخ المخ كيت وضخ إعداد perfused مع الحل المخدرات. وتبين الأسهم الحمراء أنابيب القسطرة مليئة بسائل. (ب) الإصلاح وجبل رأس الماوس على جهاز المناظير باستخدام الأشعة. (ج) فصل الطبقة الخارجية من الجلد من الجلد تحت الجلد لغرس الصغرى ناضح والدماغ مضخة ضخ مجموعة؛ خطوط داش تشير إلى موقع المضخة ناضح يزرع. (د) السهم يشير إلى الجانب التسريب. (ﻫ) حفر حفرة حول منطقة ملحوظ في الجمجمة. (و) مكان التسريب ناضح والدماغ مضخة في الجزء الخلفي الماوس وإدراج إبرة حقن الدماغ في حفر حفرة (داش دائري). (ز) إصلاح الإبرة على الجمجمة باستخدام الغراء لاصق الأنسجة وفصل الجزء العلوي من الإبرة (مقص أشار في ز) كما هو موضح في (ح). (أنا) ختم الجرح باستخدام أنسجة لاصق الغراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2- صور الممثل لمنطقة انتشار المخدرات عندما يدار المخدرات في منطقة البطين باستخدام مضخة ناضح. إيفان الأزرق هو الممثل المخدرات المستخدمة في التوضيح ضخ المضخة ناضح المخدرات في منطقة البطين (A) ونشرها في البطينين الأفقي والثالثة (ب). شريط المقياس = 0.5 سم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3- استقلاب الجلوكوز في الفئران بعد الجراحة تقاس باختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم (OGTT). تغيير توزيع مستويات الجلوكوز في الدم بعد الإدارة عن طريق الفم من الجلوكوز في الفئران WT يملؤه قام (A) وخصم، CCL5 م(ب). البيانات كما هو موضح يعني ± سراج الدين-(الرقم معدلة من8). * ف < 0.05 من ANOVA ثنائي الاتجاه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4- وظيفة الأنسولين في الفئران جلوكوز الدم-اختبار تحمل الأنسولين (ITT). تغيرت بعد حقن الأنسولين في الفئران WT يملؤه قام (أ) توزيع مستويات الجلوكوز في الدم، ويملؤه خصم، CCL5 م(ب). البيانات المعروضة كمتوسط ± سراج الدين (الرقم معدلة من8). ف < 0.001، قبل ANOVA ثنائي الاتجاه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5. النشاط إشارة الأنسولين في الفئران بعد الجراحة- النشاف (A) غربي النموذج الفسفرة 302 سيرين المثبطة لمصلحة الضرائب-1 (الأنسولين استجابة الركيزة-1، pIRS1S302) في الأنسجة تحت المهاد الفئران تعامل مع قام أو خصم CCL5، MetCCL5 (CCL5م) مضخة التسريب. (ب) ما يتصل مستويات الفوسفور-مصلحة الضرائب-1S302 بعد ضخ في الفئران تحت المهاد مع الرضاعة الطبيعية.(ج) غرب النشاف من الفسفرة S302 من مصلحة الضرائب-1 و Akt التنشيط (الفوسفور-Akt S473، باكتS473) مع أو بدون تحفيز الأنسولين في الأنسجة طائي بعد قام أو التسريب METCCL5. (د-ه) المستويات النسبية المتحقق-1S302، pS6KT421، وباكتS473. ("2" في كل رسم بياني شريطي لتقف على: n = 2 لجميع كوانتيفيكاتيونس). (أشرطة فارغة في 5 د-ه من اليسار: دون الأنسولين؛ أشرطة شرائط في د 5-ه، الحق: مع الأنسولين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| # | معرف الماوس | الهيئة | الجلوكوز | بدء تشغيل | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| الوزن | ميكروليتر = 10xBW | الوقت | دقيقة | دقيقة | دقيقة | دقيقة | دقيقة | ||
