Dit protocol bestudeert de rol van chemokine (C-C motief) ligand 5 (CCL5) in de hypothalamus door het leveren van een antagonist, MetCCL5, in de hersenen van de muis met behulp van een micro-osmotische hersenen infusie pompsysteem. Deze tijdelijke remming van CCL5 activiteit onderbroken hypothalame insuline signalering, wat leidt tot glucose-intolerantie en perifere systemische insulinegevoeligheid.
Insuline regelt systematische metabolisme in de hypothalamus en de perifere insuline respons. Een ontstekingsreactie in het perifere adipeus weefsel draagt bij aan de ontwikkeling van type 2 diabetes mellitus (T2DM) en eetlust verordening in de hypothalamus. Chemokine CCL5 en C-C chemokine receptor Typ 5 (CCR5) niveaus hebben gesuggereerd om te bemiddelen aderverkalking en glucose intolerantie in diabetes mellitus type 2 (T2DM). Daarnaast CCL5 een neuro-endocriene rol speelt in de hypothalamus door het reguleren van voedsel inname en lichaamstemperatuur, dus vragen ons om haar functie in het hypothalame insuline signalering en de regulering van de perifere glucose metabolisme te onderzoeken.
De micro-osmotische pompsysteem voor de infusie van de hersenen is een snelle en precieze manier te manipuleren van de CCL5 functie en het effect ervan in de hersenen te bestuderen. Het biedt ook een handige alternatieve benadering voor het genereren van een knock-out transgene dieren. In dit systeem, werd signalering van CCL5 geblokkeerd door infusie van de intracerebroventricular (ICV) van de antagonist, MetCCL5, gebruik van een micro-osmotische pomp. De perifere glucose metabolisme en insuline respons werd ontdekt door de orale Glucose tolerantie Test (OGTT) en insuline tolerantie Test (ITT). Insuline signalering activiteit werd vervolgens geanalyseerd door eiwit vlek van weefselmonsters afgeleid van de dieren.
Na 7-14 dagen MetCCL5 infusie, het glucose metabolisme en insuline was respons verminderde in muizen, zoals te zien in de resultaten van de OGTT en de ITT. De IRS-1 serine302 fosforylatie werd verhoogd en de Akt-activiteit werd verlaagd in muizen hypothalame neuronen na CCL5 inhibitie. Over het geheel genomen suggereren onze gegevens dat het blokkeren van CCL5 in de hersenen muis de fosforylatie van IRS-1 S302 verhoogt en hypothalame insuline signalering onderbreekt, wat leidt tot een afname van de insuline functie in perifere weefsels, alsmede de bijzondere waardevermindering van glucose metabolisme.
Insuline is van invloed op een breed scala aan weefsels, met inbegrip van de hersenen. Insuline bloed – hersenbarrière passeert, wordt het centrale zenuwstelsel (CNS) en bindt met insuline receptor (IR) in de hypothalamus te reguleren voedselinname, sympathische activiteit en perifere insuline respons. Chronische ontsteking in perifere vetweefsel heeft voorgesteld te dragen aan type 2 diabetes mellitus (T2DM), maar de invloed van deze ontstekingsreacties op insuline signalen in de hypothalamus te bemiddelen systemische insuline respons en glucose intolerantie blijft onduidelijk. Sommige chemokines deelnemen aan temperatuur eetlust verordening en lichaam in de hypothalamus1 zoals Tumornecrosefactor-alfa (TNFα), interleukine (IL) -6, IL-1β, monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) en CCL5 (C-C motief ligand 5 ). Daarnaast leidt ontsteking in de hypothalamus tot insulineresistentie in T2DM2,3.
Onder deze chemokines, de wijziging van expressie niveaus van chemokine CCL5 en haar receptor, CCR5, in vetweefsel heeft in verband gebracht met aderverkalking en glucose intolerantie in T2DM in zowel mensen als dieren. CCL5 heeft ook een neuro-endocriene functies, met inbegrip van de verordening van voedsel inname en lichaamstemperatuur, in de hypothalamus. Het is dus belangrijk om te onderzoeken of CCL5 deelneemt aan insuline signaal activering binnen de hypothalamus of de perifere weefsels.
Insuline signalering is strak gereguleerd binnen cellen. De binding van insuline aan insuline receptoren (IR) activeert insuline receptor substraat (IRS) eiwitten, gevolgd door phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) en proteïne kinase B (PKB/AKT) activering en glucose transporter-4 (GLUT4) membraan translocatie4 . IRS eiwitten zijn de belangrijkste regelgevers in dit signalering traject: ze hebben meerdere tyrosine en serine residuen, die kunnen worden phosphorylated in reactie op de positieve of negatieve insuline signalen5. Bijvoorbeeld, kan serine 302 fosforylatie op IRS-1 leiden tot de fysieke dissociatie van IRS-1 uit IR en blokkeren van insuline signaaltransductie, wat leidt tot insuline resistentie6. De verslechtering van de activiteit van de IRS eiwitten in de hypothalamus is gebleken voor het opwekken van insulineresistentie en glucose-intolerantie in muizen7.
