Dieses Protokoll untersucht die Rolle der Chemokin (C-C-Motiv) Liganden 5 (CCL5) im Hypothalamus durch die Bereitstellung von Antagonist MetCCL5, in das Gehirn der Maus mit einem Mikro-osmotischen Pumpe Gehirn Infusion System. Diese vorübergehende Hemmung der CCL5 Aktivität unterbrochen Hypothalamus Insulin Signalisierung, Glukoseintoleranz und periphere systemische Insulinsensitivität führen.
Insulin reguliert den Stoffwechsel systematisch in den Hypothalamus und die peripheren Insulinreaktion. Eine Entzündungsreaktion im peripheren Fettgewebe trägt zu Typ-2 Diabetes Mellitus (T2DM) Entwicklung und Appetit Verordnung im Hypothalamus. Chemokine CCL5 und C-C-Chemokin-Rezeptor Typ 5 (CCR5) Stufen vorgeschlagen worden, um Arteriosklerose und Glukose-Intoleranz bei Typ 2 Diabetes Mellitus (T2DM) zu vermitteln. Darüber hinaus Rolle CCL5 eine neuroendokrine im Hypothalamus geregelt Essen Einnahme und die Körpertemperatur, so fordert uns, seine Funktion im Hypothalamus Insulin-Signal und die Regulierung der peripheren Glukose-Stoffwechsel zu untersuchen.
Das Mikro-osmotischen Pumpe Gehirn Infusion System ist eine schnelle und präzise Weise zu manipulieren CCL5 Funktion und seine Wirkung im Gehirn zu studieren. Es bietet auch eine bequeme alternative Herangehensweise zur Erzeugung einer transgenen Ko-Tieres. In diesem System wurde CCL5 Signalisierung von Intracerebroventricular (ICV) Infusion von seinen Gegenspieler, MetCCL5, mit einem Mikro-osmotischen Pumpe blockiert. Die peripheren Glukose-Stoffwechsel und Insulin Reaktionsfähigkeit wurde durch den oralen Glukose-Toleranz-Test (OGTT) und Insulin-Toleranz-Test (ITT) festgestellt. Insulin Signalisierung Aktivität wurde dann durch Protein-Blot aus Gewebeproben, die von den Tieren abgeleitet analysiert.
Nach 7-14 Tagen von MetCCL5 Aufguss, den Metabolismus von Glukose und Insulin wurde bei Mäusen, Reaktionsfähigkeit beeinträchtigt, wie in den Ergebnissen der OGTT und ITT gesehen. Die IRS-1 serine302 Phosphorylierung wurde erhöht und die Akt-Aktivität wurde in Mäusen Hypothalamus Neuronen nach CCL5 Hemmung reduziert. Insgesamt zufolge unsere Daten blockieren CCL5 in das Gehirn der Maus erhöht die Phosphorylierung des IRS-1 S302 und unterbricht Hypothalamus Insulin-Signal, führt zu einem Rückgang der Insulinfunktion in peripheren Geweben sowie die Beeinträchtigung der Glukose Stoffwechsel.
Insulin wirkt sich eine Vielzahl von Geweben, einschließlich des Gehirns. Insulin führt durch die Blut – Hirn-Schranke, tritt in das zentrale Nervensystem (ZNS) und bindet mit Insulin-Rezeptor (IR) im Hypothalamus, Nahrungsaufnahme, Aktivität des sympathischen Nervensystems und periphere Insulin-Reaktion zu regulieren. Chronische Entzündungen im peripheren Fettgewebe soll dazu beitragen, Typ 2 Diabetes Mellitus (T2DM), aber wie diese Entzündungsreaktionen Insulin beeinflussen, systemische Insulin-Reaktion und Glukose-Intoleranz vermitteln im Hypothalamus Signale bleibt unklar. Einige Chemokine Teilnahme an Appetit Verordnung und Regulierung der Körpertemperatur im Hypothalamus1 wie Tumor-Nekrose-Faktor-Alpha (TNF), Interleukin (IL) -6, IL-1β, Monocyte Lockstoffgradient Protein-1 (MCP-1) und CCL5 (C-C Motif Ligand 5 ). Darüber hinaus führt die Entzündung im Hypothalamus zu einer Insulinresistenz bei T2DM2,3.
