פרוטוקול זה לומד את התפקיד של ליגנד (מוטיב C-C) כימוקין 5 (CCL5) בהיפותלמוס על-ידי אספקת אנטגוניסט, MetCCL5, לתוך המוח העכבר באמצעות מערכת מיקרו-osmotic משאבת אינפוזיה המוח. זה עיכוב ארעית של פעילות CCL5 התפרץ היפותלמי אינסולין איתות, המוביל גלוקוז סובלנות ורגישות לאינסולין מערכתית היקפיים.
אינסולין מווסת את חילוף החומרים שיטתית ההיפותלמוס ואת התגובה לאינסולין היקפיים. לתגובה דלקתית ברקמות adipose היקפיים תורמת סוג 2 סוכרת (T2DM) פיתוח ותקינה התיאבון בהיפותלמוס. כימוקין CCL5 ו C-C קולטן כימוקין הקלד 5 רמות (CCR5) הציעו לתווך טרשת עורקים ואי סבילות לגלוקוז בסוכרת סוג 2 (T2DM). בנוסף, CCL5 תפקיד נוירואנדוקריניים בהיפותלמוס על ידי ויסות מזון צריכת וגוף טמפרטורה, לפיכך, ומעודדת אותנו לחקור את תפקידה של ההיפותלמוס אינסולין איתות ועל ויסות חילוף החומרים של הגלוקוז היקפיים.
מערכת אינפוזיה משאבת מיקרו-osmotic המוח היא דרך מהירה ומדויקת לתמרן CCL5 פונקציה וללמוד את השפעתו במוח. הוא מספק גם גישה אלטרנטיבית נוחה לייצר חיה נוקאאוט הטרנסגניים. במערכת זו, CCL5 איתות נחסמה על ידי אינפוזיה intracerebroventricular (ICV) של היריב שלו, MetCCL5, באמצעות משאבה מיקרו-osmotic. התגובתיות של אינסולין מטבוליזם הגלוקוז היקפיים זוהה על ידי מבחן רגישות גלוקוז דרך הפה (OGTT) מבחן עמידות לאינסולין (ITT). אינסולין איתות פעילות נותחה לאחר מכן על ידי חלבון כתם של דגימות רקמה נגזר מן החיות.
לאחר 7-14 ימי MetCCL5 אינפוזיה, חילוף החומרים של גלוקוז, אינסולין התגובה היה לקוי בעכברים, כפי שניתן לראות את התוצאות של OGTT, ITT. מס הכנסה-1 serine302 זירחון הוגדל, הפעילות Akt צומצם בנוירונים היפותלמי עכברים בעקבות עיכוב CCL5. בסך הכל, הנתונים שלנו מציע כי חסימת CCL5 במוח העכבר מגביר זירחון של מס הכנסה-1 S302, פסיקות היפותלמי אינסולין איתות, המוביל לירידה בתפקוד האינסולין רקמות היקפיים, כמו גם ירידת ערך של גלוקוז חילוף החומרים.
האינסולין משפיע על מגוון רחב של רקמות כולל המוח. אינסולין עובר דרך מחסום הדם – מוח, מזין את מערכת העצבים המרכזית (CNS), נקשר עם קולטן לאינסולין (IR) בהיפותלמוס לווסת את צריכת המזון, הפעילות הסימפתטית ואת תגובת אינסולין היקפיים. דלקת כרונית ברקמות adipose היקפיים הוצע לתרום סוג 2 סוכרת (T2DM), אך כיצד תגובות דלקתיות אלו משפיעות על אינסולין מאותת בהיפותלמוס לתווך מערכתית אינסולין התגובה ואי סבילות לגלוקוז עדיין לא ברור. נוגדנים מסוימים להשתתף ויסות התיאבון וגם לוויסות טמפרטורת הגוף ההיפותלמוס1 כגון גידול נקרוזה מקדם-אלפא (TNFα), אינטרלויקין (IL)-6, IL-1β, מונוציט chemoattractant חלבון-1 (MCP-1), ו- CCL5 (C-C מוטיב ליגנד 5 ). בנוסף, דלקת בהיפותלמוס מוביל תנגודת לאינסולין T2DM2,3.
