Summary
Dit protocol bestudeert de rol van chemokine (C-C motief) ligand 5 (CCL5) in de hypothalamus door het leveren van een antagonist, MetCCL5, in de hersenen van de muis met behulp van een micro-osmotische hersenen infusie pompsysteem. Deze tijdelijke remming van CCL5 activiteit onderbroken hypothalame insuline signalering, wat leidt tot glucose-intolerantie en perifere systemische insulinegevoeligheid.
Abstract
Insuline regelt systematische metabolisme in de hypothalamus en de perifere insuline respons. Een ontstekingsreactie in het perifere adipeus weefsel draagt bij aan de ontwikkeling van type 2 diabetes mellitus (T2DM) en eetlust verordening in de hypothalamus. Chemokine CCL5 en C-C chemokine receptor Typ 5 (CCR5) niveaus hebben gesuggereerd om te bemiddelen aderverkalking en glucose intolerantie in diabetes mellitus type 2 (T2DM). Daarnaast CCL5 een neuro-endocriene rol speelt in de hypothalamus door het reguleren van voedsel inname en lichaamstemperatuur, dus vragen ons om haar functie in het hypothalame insuline signalering en de regulering van de perifere glucose metabolisme te onderzoeken.
De micro-osmotische pompsysteem voor de infusie van de hersenen is een snelle en precieze manier te manipuleren van de CCL5 functie en het effect ervan in de hersenen te bestuderen. Het biedt ook een handige alternatieve benadering voor het genereren van een knock-out transgene dieren. In dit systeem, werd signalering van CCL5 geblokkeerd door infusie van de intracerebroventricular (ICV) van de antagonist, MetCCL5, gebruik van een micro-osmotische pomp. De perifere glucose metabolisme en insuline respons werd ontdekt door de orale Glucose tolerantie Test (OGTT) en insuline tolerantie Test (ITT). Insuline signalering activiteit werd vervolgens geanalyseerd door eiwit vlek van weefselmonsters afgeleid van de dieren.
Na 7-14 dagen MetCCL5 infusie, het glucose metabolisme en insuline was respons verminderde in muizen, zoals te zien in de resultaten van de OGTT en de ITT. De IRS-1 serine302 fosforylatie werd verhoogd en de Akt-activiteit werd verlaagd in muizen hypothalame neuronen na CCL5 inhibitie. Over het geheel genomen suggereren onze gegevens dat het blokkeren van CCL5 in de hersenen muis de fosforylatie van IRS-1 S302 verhoogt en hypothalame insuline signalering onderbreekt, wat leidt tot een afname van de insuline functie in perifere weefsels, alsmede de bijzondere waardevermindering van glucose metabolisme.
Introduction
Insuline is van invloed op een breed scala aan weefsels, met inbegrip van de hersenen. Insuline bloed - hersenbarrière passeert, wordt het centrale zenuwstelsel (CNS) en bindt met insuline receptor (IR) in de hypothalamus te reguleren voedselinname, sympathische activiteit en perifere insuline respons. Chronische ontsteking in perifere vetweefsel heeft voorgesteld te dragen aan type 2 diabetes mellitus (T2DM), maar de invloed van deze ontstekingsreacties op insuline signalen in de hypothalamus te bemiddelen systemische insuline respons en glucose intolerantie blijft onduidelijk. Sommige chemokines deelnemen aan temperatuur eetlust verordening en lichaam in de hypothalamus1 zoals Tumornecrosefactor-alfa (TNFα), interleukine (IL) -6, IL-1β, monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) en CCL5 (C-C motief ligand 5 ). Daarnaast leidt ontsteking in de hypothalamus tot insulineresistentie in T2DM2,3.
Onder deze chemokines, de wijziging van expressie niveaus van chemokine CCL5 en haar receptor, CCR5, in vetweefsel heeft in verband gebracht met aderverkalking en glucose intolerantie in T2DM in zowel mensen als dieren. CCL5 heeft ook een neuro-endocriene functies, met inbegrip van de verordening van voedsel inname en lichaamstemperatuur, in de hypothalamus. Het is dus belangrijk om te onderzoeken of CCL5 deelneemt aan insuline signaal activering binnen de hypothalamus of de perifere weefsels.
Insuline signalering is strak gereguleerd binnen cellen. De binding van insuline aan insuline receptoren (IR) activeert insuline receptor substraat (IRS) eiwitten, gevolgd door phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) en proteïne kinase B (PKB/AKT) activering en glucose transporter-4 (GLUT4) membraan translocatie4 . IRS eiwitten zijn de belangrijkste regelgevers in dit signalering traject: ze hebben meerdere tyrosine en serine residuen, die kunnen worden phosphorylated in reactie op de positieve of negatieve insuline signalen5. Bijvoorbeeld, kan serine 302 fosforylatie op IRS-1 leiden tot de fysieke dissociatie van IRS-1 uit IR en blokkeren van insuline signaaltransductie, wat leidt tot insuline resistentie6. De verslechtering van de activiteit van de IRS eiwitten in de hypothalamus is gebleken voor het opwekken van insulineresistentie en glucose-intolerantie in muizen7.