Unter diese Chemokine, die Änderung der Ausdruck Niveaus der Chemokin CCL5 und seinen Rezeptor wurde CCR5, in Fettgewebe mit Arteriosklerose und Glukose-Intoleranz in T2DM im Menschen als auch Tiere in Verbindung gebracht. CCL5 hat auch neuroendokrine Funktionen, einschließlich der Regulierung von Essen-Aufnahme und die Körpertemperatur, im Hypothalamus. Es ist daher wichtig zu untersuchen, ob CCL5 an Insulin Signal Aktivierung innerhalb der Hypothalamus oder der peripheren Geweben beteiligt ist.
Insulin-Signal ist streng in den Zellen reguliert. Die Bindung von Insulin, Insulin-Rezeptoren (IR) aktiviert Insulin Rezeptorproteine Substrat (IRS), gefolgt von Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) und Protein Kinase B (PKB/AKT) Aktivierung und Glukose-Transporter-4 (GLUT4) Membran Translokation4 . IRS-Proteine sind die wichtigsten Regulatoren in dieser Signalweg: sie haben mehrere Tyrosin und Serin Rückstände, die als Reaktion auf Positive phosphoryliert werden können oder negative Insulin signalisiert5. Zum Beispiel kann Serin 302 Phosphorylierung von IRS-1 führen zu die physische Trennung von IRS-1 von IR und Insulin-Signaltransduktion, führt zu Insulin-Resistenz-6zu blockieren. Die Aktivität Beeinträchtigung der IRS Proteine im Hypothalamus hat sich gezeigt, Insulin-Resistenz und Glukoseintoleranz in Mäusen7zu induzieren.
Eine gängige Methode, um die Funktion eines bestimmten Gens zu untersuchen ist die Manipulation des Ausdrucks der Zielgene verteilt über den gesamten Körper des Organismus. Dies kann jedoch einige Nachteile haben: (1) es könnte im Laufe der Zeit verschiedene Rückkopplungseffekte regulatorischen oder kompensatorische erzeugen und (2) diese Methode nicht hilft uns die Rolle des Zielproteins in bestimmten Gehirnregionen zu veranschaulichen. Auch Gewebe und zellspezifische gen Knockout Tiere sehr lange dauern, zu züchten und sind teuer. So verwenden wir eine kurzfristige Infusion osmotischen Pumpe Hirnsystem – eine relativ schnelle und bequeme Möglichkeit, stören die Signalisierung des Zielproteins in das Gehirn der Antagonist Droge verwenden, um die genannten Probleme zu überwinden. Stereotaktische Injektionen verwendet, um komplizierte chirurgische Kompetenz und umfangreiche Investitionen in Instrumentierung und Zeit erfordern. In diesem Protokoll bieten wir eine einfache und sichere Möglichkeit, stereotaktische Injektion und eine schnell, weniger schädlich und momentane Methode, um die Konzentration von Glukose im Blut zu erkennen und untersuchen die Rolle von CCL5 im Hypothalamus Insulin Signalisierung Verordnung durchführen.