| 1 | 501 | ز 25.8 | 258 | 09:00 | 09:00 | 09:00 | 09:15 | 09:30 | 10:00 |
| 2 | 502 | ز 25.3 | 253 | 09:07 | 09:07 | 09:07 | 09:22 | 09:37 | 10:07 |
الجدول 1- الجدول الزمني لتسجيل اختبار التسامح الجلوكوز عن طريق الفم (OGTT)
| # | معرف الماوس | الهيئة | الأنسولين 0.25 وحدة دولية | بدء تشغيل | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| الوزن | ميكروليتر = 3xBW | الوقت | دقيقة | دقيقة | دقيقة | دقيقة | دقيقة | ||
| 1 | 501 | ز 28.8 | 86.4 | 09:00 | 09:00 | 09:15 | 09:30 | 10:00 | 10:30 |
| 2 | 502 | ز 25.3 | 75.9 | 09:07 | 09:07 | 09:22 | 09:37 | 10:07 | 10:37 |
الجدول 2- الجدول الزمني لتسجيل اختبار التسامح الأنسولين (ITT)
Discussion
إليه التهاب مزمن والمستقطبات ذات الصلة مثل CCL5 ولها مستقبلات – CCR5 في التنمية لداء السكري من النوع 2 لا يزال غير واضح. التهاب مزمن يسبب بلعم تسلل إلى داخل الأنسجة الدهنية ويؤثر على تنظيم أديبوكينيس؛ وفي الوقت نفسه، يجذب خلايا بيتا أيضا ويعوق إفراز الأنسولين من جزر لانجرهانز في الاستجابة الجلوكوز في الدم. تحت المهاد في الدماغ يلعب دوراً هاما كمركز لتحكم في تنسيق إشارات الأنسولين وأديبوكيني من الأنسجة المحيطية الجهازية في تنظيم الشهية والايض الجلوكوز في الدم المحيطي، واستجابة الأنسولين. كما تشير العديد من الدراسات أن التهاب طائي يؤدي إلى خلل تنظيم التوازن الطاقة فضلا عن جزيرة البنكرياس معيبة ووظيفة الكبد2،3،،من910. CCL5 في المخ يساهم في تنظيم درجة الحرارة الجسم وتناول الغذاء في11،تحت المهاد12؛ ومع ذلك، الترابط بين CCL5 لإشارات الأنسولين طائي والجهازية غير واضح. تم إنشاؤها لمعالجة هذه المسألة، مما يدل النمط الظاهري مقاومة الأنسولين مع ارتفاع مستويات الأنسولين ومستويات السكر في الدم مرتفعة في الدم8ماوس خروج المغلوب جسم كله CCL5 (CCL5--/--). ومع ذلك، فإنه يتطلب وقتاً طويلاً لتطوير النمط الظاهري T2DM ومن الصعب التحقيق في دور وآلية CCL5 في إشارة الأنسولين طائي بسبب الآثار تعويضية طويلة الأجل. ولذلك، تلاعب مباشر CCL5 الإشارات في الخلايا العصبية طائي هو أفضل النهج. ومع ذلك، هناك أنواع متعددة من الخلايا العصبية في منطقة طائي وأنها مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً لإنشاء خلية محددة بالضربة القاضية الفئران تماما. استخدام ICV نظام التسريب وبالتالي توفير الوقت وتوفير نهج أكثر تحديداً للتعامل مع الدالة CCL5 مباشرة في الدماغ، وتجاوز ردود الفعل الممكنة من التهابات الطرفية.