Een gemeenschappelijke manier om de studie van de functie van een specifiek gen is de manipulatie van de uitdrukking van de doelgenen verspreid over het hele lichaam van het organisme. Dit kan wel enkele nadelen: 1) het kan het genereren van verschillende feedback regelgevende of compenserende-effecten na verloop van tijd en 2) deze methode niet helpt ons de rol van de proteïne van de doelgroep in de specifieke hersengebieden te illustreren. Ook weefsel - en cel-specifieke gen knockout dieren nemen een lange tijd om te fokken en zijn kostbaar. Dus, we gebruiken een op korte termijn hersenen osmotische pomp Infusiesysteem - een relatief snelle en gemakkelijke manier te bemoeien met de signalering van de doel-proteïne in de hersenen met behulp van de antagonist drug te overwinnen van de genoemde kwesties. Stereotactische injecties gebruikt om te eisen van ingewikkelde chirurgische vaardigheden en omvangrijke investeringen in instrumentatie en tijd. In dit protocol bieden wij een eenvoudige en veilige manier stereotactische injectie en een snel, minder schadelijk en momentane methode op te sporen van de concentratie van bloedglucose en onderzoeken van de rol van CCL5 in de hypothalamische insuline signalering van de verordening uit te voeren.
Protocol
Opmerking: Alle protocollen en methoden die worden gebruikt in dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd door institutionele Animal Care en gebruik commissies (IACUC) van de medische universiteit van Taipei (Protocol nummers: LAC-2014-0387)
1. voorbereiding van de Micro-osmotische pomp infusie systemen
Opmerking: Voorbereiden van de pomp, kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) buffer en drug (BMO-CCL5/RANTES eiwit oplossing (10 ng/mL in aCSF)) onder steriele omstandigheden met behulp van buffers gefilterd met filters van 0,2 µm en uitvoeren van alle procedures onder de motorkap van de cultuur met handschoenen. De chirurgieprocedures worden als volgt uitgevoerd:
- Voorbereiden van de micro-osmotische pompen een dag voor de operatie: de hersenen micro-osmotische pomp vullen met kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) met een spuit van 1 mL en bot-hoofd naald geleverd samen met de kit. Onderdompelen van de micro-osmotische pomp in aCSF en plaats deze op een shaker en schud voorzichtig 's nachts.
Let op: De pomp moet worden gevuld met aCSF, en luchtbellen moeten worden vermeden in de pomp (figuur 1A). - Voordat u begint chirurgie, bereid de recombinante BMO-CCL5/RANTES-eiwit-oplossing van (10 ng/mL, in verdunde aCSF) moet worden gebruikt in het experiment. Verwijderen van aCSF uit de pomp en vul de pomp met de drug-oplossing langzaam tot overmaat lekt.
Opmerking: 15 mL aCSF of BMO-CCL5/RANTES oplossing volstaat voor 5-8 pompen.
Let op: Herhaal de procedure om ervoor te zorgen dat de pomp helemaal vol met de drug zonder bubbels binnen. - De katheter-buizen in de gewenste lengte gesneden en voeg ze met de bot-end hersenen infusie naald in de hersenen infusie kit. Vul de infusie kit en buizen met de drug.
- Tot slot, monteren en de hersenen infusie kit hechten aan de micro-osmotische pomp.
Let op: Geen luchtbellen moeten worden gevormd in de buis of de pomp (figuur 1A). - Dompel de fusie van de gehele osmotische pomp-hersenen in aCSF in een gesteriliseerde 50 mL-buis instellen om te voorkomen dat de pomp uitdrogen. De osmotische pomp-hersenen fusion set is nu klaar om te worden gebruikt voor chirurgie.
Opmerking: De micro-osmotische pomp systemen kunnen worden gebruikt voor lange termijn drug infusie. Dit zorgt voor een veilige en handige wijze van levering van de drug in de hersenen van de muis.
2. intracerebrale ventriculaire chirurgie-implantatie van de micro osmotische pomp
Let op: Het chirurgische milieu met 75% ethanol steriliseren en ervoor zorgen dat de mensen die betrokken zijn bij de studie steriele handschoenen en een schone lab-jas dragen. Chirurgische instrumenten / instrumenten moeten vervolgens gesteriliseerde met 75% ethanol tussen muizen chirurgie, gesteriliseerde met autoclaaf en gedroogde vóór gebruik.
