هذا البروتوكول الدراسات دور chemokine يجند (ج-C عزر) 5 (CCL5) في تحت المهاد بتقديم خصم، يلتقيCCL5، في الدماغ الماوس باستخدام نظام ضخ مضخة صغيرة ناضح الدماغ. هذا تثبيط النشاط CCL5 عابرة مقاطعة الأنسولين طائي الإشارات، مما يؤدي إلى التعصب الجلوكوز وحساسية الأنسولين المحيطية الجهازية.
وينظم الأنسولين الأيض المنهجي في تحت المهاد واستجابة الأنسولين المحيطية. فعل التهاب في الأنسجة الدهنية المحيطة يسهم في تطوير نوع 2 السكري (T2DM) وتنظيم الشهية في تحت المهاد. اكتب مستقبلات تشيموكيني CCL5 تشيموكيني وج-ج 5 (CCR5) مستويات قد اقترحت التوسط التعصب تصلب الشرايين والسكر في نوع 2 السكري (T2DM). وبالإضافة إلى ذلك، CCL5 دوراً الجهاز الهرموني في تحت المهاد عن طريق تنظيم الغذاء المدخول والجسم درجة الحرارة، وهكذا، مما دفع بنا التحقيق في وظيفتها في إشارات الأنسولين طائي وتنظيم استقلاب الجلوكوز المحيطية.
نظام ضخ الدماغ المضخة الصغيرة ناضح طريقة سريعة ودقيقة للتعامل مع الدالة CCL5 ودراسة أثره في الدماغ. كما يوفر نهج بديلة ملائمة لتوليد من الحيوانات المحورة وراثيا بالضربة قاضية. في هذا النظام، مما يشير إلى CCL5 تم حظره بواسطة ضخ إينتراسيريبروفينتريكولار (ICV) خصم، يلتقيCCL5، استخدام مضخة صغيرة ناضح. تم الكشف عن استجابة الأيض والإنسولين الجلوكوز المحيطية باختبار التسامح الجلوكوز عن طريق الفم (OGTT) واختبار التسامح الأنسولين (ITT). وقد تم تحليل الأنسولين مما يشير إلى النشاط ثم بوصمة عار البروتين من عينات الأنسجة المشتقة من الحيوانات.
بعد 7-14 يوما وضخ MetCCL5، واستقلاب الغلوكوز والإنسولين كان ضعف الاستجابة في الفئران، كما يتبين من نتائج OGTT وأي تي تي. زيادة الفسفرة serine302 مصلحة الضرائب-1 وتم تخفيض النشاط أكت في الفئران طائي عقب CCL5 تثبيط الخلايا العصبية. إجمالاً، لدينا البيانات توحي بأن حجب CCL5 في الدماغ الماوس يزيد الفسفرة من مصلحة الضرائب-1 S302 ويقطع إشارات الأنسولين طائي، مما يؤدي إلى انخفاض في وظيفة الأنسولين في الأنسجة المحيطية، فضلا عن الأضرار الجلوكوز الأيض.
يؤثر الأنسولين على مجموعة متنوعة واسعة من الأنسجة بما في ذلك الدماغ. الأنسولين يمر عبر حاجز الدم في الدماغ، ويدخل في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، ويربط مع مستقبلات الأنسولين (الأشعة تحت الحمراء) في تحت المهاد لتنظيم تناول الطعام والنشاط متعاطفة واستجابة الأنسولين المحيطية. واقترح التهاب مزمن في الطرفية الأنسجة الدهنية للمساهمة في نوع السكري 2 (T2DM)، ولكن كيف تؤثر هذه التفاعلات التحريضية على الأنسولين إشارات في تحت المهاد للتوسط من أجل التعصب واستجابة والجلوكوز الأنسولين الجهازية لا يزال غير واضح. بعض المستقطبات المشاركة في تنظيم الشهية وتنظيم درجة حرارة الجسم في تحت المهاد1 مثل عامل نخر الورم-ألفا (TNFα)، انترلوكين (إيل)-6، إيل-1β، الوحيدات chemoattractant البروتين-1 (العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1)، و CCL5 (ج-C الحافز يجند 5 ). وباﻹضافة إلى ذلك، التهاب في تحت المهاد يؤدي إلى مقاومة الأنسولين في T2DM2،3.