Der Mechanismus der chronischen Entzündung und damit verbundenen Chemokine wie CCL5 und seinen Rezeptor – unklar CCR5 bei der Entwicklung von Typ-2-Diabetes. Chronischer Entzündung verursacht Makrophagen Eindringen in Fettgewebe und wirkt sich auf die Regulierung der Adipokine; in der Zwischenzeit außerdem zieht β-Zellen und beeinträchtigt die Insulin-Sekretion von Langerhans-Inseln in Reaktion auf den Blutzucker. Hypothalamus im Gehirn spielt eine wichtige Rolle als ein Control-Center bei der Koordinierung von Insulin und Adipokine Signale aus dem systemischen peripheren Gewebe bei der Regulierung der Appetit, periphere Blut-Glukose-Stoffwechsel und Insulin-Reaktion. Viele Studien zeigen auch, dass Hypothalamus Entzündung zu mangelhaften Regulierung der Energiehomöostase sowie defekte Pankreas Inselchen und Leberfunktion2,3,9,10 führt. CCL5 im Gehirn trägt zur Aufnahme und Körper Temperatur Lebensmittelverordnung in den Hypothalamus11,12; die Korrelation von CCL5, Hypothalamus und systemische Insulin-Signal ist jedoch unklar. CCL5 Ganzkörper Knockout Maus (CCL5– / –) wurde erstellt, um die ein Insulin Widerstand Phänotyp mit höheren Insulinspiegel und hohe Blutzuckerwerte im Blut8zeigt mit dieser Frage beschäftigen. Allerdings erfordert es eine lange Zeit den T2DM-Phänotyp zu entwickeln und es ist schwierig, die Rolle und CCL5 im Hypothalamus Insulin-Signal durch mögliche Langzeitwirkungen kompensatorische Mechanismus zu untersuchen. Daher ist eine direkte Manipulation der CCL5 signalisieren in den Hypothalamus Neuronen der beste Ansatz. Allerdings gibt es mehrere Arten von Neuronen im Hypothalamus Region und es ist ziemlich teuer und zeitaufwendig, Zelle spezifische Knockout-Mäusen zu generieren. Unter Verwendung einer ICV kann Infusion System so sparen Sie Zeit und einen konkreteren Ansatz um CCL5 Funktion direkt in das Gehirn unter Umgehung mögliche peripheren Entzündungsreaktionen zu manipulieren.
Studien unter Verwendung osmotische Pumpen wurden bereits zuvor veröffentlicht bietet großartige Beispiele und Demonstrationen von Techniken die Implantation der osmotische Pumpen in Nagetieren13beteiligt. Allerdings standen wir ein paar Herausforderungen während im Anschluss an diese Protokolle in unserer Studie. Erstens ist ein Teil der Ausrüstung benutzt im Protokoll recht teuer, einschließlich (1) die elektrische Anlage zu erreichen, zeichnen und einsetzen der Nadel ins Gehirn der Maus, (2) das Thermo-System für die Aufrechterhaltung der Körpertemperatur Maus und (3) die Sauerstoff-Isofluran System für die Verwaltung der Anästhesie zu Mäusen zu liefern. Zweitens waren die Techniken, die in anderen Artikeln beschrieben schwer nachzuahmen, da wir nur Tiere innerhalb eines kleinen Bereichs von Körpergewicht und in bestimmten Altersstufen für unsere Studie nutzen konnten. Wir sind uns bewusst, dass größere Mäuse für Chirurgie und Implantation besser geeignet sind. Allerdings mussten wir in unserer Studie, kleinere und jüngere Mäuse verwenden Sie zur Vermeidung von Übergewicht und Alterungseffekte auf Insulin und Blut-Glukose-Verordnung: nur männliche Mäuse mit Körper 25 ± 2 g und Alter Gewicht ca. 2 Monate alt wurden in der Studie ausgewählt. Daher ist es schwierig zu operieren und Naht die Wunde auf den Maus-Kopf. Drittens muss die entzündliche Reaktion nach der Operation minimiert werden, da eine entzündliche Cytokine das Ziel dieser Studie ist. Mäuse und Ratten können Naht zu entfernen und offenen Wunden leicht nach der Operation, die führt zu Entzündungen und Chemokin Reaktionen zu erhöhen. Daher ist eine Strategie, die Position erreichen und ziehen und stechen die Nadel ins Gehirn der Maus, der Sekundärinfektion vermeidet notwendig. Daher haben wir die zuvor beschriebenen Protokolle, um diese Technik kostengünstiger, einfacher und weniger schädlich für die Tiere machen, wie im folgenden Absatz beschrieben geändert.