- Weeg de muis en het gebruik van intraperitoneale injectie (IP) met Ketamine/Xylazine anesthetize (Ketamine 50 mg/kg, Xylazine 10 mg/kg).
Let op: Muizen lichaam gewichten lager dan 24 g worden niet aanbevolen voor osmotische pomp implantatie chirurgie. - Monteren en bevestigen van het hoofd van de muis op de stereotactische apparatuur (figuur 1B).
- Gebruik een paar chirurgische scharen en tangen te snijden open de buitenhuid die betrekking hebben op de schedel. Gebruik jodium om de perifere schedel schoon te maken.
- De buitenste laag van de huid te scheiden van de subcutane huid met behulp van een paar van bot-hoofd tangen in de buurt van de nek regio voor de osmotische pomp-hersenen fusion instellen implantatie (Figuur 1 c).
- Mark de infusie punt met betrekking tot de kaart (Figuur 1 d) van de hersenen met behulp van het stereotactische apparaat. In dit experiment, de naald moet worden geïmplanteerd in de regio 3rd ventrikel (Bregma: 0.0 mm lateraal, 1.3 mm posterior, 5.7 mm ventrale).
- Boor een gat met een boor nagel rond het gebied gemarkeerd op de schedel (figuur 1E).
Let op: Wees voorzichtig niet te breken de muis hersenvliezen en bloedvaten, dus het vermijden van de verstoring van micro-bloedvaten in de hersenen. - Plaats de micro-osmotische pomp-hersenen fusion set met aCSF (als besturingselement) of drug (BMO-CCL5/RANTES eiwit oplossing) onder de huid achter de nek regio en steek de hersenen infusie naald in het geboorde gat te doordringen van de drug in de hersenen van de muis ( Figuur 1E). De naald zal doordringen van de hersenvliezen en krijgen in het ventrikel. Bevestig de naald in plaats op de schedel met behulp van oppervlakte desensibilisatie gel (figuur 1F) en 1-2 min wachten totdat de lijm droogt. Vervolgens afgesneden het projecteren deel op de top van de naald (figuur 1G- H).
- Gebruik van een lijm lijm van weefsel te genezen van de operatie wond op het hoofd. Breng 50 µL van de lijm op de top van de wond, beide zijden van de huid samen trekken en vasthouden voor 30 s om de huid te verzegelen (figuur 1I).
Let op: Gebruik 100% alcohol pad om de wond schoon na chirurgie en 100 ul penicilline met streptomycine om infectie te voorkomen. Opmerking: Muis huid zal vormen van littekenweefsel en genezen in een paar dagen na de toediening van de chirurgische lijm. Het belangrijkste voordeel van de lijm is het vermijden van chirurgische hechtingen die leiden irritatie van de huid of ontsteking tot kan. - Plaats de muis in een schone kooi op een warme plaat gehouden (verwarmd tot 37 ° C) en wachten totdat de muis van het verdovende effect herstelt.
Let op: Het is essentieel voor het handhaven van de lichaamstemperatuur van de muis om te vergroten de kans op overleving na de operatie. - Na een herstelperiode van een week, zal de muizen klaar zijn voor verdere experimenten, zoals de orale Glucose tolerantie Test (OGTT) en insuline tolerantie Test (ITT).
3. orale Glucose tolerantie Test (OGTT)
Opmerking: Voer de orale glucose tolerantie test 7 dagen na de infusie van aCSF en MetCCL5/RANTES (10 ng/mL, 100 µL). Het handhaven van een 6 h snel voor de muizen voordat OGTT met voldoende water. De dieren houden op dezelfde bank werk waar de experimenten uitgevoerd zodat ze kunnen acclimatiseren aan de omgeving om stress te verminderen tijdens de procedure.
- Glucose oplossing voorbereiding: vóór het uitvoeren van het experiment, bereid de glucose-oplossing door het oplossen van 3,75 g glucose in 15 mL gedistilleerd H2O.
- Een tijdschema instellen voor het opnemen van de lezingen tijdens de experimentele procedure (tabel 1).
Opmerking: Het is belangrijk dat een tijd-tabel met de juiste intervallen tussen elke bloed onderzoek dat nauwkeurige opname tijdens het experiment instellen. - Weeg elke muis na het vasten en het berekenen van de juiste hoeveelheid glucose worden geïnjecteerd.
- Glucometer (druk op de startknop om te controleren van de status van de batterij, zorg ervoor dat het functioneert voordat de test.)
- Glucose-chip
- Insuline spuit (0.3 mL insuline spuit)
- Scheermesjes
- Timer
Opmerking: De glucose-chip vereist slechts één druppel bloed. Wanneer het bloedmonster worden verzameld meer dan eens moet, gewoon druk uitoefenen door met uw vingers langs de staart van de muis meerdere malen terwijl het einde van de staart direct op de top van de chip te verzamelen van bloed. Het is niet nodig om te snijden de staart telkens terwijl het verzamelen van bloedmonsters.