بين هذه المستقطبات، وتغيير مستويات التعبير من تشيموكيني CCL5 ولها مستقبلات، CCR5، في الأنسجة الدهنية ارتبطت بالتعصب تصلب الشرايين والسكر في T2DM في البشر، فضلا عن الحيوانات. وقد CCL5 أيضا وظائف الغدد الصم العصبية، بما في ذلك تنظيم درجة حرارة الجسم وتناول الطعام، في تحت المهاد. وبالتالي من المهم للتحقيق في ما إذا كان CCL5 وتشارك في تنشيط إشارة الأنسولين داخل تحت المهاد أو الأنسجة المحيطة.
وينظم الأنسولين مما يشير إلى محكم داخل الخلايا. ربط مستقبلات الأنسولين إلى الأنسولين (الأشعة تحت الحمراء) ينشط مستقبلات الأنسولين الركازة (IRS) البروتينات، تليها فوسفاتيديلينوسيتول 3-كيناز (PI3K) وبروتين كيناز ب (حزب/AKT) التنشيط والجلوكوز الناقل-4 (GLUT4) غشاء إزفاء4 . هي بروتينات IRS المنظمين الرئيسيين في هذا المسار مما يشير إلى: لديهم بقايا تيروزين وسيرين متعددة، التي يمكن أن تكون فوسفوريلاتيد في الاستجابة بإيجابية أو سلبية الأنسولين إشارات5. على سبيل المثال، يمكن أن يؤدي إلى الانفصال الجسدي لمصلحة الضرائب-1 من الأشعة تحت الحمراء الفسفرة سيرين 302 في مصلحة الضرائب-1 وعرقلة توصيل الإشارة الأنسولين، مما يؤدي إلى مقاومة الأنسولين6. لقد ثبت إعاقة نشاط البروتينات IRS في تحت المهاد للحث على مقاومة الأنسولين وتعصب الجلوكوز في الفئران7.
إحدى الطرق الشائعة لدراسة وظيفة جين معين يتم التلاعب بالجينات المستهدفة موزعة في جميع أنحاء الجسم بأكمله في الحي. ومع ذلك، قد يكون لعيوب عدة: 1) فإنه يمكن أن تولد آثار ردود فعل مختلفة التنظيمية أو تعويضية على مر الزمن ولم تساعدنا 2) هذا الأسلوب في توضيح دور البروتين المستهدفة في مناطق محددة من الدماغ. أيضا، الخاصة بالانسجة والخلايا الجينات خروج المغلوب الحيوانات تستغرق وقتاً طويلاً لتربية وباهظة التكلفة. وهكذا، نستخدم مضخة ناضح الدماغ قصيرة الأجل ضخ نظام-بطريقة سريعة ومريحة نسبيا تتداخل مع إشارات من البروتين المستهدف في الدماغ باستخدام الدواء مضاد للتغلب على المسائل المذكورة أعلاه. حقن المناظير باستخدام الأشعة المستخدمة لتتطلب مهارة جراحية معقدة واستثمارات واسعة النطاق في الأجهزة والوقت. في هذا البروتوكول، نحن نقدم طريقة بسيطة وآمنة لإجراء حقن المناظير باستخدام الأشعة وأسلوب أقل ضررا وسريعة وفورية للكشف عن تركيز الجلوكوز في الدم، والتحقيق في دور CCL5 في طائي الأنسولين مما يشير إلى التنظيم.