Erstens haben wir einen Nagel bohren um manuell ein Loch um den Zielbereich markiert auf dem Schädel zu bohren, wie unter Punkt 2.6 beschrieben. Diese Methode ist kostengünstig und ermöglicht es uns, das gesamte Verfahren um nicht zu beschädigen die Maus Hirnhäute und Blutgefäße zu überwachen. Blut-Glukose-Verordnung wird nach akutem Schlaganfall, wie z. B. eine Blutung im Gehirn beeinträchtigt. Akuten Hyperglykämie und Diabetes-ähnliche Syndrome wurden auch nach einem Schlaganfall im klinischen Umfeld14,15beobachtet. Ebenso fanden wir auch wertgemindert Glukose-Ebene und Insulin-Reaktion bei Mäusen mit Blutungen und Eiter im Gehirn. Wir sind uns bewusst, dass bessere Kontrolle der Handbuch-basierte Chirurgie zur Sicherstellung der Konsistenz der Ergebnisse notwendig ist. Zweitens, nutzten wir eine neu entwickelte medizinische Biomaterial allgemein verwendet in Kliniken, Gewebe Klebstoff Leim (Schritt 2,8), um die Haut zu versiegeln auf den Maus-Kopf nach der Operation, daher Stiche zu vermeiden und die Rate der Heilung zu beschleunigen. Dies erleichtert chirurgische Eingriffe durchführen und verringert die Gefahr von sekundären Entzündung. Drittens ist der Zeitaufwand für das gesamte chirurgische Verfahren durchzuführen vergleichsweise kürzer, das erhöht die Chance des Überlebens für die Mäuse und senkt die Dosierung der betäubende Droge injiziert intraperitoneal. Wir beobachteten eine hohe Überlebensrate (95 %) und relativ genaue Ergebnisse durch Anschluss an diese geänderte Protokoll erhalten.
Die Einschränkung dieser Technik ist die relativ kurzen Zeitrahmen der Drug-Delivery. Obwohl eine osmotische Pumpe in den Körper der Maus Alternativ platziert werden kann ohne erneute Öffnung des Gehirns, unsere Studie nur konzentriert sich auf die entzündlichen Chemokin-Wirkung auf das Gehirn, die peripheren systemischen Insulin Signalisierung zu regulieren. Zusätzliche Operation in peripheren Geweben könnte möglicherweise eine Entzündungsreaktion in peripheren Geweben, induzieren, die dann entzündliche Chemokin Ausdruck zu erhöhen und die Ergebnisse beeinflussen. Zweitens, die Halbwertszeit des Medikaments schränkt auch die Dauer der Studie. Rekombinante Proteine wie Chemokin haben in der Regel eine kürzere Halbwertszeit, die ihre Tätigkeit im Laufe der Zeit verliert, obwohl es auch erlaubt, die Wirkung von blockierenden CCL5 Signalisierung im Gehirn kurzfristig zu untersuchen. Unsere früheren Studien haben auch einen genetische Veränderung Ansatz zur Generierung von CCL5 Knockout Maus, bietet ein Modell mit langfristigen Auswirkungen8beschrieben.
Es gibt einige neue Techniken und alternative Methoden, Drogen ins Gehirn zu liefern. Nanotechnologie ist eine leistungsstarke Technik, die verwendet werden können, um Drogen in das zentrale Nervensystem zu liefern. Viele Medikamente sind wärmeempfindlichen jedoch und können zerstört werden, wenn Sie versuchen, sie in Nanopartikel16zu verpacken. Darüber hinaus Nanopartikel können BBB durchlaufen und werden Uptaken von Zellen, die für SiRNA oder am häufigsten verwendeten Medikamente geeignet sind, aber es ist keine ideale Methode für Ligand-Rezeptor-Bindung.CCL5 erfordert Bindung an seinen Rezeptor CCR5, in den Hypothalamus ARC Neuronen zu Effekt8, und die Lieferung von CCL5 Antagonist MetCCL5 in Neuronen durch Nanopartikel könnten dazu führen, dass einen Verlust der Fähigkeit zu binden und CCR5 auf der Zelle blockieren Oberfläche.