4. insuline tolerantie Test (ITT)
Opmerking: De insuline tolerantie test en orale glucose tolerantie test moeten worden gepland ten minste 7 dagen uit elkaar om het vasten effect op dieren. De insuline tolerantie test (ITT), zal menselijke insuline (0,75 U/Kg) door middel van IP-injectie worden toegediend.
- Bereiding van 0,25 U insuline oplossing: Verdun 100U menselijke insuline aan de verhouding van 1:400 in zoutoplossing.
- Wegen van elke muis na het vasten en de ingespoten hoeveelheid insuline dienovereenkomstig te berekenen: het volume (µL) van 0,25 U insuline worden ingespoten IP = 3 X BW (0,75 U insuline/Kg lichaamsgewicht). Bijvoorbeeld: voor een muis met een gewicht van 28,8 g, injecteren: 28.8 X 3 = 86,4 µL (0,25 U verdund insuline) (tabel 2).
Let op: De dezelfde dieren wellicht verschillende lichaam gewichten na 6 uur vasten op verschillende dagen. Het is dus nodig voor het meten van het lichaamsgewicht, vlak voor en na de vasten en gedrag die de OGTT en de ITT test. Muis lichaamsgewicht zou dalen afhankelijk van de soort, geslacht en vasten duur. Hogere doseringen van insuline insuline schok zou kunnen veroorzaken en zou leiden tot de dood van het dier. - Een tabel (tabel 2) instellen om vast te leggen van de lezingen tijdens de experimentele procedure. Herhaal de stappen 3.4. tot 3.8. voor de meting van de bloedglucosespiegels wordt vermeld.
Representative Results
Chirurgische implantaties van osmotische infuuspompen met beide aCSF als control of CCL5 antagonist BMO-CCL5 (tot de CCL5 effecten in de hersenen blokkeren) werden uitgevoerd op de muizen. Op 7 en 14 dagen na de operatie, werden de perifere glucosetolerantie en insuline respons van muizen geanalyseerd met behulp van OGTT (na 7 dagen) en ITT (na 14 dagen) zoals vermeld in het protocol. De orale glucose tolerantie test (OGTT) en insuline tolerantie test (ITT) van muizen werden uitgevoerd na 6 uur vasten. Muizen werden oraal, met het bedrag op basis van hun respectieve lichaam gewichten met glucose toegediend. De wijzigingen in de niveaus van de glucose van het bloed waren geregistreerd, zoals afgebeeld in Figuur 3. De insuline gevoeligheidstest werd uitgevoerd door intraperitoneaal (IP) insuline-injectie in muizen en de verandering van bloedglucose niveau onmiddellijk werd gemeten. De veranderingen van de niveaus van de glucose van het bloed op insuline stimulatie in muizen met verschillende infusie drugs werden geregistreerd, zoals weergegeven in Figuur 4. De bloedglucose niveau werd slechts licht verminderd na glucose administratie (figuur 3B) en insuline-injectie (figuur 4B) in muizen met CCL5 infusie van de antagonist (MetCCL5) in vergelijking met muizen met aCSF infusie. Deze resultaten stellen voor bijzondere waardeverminderingen in functie van de insuline op perifere glucose metabolisme in muizen met BMOCCL5 toegediend in de hersenen.
Vervolgens geanalyseerd wij de activering van insuline signaal door de IRS-1 fosforylatie en Akt activering niveaus in hypothalame weefsels te evalueren. De serine fosforylatie op 302 van IRS-1 was upregulated in muizen behandeld met antagonist (MetCCL5) (figuur 5B-C) wanneer muizen normaal werden gevoed. In de controlegroep, aCSF naar de hypothalamus muizen werd bestuurd en de uitdaging van de insuline geactiveerd de stroomafwaarts signaal molecuul Akt (gefosforyleerd Akt Serine 473) (figuur 5D, F) zonder verhoging van de IRS-1 serine302 activering () Figuur 5D -E) en Akt serine473 fosforylering. Daarentegen het Akt-signaal niet in muizen doordrenkt met BMOCCL5 werd verhoogd, maar er was een toename van fosforylering van IRS-1 serine 302 in plaats daarvan. Ondertussen, het CCL5 signaal in de hersenen muis blokkeren onderbroken insuline activiteit in de hypothalamus en verminderde perifere insuline functie. Uit onze algemene bevindingen, zoals de resultaten van de ITT OGTT en de ex vivo de uitdaging van de insuline, concluderen we dat CCL5 in de hypothalamus tot insuline signaal activering en perifere glucose metabolisme op insuline stimulatie bijdraagt.