בין אלה נוגדנים, משינוי של רמות הביטוי של כימוקין CCL5 הקולטן שלו, CCR5, ברקמות adipose שויכה טרשת עורקים ואי סבילות לגלוקוז ב T2DM בני אדם, כמו גם בעלי חיים. CCL5 יש גם פונקציות נוירואנדוקריניים, לרבות ויסות טמפרטורת הגוף ושמירה מזון, בהיפותלמוס. לכן חשוב לחקור אם CCL5 משתתפת אינסולין אות הפעלה בתוך ההיפותלמוס או רקמות היקפיים.
אינסולין איתות מוסדר בחוזקה בתוך התאים. הכריכה של קולטני אינסולין כדי אינסולין (IR) מפעיל קולטן אינסולין חלבונים המצע (מס הכנסה), ואחריו phosphatidylinositol 3-קינאז (PI3K), חלבון קינאז B (PKB/AKT) הפעלה של גלוקוז טרנספורטר-4 (GLUT4) ממברנה טרנסלוקציה4 . חלבונים מס הכנסה הם הרגולטורים מפתח מסלול איתות זה: יש להם מספר שאריות טירוזין, סרין, אשר יכול להיות phosphorylated בתגובה חיובית או שלילית אינסולין מאותת5. לדוגמה, זרחון סרין 302-מס הכנסה-1 יכול להוביל דיסוציאציה גופנית של מס הכנסה-1 של IR, לחסום אותות אינסולין, שמוביל אינסולין ההתנגדות6. פעילות ירידת ערך של חלבונים מס הכנסה בהיפותלמוס הוכח לזירוז תנגודת לאינסולין וקנאות גלוקוז ב עכברים7.
אחת הדרכים הנפוצות ללמוד את הפונקציה של גן מסוים היא המניפולציה של הביטוי של גנים היעד מופצים ברחבי הגוף כולו של האורגניזם. עם זאת, ייתכן זה מספר חסרונות: 1) הוא יכול לייצר שונים תקינה או הבולמוס היזון חוזר לאורך זמן, שיטה 2) זו לא עוזר לנו להמחיש את התפקיד של החלבון היעד של אזורים ספציפיים במוח. בנוסף, ספציפיים ברקמות או תא ג’ין ההסתרה חיות זמן רב להתרבות, יקרות. לפיכך, אנו משתמשים במערכת משאבת osmotic לטווח קצר אינפוזיה המוח – דרך מהירה ונוחה יחסית להתערב עם האיתות של החלבון המטרה במוח בעזרת התרופה אנטגוניסט כדי להתגבר על הבעיות הנ. זריקות סטיאוטטי היה דורש מיומנות כירורגית מורכבות והשקעה נרחב במכשור ובזמן. ב פרוטוקול זה, אנו מספקים דרך פשוטה ובטוחה לביצוע הזרקה סטיאוטטי, שיטה מהירה, פחות מזיק, מיידי לזהות את ריכוז הגלוקוז בדם ולחקור את התפקיד של CCL5 בהיפותלמי אינסולין איתות רגולציה.