Een gemeenschappelijke manier om de studie van de functie van een specifiek gen is de manipulatie van de uitdrukking van de doelgenen verspreid over het hele lichaam van het organisme. Dit kan wel enkele nadelen: 1) het kan het genereren van verschillende feedback regelgevende of compenserende-effecten na verloop van tijd en 2) deze methode niet helpt ons de rol van de proteïne van de doelgroep in de specifieke hersengebieden te illustreren. Ook weefsel – en cel-specifieke gen knockout dieren nemen een lange tijd om te fokken en zijn kostbaar. Dus, we gebruiken een op korte termijn hersenen osmotische pomp Infusiesysteem – een relatief snelle en gemakkelijke manier te bemoeien met de signalering van de doel-proteïne in de hersenen met behulp van de antagonist drug te overwinnen van de genoemde kwesties. Stereotactische injecties gebruikt om te eisen van ingewikkelde chirurgische vaardigheden en omvangrijke investeringen in instrumentatie en tijd. In dit protocol bieden wij een eenvoudige en veilige manier stereotactische injectie en een snel, minder schadelijk en momentane methode op te sporen van de concentratie van bloedglucose en onderzoeken van de rol van CCL5 in de hypothalamische insuline signalering van de verordening uit te voeren.
Het mechanisme van chronische ontsteking en verwante chemokines zoals CCL5 en de receptor-CCR5 in de ontwikkeling van type 2 diabetes blijft onduidelijk. Chronische ontsteking veroorzaakt macrofaag infiltratie in vetweefsel en beïnvloedt de regulering van de adipokines; in de tussentijd ook trekt de β-cellen en belemmert de insuline secretie van de eilandjes van Langerhans in reactie op bloedglucose. Hypothalamus in de hersenen speelt een belangrijke rol als een control-center in het coördineren van insuline en adipokine signalen van de systemische perifere weefsels bij het reguleren van de eetlust, metabolisme van perifeer bloed glucose en insuline respons. Veel studies blijkt ook dat de hypothalamische ontsteking tot defect regulering van energie homeostase en defecte alvleesklier islet alsmede leverfunctie2,,3,,9,10 leidt. CCL5 in de hersenen draagt bij tot de voedsel-inname en lichaam temperatuur-regeling in de hypothalamus11,12; de correlatie van CCL5 met de hypothalamische en systemische insuline signalering is echter onduidelijk. Een muis van de knock-out van CCL5-hele lichaam, (CCL5– / –) is gegenereerd om aan te pakken van deze vraag, die een insuline resistentie fenotype met hogere niveaus van de insuline en hoge bloedglucosespiegels in bloed8toont. Echter, het vereist een lange tijd aan het ontwikkelen van het fenotype van de T2DM en het is moeilijk te onderzoeken van de rol en het mechanisme van CCL5 in de hypothalamische insuline signaal als gevolg van mogelijke compenserende langetermijneffecten. Een directe manipulatie van CCL5 signalering in hypothalame neuronen is daarom de beste aanpak. Er zijn echter meerdere soorten neuronen in de hypothalamische regio en het is heel duur en tijdrovend voor het genereren van cel specifieke knock-out muizen. Met behulp van een ICV kan Infusiesysteem dus Bespaar tijd en zorgen voor een meer specifieke benadering om te manipuleren van de functie van de CCL5 direct in de hersenen, het omzeilen van mogelijke perifere ontstekingsreacties.