Figuur 1. Osmotische pomp voorbereiding en implantatie chirurgische ingreep in muis. (A) de hersenen infusie kit en pomp voorbereiding geperfundeerd met drug oplossing. Rode pijlen geven de katheter buizen gevuld met vloeistof. (B) Fix en mount het hoofd van de muis op het stereotactische apparaat. (C) apart de buitenste laag van de huid van de subcutane huid voor de inplanting van micro-osmotische pomp-hersenen infusie instellen; Dash lijnen geven de locatie van de osmotische pomp implantaten. (D) de pijl geeft aan de kant van de infusie. (E) boor een gat rond het gemarkeerde gebied op de schedel. (F) plaats de osmotische pomp-hersenen infusie in de achterkant van de muis instellen en de hersenen infusie naald in het geboorde gat (dash omcirkeld) invoegen. (G) de naald op de schedel met behulp van weefsel-Lijm lijm bevestigen en losmaken van de top van de naald (Scissor wees in G) zoals in (H). (ik) zegel met behulp van de wond weefsel Lijm lijm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Beelden van de vertegenwoordiger van de drug diffusie ruimte indien het geneesmiddel wordt toegediend in de ventriculaire regio met behulp van de osmotische pomp. Evan's blue is de representatieve drug die wordt gebruikt in de osmotische pomp drug infusie illustratie in de ventriculaire regio (A) en verspreiding in laterale en derde ventrikel (B). Schaal bar = 0.5 cm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Glucose metabolisme van de muizen na de operatie door de orale glucose tolerantie test (OGTT) gemeten. De verdeling van de niveaus van de glucose van het bloed veranderd na de orale toediening van glucose in WT muizen met aCSF (A) en antagonist, MCCL5 doordrenkt (B). Gegevens weergegeven als gemiddelde ± SE. (figuur gewijzigd van8). * p < 0,05, door two-way ANOVA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. De functie van de insuline in muizen bloedglucose - de insuline tolerantie test (ITT). De verdeling van de niveaus van de glucose van het bloed veranderd na insuline injectie in WT muizen doordrenkt met aCSF (A), en doordrenkt met antagonist, MCCL5 (B). Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± SE (figuur gewijzigd van8). p < 0.001, door two-way ANOVA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. Insuline signaal activiteit in muizen na chirurgie. (A) westelijke bevlekken van de remmende Serine 302 fosforylatie vorm van IRS-1 (insuline reactie substraat-1, pIRS1S302) in muizen hypothalamus weefsels behandeld met aCSF of CCL5 de antagonist, MetCCL5 (CCL5M) infusiepomp. (B) verwante niveaus van fosfor-IRS-1S302 na de infusie in muizen hypothalamus met de normale voeding.(C) westelijke bevlekken voor de S302 fosforylatie van IRS-1 en Akt activering (fosfor-Akt S473, pAktS473) met of zonder stimulatie van de insuline in hypothalame weefsel na aCSF of METCCL5 infusie. (D-E) Relatieve niveaus van pIRS-1S302, pS6KT421, en pAktS473. ("2" in elke staafdiagram staat voor: n = 2 voor alle ondermeer). (De lege bars in 5D-E, links: zonder insuline; de stroken bars in 5D-E, rechts: met insuline). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| # | Muis-ID | Lichaam | Glucose | Start | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| gewicht | L = 10xBW | tijd | minuten | minuten | minuten | minuten | minuten | ||
| 1 | 501 | 25.8g | 258 | 9:00 | 9:00 | 9:00 | 9:15 | 9:30 | 10:00 |
| 2 | 502 | 25.3g | 253 | 9:07 | 9:07 | 9:07 | 9:22 | 9:37 | 10:07 |
Tabel 1. Tijdschema voor de orale Glucose tolerantie Test (OGTT) opname
| # | Muis-ID | Lichaam | Insuline 0,25 IU | Start | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| gewicht | L = 3xBW | tijd | minuten | minuten | minuten | minuten | minuten | ||
| 1 | 501 | 28,8 g | 86,4 | 9:00 | 9:00 | 9:15 | 9:30 | 10:00 | 10:30 |
| 2 | 502 | 25.3g | 75,9 | 9:07 | 9:07 | 9:22 | 9:37 | 10:07 | 10:37 |
Tabel 2. Tijdschema voor de opname van insuline tolerantie Test (ITT)
Discussion
Het mechanisme van chronische ontsteking en verwante chemokines zoals CCL5 en de receptor-CCR5 in de ontwikkeling van type 2 diabetes blijft onduidelijk. Chronische ontsteking veroorzaakt macrofaag infiltratie in vetweefsel en beïnvloedt de regulering van de adipokines; in de tussentijd ook trekt de β-cellen en belemmert de insuline secretie van de eilandjes van Langerhans in reactie op bloedglucose. Hypothalamus in de hersenen speelt een belangrijke rol als een control-center in het coördineren van insuline en adipokine signalen van de systemische perifere weefsels bij het reguleren van de eetlust, metabolisme van perifeer bloed glucose en insuline respons. Veel studies blijkt ook dat de hypothalamische ontsteking tot defect regulering van energie homeostase en defecte alvleesklier islet alsmede leverfunctie2,,3,,9,10 