该协议研究的作用趋化因子 (c-c 主题) 配体 5 (CCL5) 在下丘脑通过提供拮抗剂,满足CCL5, 进入鼠标的大脑使用微渗透泵脑输液系统。这种瞬态抑制 CCL5 活动阻断了下丘脑胰岛素信号, 导致葡萄糖不耐受和外周系统胰岛素敏感性。
胰岛素调节下丘脑和外周胰岛素反应的系统性代谢。外周脂肪组织的炎症反应有助于2型糖尿病 (T2DM) 的发育和下丘脑的食欲调节。在2型糖尿病 (T2DM) 中, 已经提出了趋化因子 CCL5 和 c-c 因子受体型 5 (CCR5) 水平来调和动脉硬化和葡萄糖不耐受。此外, CCL5 在下丘脑通过调节食物摄入量和体温来发挥神经内分泌作用, 从而促使我们研究其在下丘脑胰岛素信号传导和周围葡萄糖代谢调节中的作用。
微渗透泵脑输液系统是一种快速、精确的控制 CCL5 功能的方法, 研究其在脑内的作用。它还提供了一种方便的替代方法, 以产生一个转基因的淘汰赛动物。在这个系统中, CCL5 信号被脑室 (ICV) 的拮抗剂–使用微渗透泵的 CCL5–的输注阻断. 口服葡萄糖耐受试验 (OGTT) 和胰岛素耐受试验 (ITT) 检测了周围葡萄糖代谢和胰岛素应答。然后通过从动物身上提取的组织样本中的蛋白质印迹来分析胰岛素信号的活性。
在7-14 天的MetCCL5 输液后, 小鼠的葡萄糖代谢和胰岛素反应能力受损, 如 OGTT 和 ITT 的结果所示。CCL5 抑制后, IRS-1 serine302 磷酸化增加, 小鼠下丘脑神经元 Akt 活性降低。总之, 我们的数据表明, 阻断 CCL5 在老鼠的大脑增加磷酸化的 IRS-1 S302 和中断下丘脑胰岛素信号, 导致胰岛素功能下降的外周组织以及损害的葡萄糖代谢.
胰岛素会影响各种各样的组织, 包括大脑。胰岛素通过血脑屏障, 进入中枢神经系统 (CNS), 并结合胰岛素受体 (IR) 在下丘脑, 以调节食物摄入量, 交感神经活动, 和外周胰岛素反应。外周脂肪组织的慢性炎症已被建议用于2型糖尿病 (T2DM), 但这些炎症反应如何影响下丘脑中的胰岛素信号以调节全身胰岛素反应和葡萄糖不耐受仍不清楚。一些趋化因子参与食欲调节和体温调节在下丘脑1 , 如肿瘤坏死因子α (TNFα), 白细胞介素 (IL)-6, IL-1β, 单核分子趋化 protein-1 (MCP-1), 和 CCL5 (c-c 主题配体5).此外, 下丘脑炎症导致胰岛素抵抗 T2DM2,3。
在这些趋化因子中, CCL5 及其受体 CCR5 在脂肪组织中的表达水平的改变, 在人类和动物的 T2DM 中都与动脉硬化和葡萄糖不耐受有关。CCL5 也有神经内分泌功能, 包括调节食物摄入量和体温, 在下丘脑。因此, 重要的是要研究 CCL5 参与胰岛素信号激活在下丘脑或周围组织。
胰岛素信号在细胞内受到严格的调控。胰岛素受体结合 (IR) 激活胰岛素受体基质 (IRS) 蛋白, 其次是醇3激酶 (PI3K) 和蛋白激酶 B (PKB/AKT) 活化和葡萄糖 transporter-4 (GLUT4) 膜易位4.IRS 蛋白是这一信号传导通路的关键调节器: 它们有多个酪氨酸和丝氨酸残留物, 可以磷酸化反应阳性或负胰岛素信号5。例如, IRS-1 丝氨酸302磷酸化可导致 IRS-1 从 IR 和阻断胰岛素信号转导的物理离解, 导致胰岛素抵抗6。在下丘脑中, IRS 蛋白的活性损伤已被证明能诱发小鼠的胰岛素抵抗和葡萄糖不耐受7。
一个共同的方法来研究一个特定的基因的功能是操纵的表达目标基因分布在整个身体的有机体。然而, 这可能有几个缺点: 1) 它可能产生不同的反馈调节或补偿作用, 随着时间的推移和 2) 这种方法并没有帮助我们说明目标蛋白在特定脑区的作用。此外, 组织和细胞特异的基因剔除动物需要很长的时间来繁殖和昂贵。因此, 我们使用短期的脑输液渗透泵系统-一个相对快速和方便的方式来干扰的信号的目标蛋白在大脑中使用拮抗剂药物克服上述问题。立体定向注射用于要求复杂的手术技巧和广泛的投资在仪器和时间。在本协议中, 我们提供了一个简单和安全的方法来执行立体定向注射和快速, 不那么有害, 瞬时的方法来检测血糖浓度和研究的作用, CCL5 在下丘脑胰岛素信号调节。