המנגנון של דלקת כרונית של נוגדנים קשורים כגון CCL5 והקולטן שלו – CCR5 להתפתחות סוכרת מסוג 2-עדיין לא ברור. דלקת כרונית גורמת מקרופאג חדירה לתוך רקמות adipose ומשפיע ברגולציה של adipokines; בינתיים, זה גם מושך תאי-β, מחליש את הפרשת האינסולין מ איי לנגרהנס בתגובה הגלוקוז בדם. ההיפותלמוס במוח ממלא תפקיד חשוב כמרכז הבקרה בתיאום אותות רקמות היקפיים מערכתית בוויסות התיאבון, מטבוליזם הגלוקוז הדם ההיקפיים, תגובת אינסולין אינסולין ו- adipokine. מחקרים גם מראים כי דלקת היפותלמי מוביל פגומים ויסות האנרגיה הומאוסטזיס וכן פגומים הלבלב איון של תפקודי כבד2,3,9,10. CCL5 במוח תורמת המזון צריכת וגוף לוויסות טמפרטורת11,ההיפותלמוס12; עם זאת, המתאם של CCL5 אל ההיפותלמוס ומערכתית אינסולין איתות ברור. CCL5 כל הגוף נוקאאוט עכבר (CCL5– / –) נוצרה כדי להתייחס לשאלה זו, אשר מראה של פנוטיפ עמידות לאינסולין עם רמות אינסולין גבוהות, רמות הגלוקוז בדם גבוהה בדם8. עם זאת, זה דורש הרבה זמן לפתח את פנוטיפ T2DM וזה קשה לחקור את התפקיד ואת מנגנון CCL5 אינסולין היפותלמי אות עקב תופעות אפשריות הבולמוס לטווח ארוך. לכן טפלול ישיר של CCL5 איתות בנוירונים ההיפותלמוס היא הגישה הטובה ביותר. יש, עם זאת, מספר סוגים של נוירונים באזור ההיפותלמוס, וזה די יקר וצורך ליצור תאים ספציפיים נוקאאוט עכברים. ניצול של ICV אינפוזיה מערכת יכול ובכך לחסוך זמן ומספקים גישה ספציפי יותר לתמרן את הפונקציה CCL5 ישירות במוח, תוך עקיפת אפשרי תגובות דלקתיות היקפיים.
לימודי ניצול משאבות osmotic שכבר פורסמו בעבר, מתן דוגמאות נהדר והדגמות של טכניקות מעורב ההשתלה של משאבות osmotic מכרסמים13. עם זאת, אנחנו בפני כמה אתגרים בעת ביצוע פרוטוקולים אלה במחקר שלנו. ראשית, חלק מהציוד בשימוש בפרוטוקול הוא די יקר, כולל 1) מערכת החשמל כדי להגיע למיקום, ציור, החדרת המחט לתוך מוח העכבר, 2) מערכת תרמו לשמירה על טמפרטורת הגוף עכבר ו- 3)-החמצן-איזופלוריין אספקת מערכת לניהול הרדמה לעכברים. שנית, הטכניקות המתוארות במאמרים אחרים היו קשים לשכפל כי היינו רק מסוגל להשתמש בבעלי חיים בתוך טווח קטן של משקולות הגוף בגילאים מסוימים עבור המחקר שלנו. . אנחנו מודעים לכך עכברים גדולים יותר מתאים יותר ניתוח ההשתלה. עם זאת, במחקר שלנו, נאלצנו להשתמש עכברים קטנים יותר ויותר צעירות כדי להימנע מעודף משקל ו השפעות ההזדקנות על תקנה גלוקוז לאינסולין ודם: רק זכר עכברים עם הגוף משקל 25 ± 2 g וגיל בסביבות בן חודשיים נבחרו במחקר. לפיכך, קשה לבצע ניתוח, תפר את הפצע על הראש העכבר. שלישית, לתגובה דלקתית יש ולהגזים לאחר הניתוח מאז ציטוקינים דלקתיים המטרה במחקר זה. עכברים וחולדות באפשרותך להסיר תפרים ולאחר פצעים פתוחים בקלות לאחר הניתוח, אשר לגרום לדלקת, להגדיל כימוקין תגובות. לכן, אסטרטגיה כדי להגיע את המיקום ואת לצייר את המחט לתוך מוח העכבר זה מונע זיהום משני הוא הכרחי. לכן, אנחנו ששינה את הפרוטוקולים שתואר לעיל כדי להפוך טכניקה זו העלות האפקטיבית, קל יותר, פחות מזיקים על חיות כמתואר בפסקה הבאה.