leidt. CCL5 in de hersenen draagt bij tot de voedsel-inname en lichaam temperatuur-regeling in de hypothalamus11,12; de correlatie van CCL5 met de hypothalamische en systemische insuline signalering is echter onduidelijk. Een muis van de knock-out van CCL5-hele lichaam, (CCL5- / -) is gegenereerd om aan te pakken van deze vraag, die een insuline resistentie fenotype met hogere niveaus van de insuline en hoge bloedglucosespiegels in bloed8toont. Echter, het vereist een lange tijd aan het ontwikkelen van het fenotype van de T2DM en het is moeilijk te onderzoeken van de rol en het mechanisme van CCL5 in de hypothalamische insuline signaal als gevolg van mogelijke compenserende langetermijneffecten. Een directe manipulatie van CCL5 signalering in hypothalame neuronen is daarom de beste aanpak. Er zijn echter meerdere soorten neuronen in de hypothalamische regio en het is heel duur en tijdrovend voor het genereren van cel specifieke knock-out muizen. Met behulp van een ICV kan Infusiesysteem dus Bespaar tijd en zorgen voor een meer specifieke benadering om te manipuleren van de functie van de CCL5 direct in de hersenen, het omzeilen van mogelijke perifere ontstekingsreacties.
Studies met behulp van osmotische pompen al verschenen eerder, bieden grote voorbeelden en demonstraties van de technieken die betrokken zijn bij de inplanting van osmotische pompen in knaagdieren13. Echter, we geconfronteerd een paar uitdagingen terwijl na deze protocollen in onze studie. Ten eerste, enkele van de apparatuur die wordt gebruikt in het protocol is vrij duur, met inbegrip van 1) het elektrische systeem om te bereiken van de locatie, tekenen en invoegen van de naald in de hersenen van de muis, 2) de thermo-systeem voor het handhaven van de lichaamstemperatuur van de muis en 3) de zuurstof-Isofluraan leveren systeem voor het toedienen van anesthesie aan muizen. Ten tweede, de technieken beschreven in andere artikelen waren moeilijk te repliceren omdat we konden alleen gebruik maken van dieren binnen een klein bereik van lichaam gewichten en op bepaalde leeftijden voor onze studie. We zijn bewust dat grotere muizen meer geschikt voor chirurgie en implantatie zijn. Echter in onze studie, moesten we gebruik maken van kleinere en jongere muizen om te voorkomen dat de overgewicht en de gevolgen van de veroudering op insuline en bloed glucose-verordening: alleen mannelijke muizen met lichaam 25 ± 2 g en leeftijd gewicht ongeveer 2 maanden oud in de studie werden gekozen. Het is dus moeilijk uit te voeren operatie en suture van de wond op het hoofd van de muis. Ten derde moet de inflammatoire respons na de operatie worden geminimaliseerd, omdat een inflammatoire cytokine de doelgroep in deze studie is. Muizen en ratten kunnen verwijderen hechtdraad en open wonden gemakkelijk na de operatie, die zal leiden tot ontstekingen en chemokine reacties te verhogen. Daarom is een strategie voor het bereiken van de locatie en tekenen en invoegen de naald in de hersenen muis die secundaire infectie vermijdt noodzakelijk. Dus bewerkt we de eerder beschreven protocollen om deze techniek kosteneffectieve, makkelijker, en minder schadelijk zijn voor de dieren, zoals beschreven in de volgende paragraaf.
Ten eerste, we gewend een nagel boor handmatig boor een gat rond het doelgebied gemarkeerd op de schedel, zoals beschreven in stap 2.6. Deze methode is kosteneffectief en laat ons toe om de controle op de gehele regeling om te voorkomen beschadiging van de muis hersenvliezen en de bloedvaten. Bloed glucose verordening is verminderde na een acute herseninfarct, zoals een bloeding in de hersenen. Acute hyperglycemie en diabetes-achtige ziektebeelden werden ook waargenomen na een herseninfarct in klinische instellingen14,15. Ook vonden wij ook verminderde glucose-niveau en insuline reactie in muizen met bloeding en pus in de hersenen. We zijn bewust dat betere controle van de handleiding gebaseerde operatie noodzakelijk is te zorgen voor samenhang van de resultaten. Ten tweede, we profiteerde van een nieuw ontwikkelde medische biomaterial vaak gebruikt in klinieken, weefsel Lijm lijm (stap 2.8), voor het afdichten van de huid op de kop van de muis na de operatie, vandaar, het vermijden van steken en versnelling van het tempo van de genezing. Dit maakt van chirurgische procedures eenvoudiger uit te voeren en vermindert de kans op secundaire ontsteking. Ten derde, de tijd die nodig is voor het uitvoeren van de gehele chirurgische ingreep is relatief korter, dat verhoogt de kans op overleving voor de muizen en verlaagt de dosering van verdoving drug intraperitoneally wordt geïnjecteerd. We waargenomen een hoge overlevingskans (95%) en betrekkelijk nauwkeurige resultaten verkregen door het volgen van dit gewijzigde protocol.