إليه التهاب مزمن والمستقطبات ذات الصلة مثل CCL5 ولها مستقبلات – CCR5 في التنمية لداء السكري من النوع 2 لا يزال غير واضح. التهاب مزمن يسبب بلعم تسلل إلى داخل الأنسجة الدهنية ويؤثر على تنظيم أديبوكينيس؛ وفي الوقت نفسه، يجذب خلايا بيتا أيضا ويعوق إفراز الأنسولين من جزر لانجرهانز في الاستجابة الجلوكوز في الدم. تحت المهاد في الدماغ يلعب دوراً هاما كمركز لتحكم في تنسيق إشارات الأنسولين وأديبوكيني من الأنسجة المحيطية الجهازية في تنظيم الشهية والايض الجلوكوز في الدم المحيطي، واستجابة الأنسولين. كما تشير العديد من الدراسات أن التهاب طائي يؤدي إلى خلل تنظيم التوازن الطاقة فضلا عن جزيرة البنكرياس معيبة ووظيفة الكبد2،3،،من910. CCL5 في المخ يساهم في تنظيم درجة الحرارة الجسم وتناول الغذاء في11،تحت المهاد12؛ ومع ذلك، الترابط بين CCL5 لإشارات الأنسولين طائي والجهازية غير واضح. تم إنشاؤها لمعالجة هذه المسألة، مما يدل النمط الظاهري مقاومة الأنسولين مع ارتفاع مستويات الأنسولين ومستويات السكر في الدم مرتفعة في الدم8ماوس خروج المغلوب جسم كله CCL5 (CCL5–/–). ومع ذلك، فإنه يتطلب وقتاً طويلاً لتطوير النمط الظاهري T2DM ومن الصعب التحقيق في دور وآلية CCL5 في إشارة الأنسولين طائي بسبب الآثار تعويضية طويلة الأجل. ولذلك، تلاعب مباشر CCL5 الإشارات في الخلايا العصبية طائي هو أفضل النهج. ومع ذلك، هناك أنواع متعددة من الخلايا العصبية في منطقة طائي وأنها مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً لإنشاء خلية محددة بالضربة القاضية الفئران تماما. استخدام ICV نظام التسريب وبالتالي توفير الوقت وتوفير نهج أكثر تحديداً للتعامل مع الدالة CCL5 مباشرة في الدماغ، وتجاوز ردود الفعل الممكنة من التهابات الطرفية.
دراسات استخدام مضخات ناضح تم نشرها بالفعل في السابق، تقديم أمثلة رائعة والمظاهرات للتقنيات المستخدمة في زرع مضخات ناضح في القوارض13. ومع ذلك، نحن تواجه تحديات قليلة بينما عقب هذه البروتوكولات في دراستنا. أولاً، بعض المعدات المستخدمة في البروتوكول مكلفة جداً، بما في ذلك 1) المنظومة الكهربائية للوصول إلى الموقع، الرسم وإدخال الإبرة في المخ الماوس، 2) النظام الحرارية للمحافظة على درجة حرارة الجسم الماوس والأكسجين-إيسوفلوراني 3) توفير نظام لإدارة التخدير للفئران. ثانيا، يصعب التقنيات الموضحة في المواد الأخرى من إجراء نسخ متماثل لأننا كنا فقط قادراً على استخدام الحيوانات داخل مجموعة صغيرة من وزن الجسم، وفي سن معينة لدراستنا. ونحن ندرك أن الفئران الأكبر أكثر ملاءمة للجراحة وزرع. ومع ذلك، في دراستنا، اضطررنا إلى استخدام فئران أصغر وأصغر سنا لتجنب زيادة الوزن وآثار الشيخوخة على التنظيم جلوكوز الدم والانسولين: فقط الفئران الذكور مع الجسم الوزن 25 ± 2 ز والعمر حوالي 2 أشهر من العمر تم اختيارها في هذه الدراسة. وبالتالي، من الصعب إجراء جراحة وخياطة الجرح على رأسه الماوس. ثالثا، قد الاستجابة الالتهابية إلى أدنى حد بعد الجراحة نظراً سيتوكين تحريضية المستهدفة في هذه الدراسة. الفئران والجرذان ويمكن إزالة خياطة وفتح الجروح بسهولة بعد الجراحة، والذي سوف يؤدي إلى التهاب وزيادة ردود الفعل تشيموكيني. ولذلك فمن الضروري وضع استراتيجية للوصول إلى الموقع ورسم وإدراج الإبرة في المخ الماوس أن يتجنب العدوى الثانوية. ولذلك، قمنا بتعديل البروتوكولات هو موضح سابقا لجعل هذه التقنية فعالة من حيث التكلفة وأسهل وأقل ضارة بالحيوانات، كما هو موضح في الفقرة التالية.