ראשית, היינו תרגיל הציפורן באופן ידני לקדוח חור סביב אזור היעד מסומן על הגולגולת, כפי שמתואר בשלב 2.6. בשיטה זו הוא העלות האפקטיבית, ומאפשר לנו לנטר את כל ההליך על מנת למנוע נזק את העכבר קרומי המוח וכלי הדם. תקנה גלוקוז בדם הוא לקוי לאחר שבץ חריפה, כגון דימום תת במוח. היפרגליקמיה חריפה והסימפטומים כמו סוכרת נצפו גם לאחר שבץ בתוך הגדרות קלינית14,15. בדומה לכך, מצאנו גם תגובת אינסולין וברמת גלוקוז לקוי בעכברים עם דימום ומוגלה במוח. אנו מודעים כי שליטה טובה יותר של הניתוח מבוסס על המדריך הכרחי להבטיח עקביות בתוצאות. שנית, אנחנו ניצלו biomaterial רפואי פיתח נפוץ במרפאות, רקמות דבק דבק (שלב 2.8), כדי לאטום את העור על הראש העכבר לאחר ניתוח, לפיכך, הימנעות תפרים, מאיץ את קצב הריפוי. זה מקל על ביצוע ניתוחים, מקטין את הסיכוי של דלקת משנית. שלישית, משך הזמן הנדרש לביצוע הליך כירורגי כולו הוא יחסית קצר יותר, אשר מגדילה את הסיכוי של ההישרדות של העכברים, מוריד את המינון של סם הרדמה להיות מוזרק intraperitoneally. אנחנו ציין שיעור הישרדות גבוה (95%) וקיבלתי תוצאות מדויקות יחסית לפי פרוטוקול זה שונה.
המגבלה של טכניקה זו היא מסגרת זמן קצרה יחסית של תרופות. למרות משאבת osmotic ניתן להציב לתוך הגוף העכבר לחלופין ללא פתיחה מחדש של המוח, המחקר שלנו רק מתמקד כימוקין דלקתיות ההשפעה על המוח לווסת את האיתות היקפית לאינסולין מערכתית. בניתוח נוסף ברקמות היקפיים יכול יכול לגרום לתגובה דלקתית ברקמות היקפיים, אשר אז להגדיל את הביטוי כימוקין דלקתיות להשפיע על התוצאות. שנית, זמן מחצית החיים של התרופה מגביל גם את משך הזמן של המחקר. חומרים כגון כימוקין בדרך כלל יש תוחלת חיים קצרה יותר, שמאבדת את פעילותה לאורך זמן, אבל זה גם מאפשר לנו לחקור את ההשפעה של CCL5 חוסמת איתות במוח לטווח קצר. מחקרים קודמים שלנו תיארו גם בגישה ההנדסה הגנטית ליצירת עכבר נוקאאוט CCL5, אשר מספק מודל עם השפעות לטווח ארוך8.
ישנם כמה טכניקות חדשות, שיטות אלטרנטיביות לספק סמים לתוך המוח. ננו-טכנולוגיה היא טכניקה חזקה, אשר יכול לשמש כדי לספק סמים לתוך מערכת העצבים המרכזית. עם זאת, תרופות רבות thermosensitive, יכול להיהרס כשאתה מנסה לארוז אותן לתוך חלקיקים16. בנוסף, חלקיקים יכולים לעבור BBB ולהיות uptaken על ידי תאים המתאימים siRNA או הסמים הנפוצים ביותר, אבל זה לא שיטה אידיאלית עבור איגוד קולטן ליגנד.CCL5 דורשת. מחייב את הקולטן שלו, CCR5, בתוך הנוירונים ARC ההיפותלמוס לקחת אפקט8, ואת מסירת CCL5 אנטגוניסט MetCCL5 לתוך הנוירונים באמצעות חלקיקים עלולה לגרום לאובדן של היכולת לאגד ולחסום CCR5 על התא השטח.