De beperking van deze techniek is de relatief korte tijdsbestek voor drug delivery. Hoewel een osmotische pomp kan worden geplaatst in het lichaam van de muis ook zonder heropening op de hersenen, onze studie alleen richt zich op de inflammatoire chemokine effect op de hersenen reguleren de perifere systemische insuline signalering. Extra chirurgie in perifere weefsels kan eventueel het induceren van een ontstekingsreactie in de perifere weefsels, die vervolgens zou verhogen inflammatoire chemokine expressie en invloed op de resultaten. Ten tweede, de halfwaardetijd van de drug ook beperkt de duur van de studie. Recombinante eiwitten zoals chemokine hebben meestal een kortere halfwaardetijd, die haar activiteit na verloop van tijd, verliest hoewel het ook ons toelaat te bestuderen van het effect van blokkerende CCL5 signalering in de hersenen op de korte termijn. Onze vorige studies hebben ook een benadering van de genetische modificatie voor het genereren van een CCL5 uitnemen muis, waarmee een model met lange termijn effecten8beschreven.
Er zijn enkele nieuwe technieken en alternatieve methoden voor het leveren van geneesmiddelen in de hersenen. Nanotechnologie is een krachtige techniek, die kan worden gebruikt voor het leveren van geneesmiddelen in het centrale zenuwstelsel. Hittegevoelige zijn echter veel drugs en kunnen worden vernietigd wanneer het proberen om ze te verpakken in nanodeeltjes16. Daarnaast nanodeeltjes kan passeren van BBB en uptaken door cellen die geschikt voor siRNA of meest voorkomende drugs zijn, maar het is niet een ideale methode voor het ligand-receptor binden.CCL5 vereist binding aan de receptor, CCR5, in de hypothalamus ARC neuronen te nemen effect8, en de levering van CCL5 antagonist MetCCL5 in de neuronen via nanodeeltjes kan leiden tot een verlies van het vermogen om te binden en blokkeren CCR5 op de cel oppervlak.
De bloedglucose niveau was significant hoger in muizen in de orale glucose tolerantie test met de CCL5 MetCCL5-antagonist in vergelijking met de besturingselementen (muizen met aCSF beheerd) toegediend. Extra insuline toediening (insuline tolerantie test) kon ook verlaagt het bloedglucose niveau in MetCCL5 ontvangen van muizen (figuur 4B), waarin wordt voorgesteld dat zowel endogene als externe insuline niveaus van de glucose van het bloed niet kan verminderen tijdens het blokkeren van hypothalame CCL5 signalering. Muizen werd insulineresistentie zonder CCL5 activiteit in de hypothalamus. Verhoogde serine302 fosforylering van IRS-1 werd gevonden in de muizen BMO-CCL5 in vergelijking met controle muizen ontvangen aCSF (figuur 5A-B) ontvangen. Serine 302 fosforylatie van IRS-1 is gebleken voor het opwekken van een fysieke dissociatie van IRS-1 van de insuline-receptor, dat een belangrijke oorzaak van insuline resistentie6 is; insuline kan niet activeren downstream signalen zoals de PI3K-Akt-pathway. Een ex vivo -studie van het insuline-stimulatie bevestigde de stroomafwaartse signalering molecuul Akt (p-AktS473) werd niet geactiveerd door insuline in muis hypothalame weefsel insuline toegediend met BMO-CCL5 en in plaats daarvan de serine 302 fosforylatie verhoogd. Over het geheel genomen zowel fysiologische gegevens (OGTT en ITT) en moleculair onderzoek tonen aan dat het hypothalame CCL5 signalering bemiddelt de hypothalamische insuline signaal verordening, die aan de systematische insuline resistentie en glucose metabolisme bijdraagt.
De rol en het mechanisme van CCL5 en CCR5 in diabetes obesitas-geassocieerde blijft onduidelijk. Kitade et al. rapporteerde dat CCR5-deficiëntie muizen beschermd tegen zwaarlijvigheid-veroorzaakte ontsteking, macrofaag aanwerving en insuline resistentie17. Echter, andere studies door Kennedy et al. vond tegenovergestelde resultaten die aangeeft dat CCR5-deficiëntie schaadt systemische glucosetolerantie, evenals adipocyte en spier insuline signalering van18. Beide onderzoeken van toepassing een vetrijke dieet om te induceren van obesitas, wat tot chronische ontsteking van de hele lichaam en compenserende reactie leidt. Deze studies hebben geen schone en duidelijke mechanismen voor CCL5 en CCR5 in insuline signalering verordening verstrekt. Aan de andere kant, de osmotische pomp techniek kan een specifieke infusie van hersenen en vermijdt compenserende reactie met haar tijd-beperkte levering.