أولاً، كنا حفر أظافر يدوياً حفر حفرة حول المنطقة المستهدفة علامة الجمجمة، كما هو موضح في الخطوة 2، 6. هذه الطريقة فعالة من حيث التكلفة ويسمح لنا برصد جميع الإجراءات لتفادي الأضرار بالسحايا الماوس والأوعية الدموية. تنظيم الجلوكوز في الدم البصر بعد السكتة الدماغية الحادة، مثل نتيجة نزيف في الدماغ. ولوحظت أيضا بعد السكتة الدماغية في إعدادات السريرية14،15فرط سكر الدم الحاد والمتلازمات مثل مرض السكري. وبالمثل، كما وجدنا استجابة الأنسولين ومستوى ضعف تحمل الجلوكوز في الفئران مع نزف وصديد في الدماغ. ونحن ندرك أن مراقبة أفضل للجراحة على أساس دليل ضروري لضمان اتساق النتائج. ثانيا، نحن استغل مادة بيولوجية طبية وضعت حديثا تستخدم عادة في العيادات، والأنسجة لاصق الغراء (2.8 خطوة)، لختم الجلد على رأس الماوس بعد عملية جراحية، ومن ثم تجنب غرز وتسريع معدل الشفاء. هذا يسهل إجراء العمليات الجراحية، ويقلل من فرصة لالتهاب ثانوي. ثالثا، أن الوقت اللازم للقيام بالإجراءات الجراحية بأكملها أقصر نسبيا، مما يزيد من فرصة للبقاء على قيد الحياة للفئران ويقلل من جرعة مخدر المخدرات يجري حقن إينترابيريتونيلي. لاحظ معدل بقاء عالية (95 في المائة)، والحصول على نتائج دقيقة نسبيا عن طريق اتباع هذا البروتوكول المعدل.
الحد من هذا الأسلوب هو الإطار الزمني القصير نسبيا لإيصال الأدوية. على الرغم من أن يمكن وضع مضخة ناضح إلى الجسم الماوس بدلاً من ذلك دون إعادة فتح الدماغ، ودراستنا فقط يركز على تأثير chemokine التحريضية على الدماغ لتنظيم إشارات الأنسولين المحيطية الجهازية. يمكن أن تحفز جراحة إضافية في الأنسجة المحيطية ربما فعل التهاب في الأنسجة المحيطية، ثم زيادة التعبير chemokine التحريضية وتؤثر على النتائج. وثانيا، فترة نصف العمر للدواء كما يحد من مدة الدراسة. المؤتلف البروتينات مثل تشيموكيني وعادة ما يكون نصف عمر أقصر، مما يفقد نشاطه على مر الزمن، على الرغم من أنه يسمح لنا بدراسة تأثير CCL5 حجب الإشارات في الدماغ على المدى القصير أيضا. وقد وصف دراساتنا السابقة أيضا نهجاً التحوير الوراثي لتوليد ماوس خروج المغلوب CCL5، الذي يوفر نموذجا للآثار طويلة الأجل8.
وهناك بعض تقنيات جديدة وطرق بديلة توصيل العقاقير إلى الدماغ. تقنية النانو هي تقنية قوية، التي يمكن أن تستخدم لتوصيل العقاقير إلى الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك، العديد من الأدوية ثيرموسينسيتيفي ويمكن أن تدمر عندما تحاول مجموعة منهم إلى جسيمات نانوية16. وباﻹضافة إلى ذلك، جسيمات نانوية يمكن أن يمر بي بي بي وأن أوبتاكين بالخلايا التي تكون مناسبة ل siRNA أو المخدرات الأكثر شيوعاً، ولكن ليس أسلوب مثالي ليجند-مستقبلات ملزم.يتطلب CCL5 ملزم للمستقبلات، CCR5، في الخلايا العصبية قوس تحت المهاد أن8من تأثير، وتقديم خصم CCL5 MetCCL5 في الخلايا العصبية عن طريق جسيمات نانوية قد تسبب خسارة في القدرة على ربط وكتلة CCR5 في الخلية السطح.