دراسات استخدام مضخات ناضح تم نشرها بالفعل في السابق، تقديم أمثلة رائعة والمظاهرات للتقنيات المستخدمة في زرع مضخات ناضح في القوارض13. ومع ذلك، نحن تواجه تحديات قليلة بينما عقب هذه البروتوكولات في دراستنا. أولاً، بعض المعدات المستخدمة في البروتوكول مكلفة جداً، بما في ذلك 1) المنظومة الكهربائية للوصول إلى الموقع، الرسم وإدخال الإبرة في المخ الماوس، 2) النظام الحرارية للمحافظة على درجة حرارة الجسم الماوس والأكسجين-إيسوفلوراني 3) توفير نظام لإدارة التخدير للفئران. ثانيا، يصعب التقنيات الموضحة في المواد الأخرى من إجراء نسخ متماثل لأننا كنا فقط قادراً على استخدام الحيوانات داخل مجموعة صغيرة من وزن الجسم، وفي سن معينة لدراستنا. ونحن ندرك أن الفئران الأكبر أكثر ملاءمة للجراحة وزرع. ومع ذلك، في دراستنا، اضطررنا إلى استخدام فئران أصغر وأصغر سنا لتجنب زيادة الوزن وآثار الشيخوخة على التنظيم جلوكوز الدم والانسولين: فقط الفئران الذكور مع الجسم الوزن 25 ± 2 ز والعمر حوالي 2 أشهر من العمر تم اختيارها في هذه الدراسة. وبالتالي، من الصعب إجراء جراحة وخياطة الجرح على رأسه الماوس. ثالثا، قد الاستجابة الالتهابية إلى أدنى حد بعد الجراحة نظراً سيتوكين تحريضية المستهدفة في هذه الدراسة. الفئران والجرذان ويمكن إزالة خياطة وفتح الجروح بسهولة بعد الجراحة، والذي سوف يؤدي إلى التهاب وزيادة ردود الفعل تشيموكيني. ولذلك فمن الضروري وضع استراتيجية للوصول إلى الموقع ورسم وإدراج الإبرة في المخ الماوس أن يتجنب العدوى الثانوية. ولذلك، قمنا بتعديل البروتوكولات هو موضح سابقا لجعل هذه التقنية فعالة من حيث التكلفة وأسهل وأقل ضارة بالحيوانات، كما هو موضح في الفقرة التالية.
أولاً، كنا حفر أظافر يدوياً حفر حفرة حول المنطقة المستهدفة علامة الجمجمة، كما هو موضح في الخطوة 2، 6. هذه الطريقة فعالة من حيث التكلفة ويسمح لنا برصد جميع الإجراءات لتفادي الأضرار بالسحايا الماوس والأوعية الدموية. تنظيم الجلوكوز في الدم البصر بعد السكتة الدماغية الحادة، مثل نتيجة نزيف في الدماغ. ولوحظت أيضا بعد السكتة الدماغية في إعدادات السريرية14،15فرط سكر الدم الحاد والمتلازمات مثل مرض السكري. وبالمثل، كما وجدنا استجابة الأنسولين ومستوى ضعف تحمل الجلوكوز في الفئران مع نزف وصديد في الدماغ. ونحن ندرك أن مراقبة أفضل للجراحة على أساس دليل ضروري لضمان اتساق النتائج. ثانيا، نحن استغل مادة بيولوجية طبية وضعت حديثا تستخدم عادة في العيادات، والأنسجة لاصق الغراء (2.8 خطوة)، لختم الجلد على رأس الماوس بعد عملية جراحية، ومن ثم تجنب غرز وتسريع معدل الشفاء. هذا يسهل إجراء العمليات الجراحية، ويقلل من فرصة لالتهاب ثانوي. ثالثا، أن الوقت اللازم للقيام بالإجراءات الجراحية بأكملها أقصر نسبيا، مما يزيد من فرصة للبقاء على قيد الحياة للفئران ويقلل من جرعة مخدر المخدرات يجري حقن إينترابيريتونيلي. لاحظ معدل بقاء عالية (95 في المائة)، والحصول على نتائج دقيقة نسبيا عن طريق اتباع هذا البروتوكول المعدل.
الحد من هذا الأسلوب هو الإطار الزمني القصير نسبيا لإيصال الأدوية. على الرغم من أن يمكن وضع مضخة ناضح إلى الجسم الماوس بدلاً من ذلك دون إعادة فتح الدماغ، ودراستنا فقط يركز على تأثير chemokine التحريضية على الدماغ لتنظيم إشارات الأنسولين المحيطية الجهازية. يمكن أن تحفز جراحة إضافية في الأنسجة المحيطية ربما فعل التهاب في الأنسجة المحيطية، ثم زيادة التعبير chemokine التحريضية وتؤثر على النتائج. وثانيا، فترة نصف العمر للدواء كما يحد من مدة الدراسة. المؤتلف البروتينات مثل تشيموكيني وعادة ما يكون نصف عمر أقصر، مما يفقد نشاطه على مر الزمن، على الرغم من أنه يسمح لنا بدراسة تأثير CCL5 حجب الإشارات في الدماغ على المدى القصير أيضا. وقد وصف دراساتنا السابقة أيضا نهجاً التحوير الوراثي لتوليد ماوس خروج المغلوب CCL5، الذي يوفر نموذجا للآثار طويلة الأجل8.