Kortom, hoewel de osmotische pomp met de hersenen Infusiesysteem lijkt te zijn van een "ouderwetse" techniek, het levert een goedkoper, eenvoudiger en minder schadelijke methode voor drug delivery en helpt onderzoeken de functie van ligand-receptor signalering de hersenen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn dankbaar de ondersteunde van het ministerie van wetenschap en technologie, Taiwan – MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) en gezondheid en het welzijn toeslag van tabaksproducten - MOHW106-TDU-B-212-144001 tot S-Y C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | #1049SB | The glue used to seal the lesion site on the mouse head |
| LOCTITE 454 instant adhesive | Durect Corporation | #8670 | The glue used to fix the needle on the mouse skull |
| Alzet Micro- Osmotic Pump | Durect Corporation | #9922 | 0.11 μl per hour, 28 days |
| Brain infusion system | Durect Corporation | #8851 | 1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain |
| Glucometer | Roche | #06870244001 | Used to measure the blood glucose level |
| Glucose chip | Roche | #06454011020 | Used to load the blood sample |
| Evan's blue | Sigma | #MKBK0523V | To demonstrate the drug infusion area |
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | #3232145 C | Used to administer insulin intraperitoneally |
| MIO NE116 CONTROL UNIT (nail drill) |
Mio System | #E235-015 | To drill a hole in the skull of the mouse |
| CCL5/Met-RANTES Protein | R&D | #ADB0111081 | Recombinant Human CCL5, E-coli derived |
| aCSF formula | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
Filter sterilize with a 0.22 μm filter apparatus, and store at 4°C. aCSF is stable for 3-4 weeks |
|
| Phospho-IRS-1 Serine302 antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
| IRS-1 (D23G12) antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
| Phospho-Akt Serine 473 antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:2000 dilution |
| Akt (pan) (C67E7) antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:1000 dilution |
| Animals: C57BL/6 | NAR Labs | Wild type mice strain used in the study |
References
- Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. Chemokines/intercrines and central regulation of feeding. Am J Physiol. 266, R1711-R1715 (1994).
- Milanski, M., et al. Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver. Diabetes. 61, 1455-1462 (2012).
- Wang, X., et al. Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet. Experimental diabetes research. 2012, 847246 (2012).
- Benomar, Y., et al. Insulin and leptin induce Glut4 plasma membrane translocation and glucose uptake in a human neuronal cell line by a phosphatidylinositol 3-kinase- dependent mechanism. Endocrinology. 147, 2550-2556 (2006).
- Gual, P., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Positive and negative regulation of insulin signaling through IRS-1 phosphorylation. Biochimie. 87, 99-109 (2005).
- Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302. The Journal of biological chemistry. 279, 35298-35305 (2004).
- Boura-Halfon, S., Zick, Y. Phosphorylation of IRS proteins, insulin action, and insulin resistance. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism. 296, E581-E591 (2009).
- Chou, S. Y., et al. CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5. Sci Rep. 6, 37659 (2016).
- Calegari, V. C., et al. Inflammation of the hypothalamus leads to defective pancreatic islet function. J Biol Chem. 286, 12870-12880 (2011).
- Mighiu, P. I., Filippi, B. M., Lam, T. K. Linking inflammation to the brain-liver axis. Diabetes. 61, 1350-1352 (2012).
- Tavares, E., Minano, F. J. RANTES: a new prostaglandin dependent endogenous pyrogen in the rat. Neuropharmacology. 39, 2505-2513 (2000).
- Appay, V., Rowland-Jones, S. L. RANTES: a versatile and controversial chemokine. Trends in immunology. 22, 83-87 (2001).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. J Vis Exp. , e50326 (2013).
- Wang, N., et al. Admission blood glucose and in-hospital clinical outcome among patients with acute stroke in Inner Mongolia, China. Clin Invest Med. 32, E151-E157 (2009).
- Olsen, T. S. Blood glucose in acute stroke. Expert Rev Neurother. 9, 409-419 (2009).
- De Jong, W. H., Borm, P. J. Drug delivery and nanoparticles:applications and hazards. Int J Nanomedicine. 3, 133-149 (2008).
- Kitade, H., et al. CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status. Diabetes. 61, 1680-1690 (2012).
- Kennedy, A., et al. Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305, E897-E906 (2013).