רמת הסוכר בדם היה גבוה משמעותית בעכברים מנוהל עם CCL5 MetCCL5-אנטגוניסט לעומת הפקדים (עכברים עם חנה המבר) במבחן סובלנות גלוקוז דרך הפה. אינסולין נוסף המינהל (מבחן עמידות לאינסולין) היתה גם אפשרות להורדת רמת הסוכר בדם ב- MetCCL5 קבלת עכברים (איור 4B), אשר טוען כי אינסולין אנדוגני וחיצוניים לא יכול להפחית את רמות הגלוקוז בדם בעת חסימת האיתות CCL5 ההיפותלמוס. עכברים הפך עמידות לאינסולין ללא פעילות CCL5 בהיפותלמוס. זרחון serine302 מוגבר של מס הכנסה-1 נמצאה בעכברים שקיבלו Met-CCL5 לעומת בקרת עכברים שקיבלו כלנית חדד (איור 5A-B). זרחון סרין 302 של מס הכנסה-1 הוכח לגרום דיסוציאציה גופנית של מס הכנסה-1 של הקולטן אינסולין, אשר הוא הגורם העיקרי עמידות לאינסולין6; אינסולין הוא מצליח להפעיל את אותות הזרם כגון מסלול PI3K-Akt. Ex-vivo אינסולין גירוי מחקר אישר האינסולין מולקולת איתות במורד הזרם Akt (p-AktS473) לא הופעלה על ידי אינסולין ברקמת היפותלמי העכבר רווי Met-CCL5 והגדילה, במקום זאת, זרחון סרין 302. בסך הכל, נתונים פיזיולוגיים (OGTT ו- ITT) והן במחקר מולקולרי מדגימים כי איתות CCL5 ההיפותלמוס שמתווכת התקנה האות ההיפותלמוס אינסולין, אשר תורמת חילוף החומרים, התנגדות, גלוקוז, אינסולין שיטתית.
התפקיד ואת מנגנון של CCL5 ושל CCR5 בחולי סוכרת השמנת יתר-הקשורים עדיין לא ברור. . Kitade et al. דיווח כי מחסור CCR5 מוגן עכברים דלקת הנגרמת השמנת יתר, גיוס macrophage, עמידות לאינסולין17. עם זאת, מחקרים אחרים על ידי קנדי. et al. למצוא תוצאה הפוכה המציין כי CCR5 לקוי פוגע גלוקוזה מערכתית, כמו גם אינסולין adipocyte ושרירים איתות18. שני המחקרים להחיל דיאטה עתירת שומן לזירוז השמנה, מה שמוביל דלקת כרונית כל הגוף ותגובה הבולמוס. מחקרים אלו לא סיפקו מנגנונים נקי וברור של CCL5 ושל CCR5 אינסולין איתות רגולציה. מצד שני, הטכניקה משאבת osmotic מאפשר אינפוזיה מסוים של המוח ומונעת תגובה לתת פיצוי עם מסירתה מוגבל בזמן.
לסיכום, למרות המשאבה osmotic עם מערכת העירוי המוח נראה טכניקת “מיושן”, הוא מספק שיטה זול יותר, קל יותר, פחות מזיק של תרופות, מסייעת לחקור את הפונקציה של ליגנד קולטן איתות ב המוח.
The authors have nothing to disclose.
אנו אסירי תודה תמך משרד המדע, הטכנולוגיה, טייוואן – MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3), הבריאות והרווחה, תמורת תשלום נוסף של מוצרי טבק – MOHW106-TDU-B-212-144001 S-Y. סי
Vetbond Tissue Adhesive | 3M | #1049SB | The glue used to seal the lesion site on the mouse head |
LOCTITE 454 instant adhesive | Durect Corporation | #8670 | The glue used to fix the needle on the mouse skull |
Alzet Micro- Osmotic Pump | Durect Corporation | #9922 | 0.11 μl per hour, 28 days |
Brain infusion system | Durect Corporation | #8851 | 1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain |
Glucometer | Roche | #06870244001 | Used to measure the blood glucose level |
Glucose chip | Roche | #06454011020 | Used to load the blood sample |
Evan's blue | Sigma | #MKBK0523V | To demonstrate the drug infusion area |
Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | #3232145 C | Used to administer insulin intraperitoneally |
MIO NE116 CONTROL UNIT (nail drill) |
Mio System | #E235-015 | To drill a hole in the skull of the mouse |
CCL5/Met-RANTES Protein | R&D | #ADB0111081 | Recombinant Human CCL5, E-coli derived |
aCSF formula | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
Filter sterilize with a 0.22 μm filter apparatus, and store at 4°C. aCSF is stable for 3-4 weeks |
|
Phospho-IRS-1 Serine302 antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
IRS-1 (D23G12) antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
Phospho-Akt Serine 473 antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:2000 dilution |
Akt (pan) (C67E7) antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:1000 dilution |
Animals: C57BL/6 | NAR Labs | Wild type mice strain used in the study |