慢性炎症的机制和相关的趋化因子, 如 CCL5 及其受体-CCR5 在 type-2 糖尿病的发展仍然不清楚。慢性炎症导致巨噬细胞渗入脂肪组织, 影响脂肪的调节;同时, 它也吸引β细胞, 并损害胰岛素分泌从胰岛的反应血糖。大脑下丘脑在调节食欲、外周血糖代谢和胰岛素反应等系统外周组织胰岛素和脂肪信号方面起着重要作用。许多研究还表明, 下丘脑炎症导致能量稳态的缺陷调节以及胰岛和肝功能的缺陷2,3,9,10。CCL5 在大脑中有助于食物摄入和体温调节在下丘脑的11,12;然而, CCL5 与下丘脑和全身胰岛素信号的相关性还不清楚。一个 CCL5 的整体体击倒鼠标 (CCL5/-) 已经生成, 以解决这个问题, 这表明胰岛素抵抗表型与较高的胰岛素水平和高血糖水平的血液中8。然而, 由于可能的长期代偿效应, T2DM 表型的发育需要较长的时间, 很难研究 CCL5 在下丘脑胰岛素信号中的作用和机制。因此, 直接操纵 CCL5 信号在下丘脑神经元是最好的方法。然而, 在下丘脑区域有多种类型的神经元, 这是相当昂贵和耗时的, 以产生细胞特异性敲除小鼠。利用 ICV 的输液系统, 可以节省时间, 并提供一个更具体的方法来操纵 CCL5 功能直接在大脑中, 绕过可能的周围炎症反应。
利用渗透泵的研究已经发表过, 提供了很好的例子和示范的技术参与了在啮齿动物的渗透泵植入13。然而, 在我们的研究中, 我们在遵循这些协议时面临着一些挑战。首先, 协议中使用的一些设备相当昂贵, 包括 1) 电气系统到达的位置, 绘制和插入到小鼠脑针, 2) 的热系统保持鼠标的体温和 3) 氧异氟醚对小鼠进行麻醉的供应系统。其次, 在其他文章中描述的技术很难复制, 因为我们只能够在一个小范围的体重和在一定年龄的研究中使用动物。我们知道更大的老鼠更适合做手术和植入。然而, 在我们的研究中, 我们不得不使用小的和年轻的老鼠来避免超重和衰老对胰岛素和血糖调节的影响: 研究中选择了体重25±2克的雄性小鼠和2月龄左右的年龄。因此, 很难进行手术和缝合伤口的鼠标头部。第三, 手术后的炎症反应必须减少, 因为炎症细胞因子是本研究的目标。在手术后, 小鼠和大鼠可以很容易地切除缝线和开放性伤口, 从而引起炎症, 增加趋化因子反应。因此, 一项策略, 以达到的位置, 并绘制和插入到小鼠脑针, 避免继发感染是必要的。因此, 我们修改了以前描述的协议, 使这项技术的成本效益, 更容易, 并减少对动物的伤害, 如下段所述。
首先, 我们使用了一个指甲钻, 以手动钻一个洞周围的目标区域标记的头骨, 如步骤2.6 所述。这种方法是成本效益, 使我们能够监测整个过程, 以避免损害小鼠脑膜和血管。急性中风后血糖调节受损, 如脑出血。急性高血糖和糖尿病样综合征也观察中风后临床设置14,15。同样, 我们也发现在脑出血和脓液的小鼠中, 葡萄糖水平和胰岛素反应受损。我们知道, 更好地控制手工手术是必要的, 以确保结果的一致性。其次, 我们利用了一种新开发的医用生物材料, 通常用于临床、组织胶黏剂 (步骤 2.8), 在手术后用鼠标封住皮肤, 从而避免缝合, 加快愈合速度。这使得手术过程更容易执行, 并减少了继发性炎症的几率。第三, 完成整个手术过程所需时间较短, 增加了小鼠生存的机会, 降低了注射腹腔的麻醉药用量。我们观察到了高生存率 (95%), 并获得了相对准确的结果, 遵循这一修改的协议。
这一技术的局限性是药物传递的相对较短的时间框架。虽然渗透泵可以被放置到鼠标的身体或者不重开大脑, 我们的研究只关注炎症趋化因子对大脑的影响, 以调节周围系统胰岛素信号。外周组织的额外手术可能引起周围组织的炎症反应, 从而增加炎症趋化因子的表达, 并影响结果。其次, 药物的半衰期也限制了研究的持续时间。重组蛋白, 如趋化因子, 通常有一个较短的半衰期, 它失去了它的活动随着时间的推移, 虽然它也允许我们研究的影响, 阻断 CCL5 信号在大脑在短期内。我们以前的研究还描述了一种用于生成 CCL5 击倒鼠标的遗传修改方法, 它提供了一个具有长期影响的模型8。
有一些新的技术和替代方法, 以提供药物进入大脑。纳米技术是一种强有力的方法, 可用于将药物输送到中枢神经系统。然而, 许多药物是热敏的, 可以销毁时, 试图包装成纳米颗粒16。此外, 纳米粒子可以通过血脑屏障和吸细胞, 适合 siRNA 或最常见的药物, 但它不是一个理想的方法, 配体受体结合。CCL5 需要结合其受体, CCR5, 在下丘脑弧神经元生效8, 并交付 CCL5 拮抗剂MetCCL5 进入神经元通过纳米粒子可能会导致失去的能力绑定和阻止 CCR5 在细胞表面.