Studies met behulp van osmotische pompen al verschenen eerder, bieden grote voorbeelden en demonstraties van de technieken die betrokken zijn bij de inplanting van osmotische pompen in knaagdieren13. Echter, we geconfronteerd een paar uitdagingen terwijl na deze protocollen in onze studie. Ten eerste, enkele van de apparatuur die wordt gebruikt in het protocol is vrij duur, met inbegrip van 1) het elektrische systeem om te bereiken van de locatie, tekenen en invoegen van de naald in de hersenen van de muis, 2) de thermo-systeem voor het handhaven van de lichaamstemperatuur van de muis en 3) de zuurstof-Isofluraan leveren systeem voor het toedienen van anesthesie aan muizen. Ten tweede, de technieken beschreven in andere artikelen waren moeilijk te repliceren omdat we konden alleen gebruik maken van dieren binnen een klein bereik van lichaam gewichten en op bepaalde leeftijden voor onze studie. We zijn bewust dat grotere muizen meer geschikt voor chirurgie en implantatie zijn. Echter in onze studie, moesten we gebruik maken van kleinere en jongere muizen om te voorkomen dat de overgewicht en de gevolgen van de veroudering op insuline en bloed glucose-verordening: alleen mannelijke muizen met lichaam 25 ± 2 g en leeftijd gewicht ongeveer 2 maanden oud in de studie werden gekozen. Het is dus moeilijk uit te voeren operatie en suture van de wond op het hoofd van de muis. Ten derde moet de inflammatoire respons na de operatie worden geminimaliseerd, omdat een inflammatoire cytokine de doelgroep in deze studie is. Muizen en ratten kunnen verwijderen hechtdraad en open wonden gemakkelijk na de operatie, die zal leiden tot ontstekingen en chemokine reacties te verhogen. Daarom is een strategie voor het bereiken van de locatie en tekenen en invoegen de naald in de hersenen muis die secundaire infectie vermijdt noodzakelijk. Dus bewerkt we de eerder beschreven protocollen om deze techniek kosteneffectieve, makkelijker, en minder schadelijk zijn voor de dieren, zoals beschreven in de volgende paragraaf.
Ten eerste, we gewend een nagel boor handmatig boor een gat rond het doelgebied gemarkeerd op de schedel, zoals beschreven in stap 2.6. Deze methode is kosteneffectief en laat ons toe om de controle op de gehele regeling om te voorkomen beschadiging van de muis hersenvliezen en de bloedvaten. Bloed glucose verordening is verminderde na een acute herseninfarct, zoals een bloeding in de hersenen. Acute hyperglycemie en diabetes-achtige ziektebeelden werden ook waargenomen na een herseninfarct in klinische instellingen14,15. Ook vonden wij ook verminderde glucose-niveau en insuline reactie in muizen met bloeding en pus in de hersenen. We zijn bewust dat betere controle van de handleiding gebaseerde operatie noodzakelijk is te zorgen voor samenhang van de resultaten. Ten tweede, we profiteerde van een nieuw ontwikkelde medische biomaterial vaak gebruikt in klinieken, weefsel Lijm lijm (stap 2.8), voor het afdichten van de huid op de kop van de muis na de operatie, vandaar, het vermijden van steken en versnelling van het tempo van de genezing. Dit maakt van chirurgische procedures eenvoudiger uit te voeren en vermindert de kans op secundaire ontsteking. Ten derde, de tijd die nodig is voor het uitvoeren van de gehele chirurgische ingreep is relatief korter, dat verhoogt de kans op overleving voor de muizen en verlaagt de dosering van verdoving drug intraperitoneally wordt geïnjecteerd. We waargenomen een hoge overlevingskans (95%) en betrekkelijk nauwkeurige resultaten verkregen door het volgen van dit gewijzigde protocol.
De beperking van deze techniek is de relatief korte tijdsbestek voor drug delivery. Hoewel een osmotische pomp kan worden geplaatst in het lichaam van de muis ook zonder heropening op de hersenen, onze studie alleen richt zich op de inflammatoire chemokine effect op de hersenen reguleren de perifere systemische insuline signalering. Extra chirurgie in perifere weefsels kan eventueel het induceren van een ontstekingsreactie in de perifere weefsels, die vervolgens zou verhogen inflammatoire chemokine expressie en invloed op de resultaten. Ten tweede, de halfwaardetijd van de drug ook beperkt de duur van de studie. Recombinante eiwitten zoals chemokine hebben meestal een kortere halfwaardetijd, die haar activiteit na verloop van tijd, verliest hoewel het ook ons toelaat te bestuderen van het effect van blokkerende CCL5 signalering in de hersenen op de korte termijn. Onze vorige studies hebben ook een benadering van de genetische modificatie voor het genereren van een CCL5 uitnemen muis, waarmee een model met lange termijn effecten8beschreven.
Er zijn enkele nieuwe technieken en alternatieve methoden voor het leveren van geneesmiddelen in de hersenen. Nanotechnologie is een krachtige techniek, die kan worden gebruikt voor het leveren van geneesmiddelen in het centrale zenuwstelsel. Hittegevoelige zijn echter veel drugs en kunnen worden vernietigd wanneer het proberen om ze te verpakken in nanodeeltjes16. Daarnaast nanodeeltjes kan passeren van BBB en uptaken door cellen die geschikt voor siRNA of meest voorkomende drugs zijn, maar het is niet een ideale methode voor het ligand-receptor binden.CCL5 vereist binding aan de receptor, CCR5, in de hypothalamus ARC neuronen te nemen effect8, en de levering van CCL5 antagonist MetCCL5 in de neuronen via nanodeeltjes kan leiden tot een verlies van het vermogen om te binden en blokkeren CCR5 op de cel oppervlak.