Der Blutzuckerspiegel war signifikant höher bei Mäusen in der oralen Glukosetoleranztest mit CCL5-Antagonist MetCCL5 im Vergleich zu den Steuerelementen (Mäuse mit ACFS verabreicht) verabreicht. Zusätzliche Insulingaben (Insulin-Toleranz-Test) war auch nicht in der Lage, den Blutzuckerspiegel in MetCCL5 erhalten Mäuse (Abbildung 4 b), zu senken, was darauf hindeutet, dass endogene und externe Insulin den Blutzuckerspiegel senken können beim Hypothalamus CCL5 Signalisierung blockieren. Mäuse wurden Insulin resistent ohne CCL5 Aktivität im Hypothalamus. Erhöhte serine302 Phosphorylierung des IRS-1 wurde bei den Mäusen, die Met-CCL5 im Vergleich zu Kontroll-Mäusen erhalten ACFS (Abbildung 5A-B) Eingang gefunden. Serin 302 Phosphorylierung des IRS-1 hat gezeigt, dass eine physikalische Dissoziation des IRS-1 aus der Insulinrezeptor, induzieren, die eine der Hauptursachen der Insulin-Resistenz-6; Insulin ist nicht nachgelagerten Signale wie der PI3K-Akt-Signalweg aktivieren. Eine ex-Vivo -Insulin-Stimulation-Studie bestätigt das Insulin, die nachgeschalteten Signalmolekül Akt (p-AktS473) nicht durch Insulin im Hypothalamus Gewebe Maus aktiviert wurde angereichert mit Met-CCL5 und stattdessen die Serin 302 Phosphorylierung erhöht. Insgesamt zeigen physiologische Daten (OGTT und ITT) und molekulare Studie, dass Hypothalamus CCL5 Signalisierung die Hypothalamus Insulin-Signal-Verordnung, vermittelt die systematische Insulin-Resistenz und Glukose-Stoffwechsel beiträgt.
Die Rolle und die Mechanismen der CCL5 und CCR5 bei Adipositas-assoziierten Diabetes bleibt unklar. Kitade Et Al. berichteten, dass CCR5-Mangel von Fettleibigkeit bedingte Entzündung, Makrophagen Rekrutierung und Insulin-Resistenz-17Mäusen geschützt. Jedoch haben andere Studien von Kennedy Et Al. entgegengesetzte Ergebnisse darauf hinweist, dass CCR5-Mangel beeinträchtigt systemische Glukosetoleranz sowie Adipocyte und Muskel Insulin Signalisierung18gefunden. Beide Studien angewendet eine fettreiche Ernährung, Übergewicht, induzieren die Ganzkörper chronische Entzündung und kompensatorische Reaktion führt. Diese Studien haben keine saubere und klare Mechanismen von CCL5 und CCR5 in Insulin Signalisierung Verordnung vorgelegt. Auf der anderen Seite die osmotischen Pumpe-Technik ermöglicht eine Gehirn-spezifische-Infusion und vermeidet kompensatorische Reaktion mit der zeitlich befristeten Lieferung.
Zusammenfassend, obwohl die osmotische Pumpe mit dem Gehirn Infusion System eine “altmodische” Technik zu sein scheint, bietet es eine billigere, einfachere und weniger schädliche Methode der Drug-Delivery und hilft untersuchen die Funktion des Ligand-Rezeptor Signalgebung der Gehirn.
The authors have nothing to disclose.
Wir sind dankbar, unterstützt vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan – MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) und Gesundheit und das Wohlergehen Zuschlag von Tabakwaren – MOHW106-TDU-B-212-144001 bis S-Y C.
Vetbond Tissue Adhesive | 3M | #1049SB | The glue used to seal the lesion site on the mouse head |
LOCTITE 454 instant adhesive | Durect Corporation | #8670 | The glue used to fix the needle on the mouse skull |
Alzet Micro- Osmotic Pump | Durect Corporation | #9922 | 0.11 μl per hour, 28 days |
Brain infusion system | Durect Corporation | #8851 | 1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain |
Glucometer | Roche | #06870244001 | Used to measure the blood glucose level |
Glucose chip | Roche | #06454011020 | Used to load the blood sample |
Evan's blue | Sigma | #MKBK0523V | To demonstrate the drug infusion area |
Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | #3232145 C | Used to administer insulin intraperitoneally |
MIO NE116 CONTROL UNIT (nail drill) |
Mio System | #E235-015 | To drill a hole in the skull of the mouse |
CCL5/Met-RANTES Protein | R&D | #ADB0111081 | Recombinant Human CCL5, E-coli derived |
aCSF formula | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
Filter sterilize with a 0.22 μm filter apparatus, and store at 4°C. aCSF is stable for 3-4 weeks |
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Phospho-IRS-1 Serine302 antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
IRS-1 (D23G12) antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
Phospho-Akt Serine 473 antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:2000 dilution |
Akt (pan) (C67E7) antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:1000 dilution |
Animals: C57BL/6 | NAR Labs | Wild type mice strain used in the study |