وهناك بعض تقنيات جديدة وطرق بديلة توصيل العقاقير إلى الدماغ. تقنية النانو هي تقنية قوية، التي يمكن أن تستخدم لتوصيل العقاقير إلى الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك، العديد من الأدوية ثيرموسينسيتيفي ويمكن أن تدمر عندما تحاول مجموعة منهم إلى جسيمات نانوية16. وباﻹضافة إلى ذلك، جسيمات نانوية يمكن أن يمر بي بي بي وأن أوبتاكين بالخلايا التي تكون مناسبة ل siRNA أو المخدرات الأكثر شيوعاً، ولكن ليس أسلوب مثالي ليجند-مستقبلات ملزم.يتطلب CCL5 ملزم للمستقبلات، CCR5، في الخلايا العصبية قوس تحت المهاد أن8من تأثير، وتقديم خصم CCL5 MetCCL5 في الخلايا العصبية عن طريق جسيمات نانوية قد تسبب خسارة في القدرة على ربط وكتلة CCR5 في الخلية السطح.
وكان مستوى الجلوكوز في الدم أعلى بكثير في الفئران التي تديرها مع CCL5 MetCCL5-خصم بالمقارنة مع عناصر التحكم (الفئران التي تديرها مع قام) في اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم. الإدارة الأنسولين إضافية (اختبار تحمل الأنسولين) كان أيضا غير قادر على تخفيض مستوى السكر في الدم في MetCCL5 تلقي الفئران (الشكل 4 باء)، مما يوحي بأن الأنسولين الذاتية والخارجية على السواء لا يمكن خفض مستويات السكر في الدم عند حظر الإشارات CCL5 طائي. وأصبحت مقاومة للأنسولين دون النشاط CCL5 في تحت المهاد الفئران. تم العثور على الفسفرة serine302 زيادة ضريبة الدخل-1 في الفئران تلقي Met-CCL5 مقارنة بالفئران التحكم تلقي قام (الشكل 5 أ-ب). سيرين 302 الفسفرة من مصلحة الضرائب-1 لقد ثبت للحث على الانفصال الجسدي من مصلحة الضرائب-1 من مستقبلات الأنسولين، وسبب رئيسي ل المقاومة الأنسولين6؛ غير قادر على تنشيط إشارات المصب مثل المسار PI3K Akt الأنسولين. وأكدت دراسة تحفيز الأنسولين السابقين فيفو الأنسولين لم يتم تنشيط جزيء مما يشير إلى المصب Akt (ف-AktS473) بالانسولين في الأنسجة طائي الماوس يملؤه Met CCL5، وبدلاً من ذلك، ازداد الفسفرة سيرين 302. بالإجمال، البيانات الفسيولوجية (OGTT وشركة ITT) والدراسة الجزيئية تثبت أن الإشارات CCL5 طائي يتوسط لائحة إشارة الأنسولين طائي، مما يسهم في الأيض المقاومة والجلوكوز الأنسولين المنتظمة.
دور وآلية CCL5 و CCR5 في مرض السكري المرتبط بالسمنة لا يزال غير واضح. ذكر كيتاد et al. أن نقص CCR5 حماية الفئران من الالتهابات الناجمة عن السمنة والتوظيف بلعم الأنسولين المقاومة17. ومع ذلك، وجدت دراسات أخرى من كنيدي et al. نتائج عكسية مما يشير إلى أن نقص CCR5 يضعف تحمل الجلوكوز النظامية فضلا عن الأنسولين adipocyte والعضلات مما يشير إلى18. كلتا الدراستين تطبيق نظام غذائي عالية من الدهون للحث على السمنة، مما يؤدي إلى التهاب مزمن في الجسم كله واستجابة تعويضية. ولم تقدم هذه الدراسات آليات واضحة ونظيفة CCL5 و CCR5 في الأنسولين مما يشير إلى التنظيم. من ناحية أخرى، أسلوب مضخة ناضح يسمح جرعة محددة في الدماغ ويتجنب استجابة تعويضية مع تسليمها محدودة زمنياً.