De bloedglucose niveau was significant hoger in muizen in de orale glucose tolerantie test met de CCL5 MetCCL5-antagonist in vergelijking met de besturingselementen (muizen met aCSF beheerd) toegediend. Extra insuline toediening (insuline tolerantie test) kon ook verlaagt het bloedglucose niveau in MetCCL5 ontvangen van muizen (figuur 4B), waarin wordt voorgesteld dat zowel endogene als externe insuline niveaus van de glucose van het bloed niet kan verminderen tijdens het blokkeren van hypothalame CCL5 signalering. Muizen werd insulineresistentie zonder CCL5 activiteit in de hypothalamus. Verhoogde serine302 fosforylering van IRS-1 werd gevonden in de muizen BMO-CCL5 in vergelijking met controle muizen ontvangen aCSF (figuur 5A-B) ontvangen. Serine 302 fosforylatie van IRS-1 is gebleken voor het opwekken van een fysieke dissociatie van IRS-1 van de insuline-receptor, dat een belangrijke oorzaak van insuline resistentie6 is; insuline kan niet activeren downstream signalen zoals de PI3K-Akt-pathway. Een ex vivo -studie van het insuline-stimulatie bevestigde de stroomafwaartse signalering molecuul Akt (p-AktS473) werd niet geactiveerd door insuline in muis hypothalame weefsel insuline toegediend met BMO-CCL5 en in plaats daarvan de serine 302 fosforylatie verhoogd. Over het geheel genomen zowel fysiologische gegevens (OGTT en ITT) en moleculair onderzoek tonen aan dat het hypothalame CCL5 signalering bemiddelt de hypothalamische insuline signaal verordening, die aan de systematische insuline resistentie en glucose metabolisme bijdraagt.
De rol en het mechanisme van CCL5 en CCR5 in diabetes obesitas-geassocieerde blijft onduidelijk. Kitade et al. rapporteerde dat CCR5-deficiëntie muizen beschermd tegen zwaarlijvigheid-veroorzaakte ontsteking, macrofaag aanwerving en insuline resistentie17. Echter, andere studies door Kennedy et al. vond tegenovergestelde resultaten die aangeeft dat CCR5-deficiëntie schaadt systemische glucosetolerantie, evenals adipocyte en spier insuline signalering van18. Beide onderzoeken van toepassing een vetrijke dieet om te induceren van obesitas, wat tot chronische ontsteking van de hele lichaam en compenserende reactie leidt. Deze studies hebben geen schone en duidelijke mechanismen voor CCL5 en CCR5 in insuline signalering verordening verstrekt. Aan de andere kant, de osmotische pomp techniek kan een specifieke infusie van hersenen en vermijdt compenserende reactie met haar tijd-beperkte levering.
Kortom, hoewel de osmotische pomp met de hersenen Infusiesysteem lijkt te zijn van een “ouderwetse” techniek, het levert een goedkoper, eenvoudiger en minder schadelijke methode voor drug delivery en helpt onderzoeken de functie van ligand-receptor signalering de hersenen.
The authors have nothing to disclose.
We zijn dankbaar de ondersteunde van het ministerie van wetenschap en technologie, Taiwan – MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) en gezondheid en het welzijn toeslag van tabaksproducten – MOHW106-TDU-B-212-144001 tot S-Y C.
Vetbond Tissue Adhesive | 3M | #1049SB | The glue used to seal the lesion site on the mouse head |
LOCTITE 454 instant adhesive | Durect Corporation | #8670 | The glue used to fix the needle on the mouse skull |
Alzet Micro- Osmotic Pump | Durect Corporation | #9922 | 0.11 μl per hour, 28 days |
Brain infusion system | Durect Corporation | #8851 | 1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain |
Glucometer | Roche | #06870244001 | Used to measure the blood glucose level |
Glucose chip | Roche | #06454011020 | Used to load the blood sample |
Evan's blue | Sigma | #MKBK0523V | To demonstrate the drug infusion area |
Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | #3232145 C | Used to administer insulin intraperitoneally |
MIO NE116 CONTROL UNIT (nail drill) |
Mio System | #E235-015 | To drill a hole in the skull of the mouse |
CCL5/Met-RANTES Protein | R&D | #ADB0111081 | Recombinant Human CCL5, E-coli derived |
aCSF formula | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
Filter sterilize with a 0.22 μm filter apparatus, and store at 4°C. aCSF is stable for 3-4 weeks |
|
Phospho-IRS-1 Serine302 antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
IRS-1 (D23G12) antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
Phospho-Akt Serine 473 antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:2000 dilution |
Akt (pan) (C67E7) antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:1000 dilution |
Animals: C57BL/6 | NAR Labs | Wild type mice strain used in the study |