在口服葡萄糖耐受试验中, 与对照组 (aCSF 管小鼠) 相比, CCL5-antagonist MetCCL5 的小鼠血糖水平明显增高。另外的胰岛素管理 (胰岛素耐受性测试) 也不能降低血糖水平在MetCCL5 接收小鼠 (图 4B), 这表明内源性和外部胰岛素不能降低血糖水平当阻断下丘脑 CCL5 信号。小鼠在下丘脑没有 CCL5 活动就成了胰岛素抵抗。serine302 磷酸化的 IRS-1 被发现在接受 Met-CCL5 的小鼠相比, 控制小鼠接受 aCSF (图 5A-b)。丝氨酸302磷酸化 IRS-1 已被证明是诱导 IRS-1 从胰岛素受体的物理离解, 这是一个主要原因胰岛素抵抗6;胰岛素无法激活下游信号, 如 PI3K-Akt 通路。一个前体内胰岛素刺激研究证实胰岛素下游信号分子 Akt (p-AktS473) 没有激活胰岛素在小鼠下丘脑组织注入 Met-CCL5, 而相反, 丝氨酸302磷酸化增加。总之, 生理数据 (OGTT 和 ITT) 和分子研究表明, 下丘脑 CCL5 信号介导的下丘脑胰岛素信号调节, 这有助于系统性胰岛素抵抗和葡萄糖代谢。
CCL5 和 CCR5 在肥胖相关糖尿病中的作用和机制尚不清楚。出口et al.报告, CCR5 缺乏保护小鼠的肥胖引起的炎症, 巨噬细胞招募和胰岛素抵抗17。然而, 其他的研究由肯尼迪et al.发现相反的结果表明, CCR5 缺乏损害全身葡萄糖耐受以及脂肪细胞和肌肉胰岛素信号传递18。两项研究都采用高脂饮食诱导肥胖, 导致全身慢性炎症和代偿性反应。这些研究没有提供清洁和明确的机制, CCL5 和 CCR5 在胰岛素信号调节。另一方面, 渗透泵技术允许大脑特定的输液和避免补偿反应, 其有时限的分娩。
总之, 虽然渗透泵与脑输液系统似乎是一个 “old-fashioned” 技术, 它提供了一个更便宜, 更容易, 更少的有害的药物传递的方法, 并帮助调查配体受体信号的功能在大脑.
The authors have nothing to disclose.
我们感谢台湾科技部的支持–MOST105-2628–038-005-MY3 (1-3) 以及烟草产品的健康和福利附加费–MOHW106-TDU-B-212-144001 到 S Y C。
Vetbond Tissue Adhesive | 3M | #1049SB | The glue used to seal the lesion site on the mouse head |
LOCTITE 454 instant adhesive | Durect Corporation | #8670 | The glue used to fix the needle on the mouse skull |
Alzet Micro- Osmotic Pump | Durect Corporation | #9922 | 0.11 μl per hour, 28 days |
Brain infusion system | Durect Corporation | #8851 | 1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain |
Glucometer | Roche | #06870244001 | Used to measure the blood glucose level |
Glucose chip | Roche | #06454011020 | Used to load the blood sample |
Evan's blue | Sigma | #MKBK0523V | To demonstrate the drug infusion area |
Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | #3232145 C | Used to administer insulin intraperitoneally |
MIO NE116 CONTROL UNIT (nail drill) |
Mio System | #E235-015 | To drill a hole in the skull of the mouse |
CCL5/Met-RANTES Protein | R&D | #ADB0111081 | Recombinant Human CCL5, E-coli derived |
aCSF formula | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
Filter sterilize with a 0.22 μm filter apparatus, and store at 4°C. aCSF is stable for 3-4 weeks |
|
Phospho-IRS-1 Serine302 antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
IRS-1 (D23G12) antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
Phospho-Akt Serine 473 antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:2000 dilution |
Akt (pan) (C67E7) antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:1000 dilution |
Animals: C57BL/6 | NAR Labs | Wild type mice strain used in the study |