وفي الختام، على الرغم من المضخة ناضح مع نظام ضخ المخ، على ما يبدو، أسلوب "قديمة"، فإنها توفر طريقة أرخص وأسهل وأقل ضررا من إيصال الأدوية ويساعد التحقيق الدالة ليجند-مستقبلات الإشارات في الدماغ.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن ممتنون معتمدة من وزارة العلوم والتكنولوجيا، تايوان – إضافي MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) والصحة والرعاية الاجتماعية من منتجات التبغ-MOHW106-TDU-ب-212-144001 ص S c.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | #1049SB | The glue used to seal the lesion site on the mouse head |
| LOCTITE 454 instant adhesive | Durect Corporation | #8670 | The glue used to fix the needle on the mouse skull |
| Alzet Micro- Osmotic Pump | Durect Corporation | #9922 | 0.11 μl per hour, 28 days |
| Brain infusion system | Durect Corporation | #8851 | 1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain |
| Glucometer | Roche | #06870244001 | Used to measure the blood glucose level |
| Glucose chip | Roche | #06454011020 | Used to load the blood sample |
| Evan's blue | Sigma | #MKBK0523V | To demonstrate the drug infusion area |
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | #3232145 C | Used to administer insulin intraperitoneally |
| MIO NE116 CONTROL UNIT (nail drill) |
Mio System | #E235-015 | To drill a hole in the skull of the mouse |
| CCL5/Met-RANTES Protein | R&D | #ADB0111081 | Recombinant Human CCL5, E-coli derived |
| aCSF formula | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
Filter sterilize with a 0.22 μm filter apparatus, and store at 4°C. aCSF is stable for 3-4 weeks |
|
| Phospho-IRS-1 Serine302 antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
| IRS-1 (D23G12) antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
| Phospho-Akt Serine 473 antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:2000 dilution |
| Akt (pan) (C67E7) antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:1000 dilution |
| Animals: C57BL/6 | NAR Labs | Wild type mice strain used in the study |
References
- Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. Chemokines/intercrines and central regulation of feeding. Am J Physiol. 266, R1711-R1715 (1994).
- Milanski, M., et al. Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver. Diabetes. 61, 1455-1462 (2012).
- Wang, X., et al. Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet. Experimental diabetes research. 2012, 847246 (2012).
- Benomar, Y., et al. Insulin and leptin induce Glut4 plasma membrane translocation and glucose uptake in a human neuronal cell line by a phosphatidylinositol 3-kinase- dependent mechanism. Endocrinology. 147, 2550-2556 (2006).
- Gual, P., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Positive and negative regulation of insulin signaling through IRS-1 phosphorylation. Biochimie. 87, 99-109 (2005).
- Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302. The Journal of biological chemistry. 279, 35298-35305 (2004).
- Boura-Halfon, S., Zick, Y. Phosphorylation of IRS proteins, insulin action, and insulin resistance. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism. 296, E581-E591 (2009).
- Chou, S. Y., et al. CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5. Sci Rep. 6, 37659 (2016).
- Calegari, V. C., et al. Inflammation of the hypothalamus leads to defective pancreatic islet function. J Biol Chem. 286, 12870-12880 (2011).
- Mighiu, P. I., Filippi, B. M., Lam, T. K. Linking inflammation to the brain-liver axis. Diabetes. 61, 1350-1352 (2012).
- Tavares, E., Minano, F. J. RANTES: a new prostaglandin dependent endogenous pyrogen in the rat. Neuropharmacology. 39, 2505-2513 (2000).
- Appay, V., Rowland-Jones, S. L. RANTES: a versatile and controversial chemokine. Trends in immunology. 22, 83-87 (2001).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. J Vis Exp. , e50326 (2013).
- Wang, N., et al. Admission blood glucose and in-hospital clinical outcome among patients with acute stroke in Inner Mongolia, China. Clin Invest Med. 32, E151-E157 (2009).
- Olsen, T. S. Blood glucose in acute stroke. Expert Rev Neurother. 9, 409-419 (2009).
- De Jong, W. H., Borm, P. J. Drug delivery and nanoparticles:applications and hazards. Int J Nanomedicine. 3, 133-149 (2008).
- Kitade, H., et al. CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status. Diabetes. 61, 1680-1690 (2012).
- Kennedy, A., et al. Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305, E897-E906 (2013).