وكان مستوى الجلوكوز في الدم أعلى بكثير في الفئران التي تديرها مع CCL5 MetCCL5-خصم بالمقارنة مع عناصر التحكم (الفئران التي تديرها مع قام) في اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم. الإدارة الأنسولين إضافية (اختبار تحمل الأنسولين) كان أيضا غير قادر على تخفيض مستوى السكر في الدم في MetCCL5 تلقي الفئران (الشكل 4 باء)، مما يوحي بأن الأنسولين الذاتية والخارجية على السواء لا يمكن خفض مستويات السكر في الدم عند حظر الإشارات CCL5 طائي. وأصبحت مقاومة للأنسولين دون النشاط CCL5 في تحت المهاد الفئران. تم العثور على الفسفرة serine302 زيادة ضريبة الدخل-1 في الفئران تلقي Met-CCL5 مقارنة بالفئران التحكم تلقي قام (الشكل 5 أ-ب). سيرين 302 الفسفرة من مصلحة الضرائب-1 لقد ثبت للحث على الانفصال الجسدي من مصلحة الضرائب-1 من مستقبلات الأنسولين، وسبب رئيسي ل المقاومة الأنسولين6؛ غير قادر على تنشيط إشارات المصب مثل المسار PI3K Akt الأنسولين. وأكدت دراسة تحفيز الأنسولين السابقين فيفو الأنسولين لم يتم تنشيط جزيء مما يشير إلى المصب Akt (ف-AktS473) بالانسولين في الأنسجة طائي الماوس يملؤه Met CCL5، وبدلاً من ذلك، ازداد الفسفرة سيرين 302. بالإجمال، البيانات الفسيولوجية (OGTT وشركة ITT) والدراسة الجزيئية تثبت أن الإشارات CCL5 طائي يتوسط لائحة إشارة الأنسولين طائي، مما يسهم في الأيض المقاومة والجلوكوز الأنسولين المنتظمة.
دور وآلية CCL5 و CCR5 في مرض السكري المرتبط بالسمنة لا يزال غير واضح. ذكر كيتاد et al. أن نقص CCR5 حماية الفئران من الالتهابات الناجمة عن السمنة والتوظيف بلعم الأنسولين المقاومة17. ومع ذلك، وجدت دراسات أخرى من كنيدي et al. نتائج عكسية مما يشير إلى أن نقص CCR5 يضعف تحمل الجلوكوز النظامية فضلا عن الأنسولين adipocyte والعضلات مما يشير إلى18. كلتا الدراستين تطبيق نظام غذائي عالية من الدهون للحث على السمنة، مما يؤدي إلى التهاب مزمن في الجسم كله واستجابة تعويضية. ولم تقدم هذه الدراسات آليات واضحة ونظيفة CCL5 و CCR5 في الأنسولين مما يشير إلى التنظيم. من ناحية أخرى، أسلوب مضخة ناضح يسمح جرعة محددة في الدماغ ويتجنب استجابة تعويضية مع تسليمها محدودة زمنياً.
وفي الختام، على الرغم من المضخة ناضح مع نظام ضخ المخ، على ما يبدو، أسلوب “قديمة”، فإنها توفر طريقة أرخص وأسهل وأقل ضررا من إيصال الأدوية ويساعد التحقيق الدالة ليجند-مستقبلات الإشارات في الدماغ.
The authors have nothing to disclose.
ونحن ممتنون معتمدة من وزارة العلوم والتكنولوجيا، تايوان – إضافي MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) والصحة والرعاية الاجتماعية من منتجات التبغ-MOHW106-TDU-ب-212-144001 ص S c.
Vetbond Tissue Adhesive | 3M | #1049SB | The glue used to seal the lesion site on the mouse head |
LOCTITE 454 instant adhesive | Durect Corporation | #8670 | The glue used to fix the needle on the mouse skull |
Alzet Micro- Osmotic Pump | Durect Corporation | #9922 | 0.11 μl per hour, 28 days |
Brain infusion system | Durect Corporation | #8851 | 1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain |
Glucometer | Roche | #06870244001 | Used to measure the blood glucose level |
Glucose chip | Roche | #06454011020 | Used to load the blood sample |
Evan's blue | Sigma | #MKBK0523V | To demonstrate the drug infusion area |
Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | #3232145 C | Used to administer insulin intraperitoneally |
MIO NE116 CONTROL UNIT (nail drill) |
Mio System | #E235-015 | To drill a hole in the skull of the mouse |
CCL5/Met-RANTES Protein | R&D | #ADB0111081 | Recombinant Human CCL5, E-coli derived |
aCSF formula | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
Filter sterilize with a 0.22 μm filter apparatus, and store at 4°C. aCSF is stable for 3-4 weeks |
|
Phospho-IRS-1 Serine302 antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
IRS-1 (D23G12) antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
Phospho-Akt Serine 473 antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:2000 dilution |
Akt (pan) (C67E7) antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:1000 dilution |
Animals: C57BL/6 | NAR Labs | Wild type mice strain used in the study |