Questo protocollo studia il ruolo del ligando di chemochina (motivo C-C) 5 (CCL5) nell’ipotalamo fornendo un antagonista, MetCCL5, nel cervello del mouse utilizzando un sistema di infusione cervello pompa micro-osmotica. Questa inibizione transitoria di CCL5 attività interrotta ipotalamico insulina segnalazione, che conduce ad intolleranza al glucosio e la sensibilità periferica dell’insulina sistemica.
Insulina regola metabolismo sistematica nell’ipotalamo e la risposta dell’insulina periferica. Una reazione infiammatoria nei tessuti periferici adiposo contribuisce allo sviluppo di diabete mellito (T2DM) tipo 2 e regolazione dell’appetito nell’ipotalamo. Tipo del ricevitore di chemokine di Chemokine CCL5 e C-C 5 livelli (CCR5) sono stati suggeriti per mediare arteriosclerosi e intolleranza al glucosio in diabete mellito di tipo 2 (T2DM). Inoltre, CCL5 gioca un ruolo neuroendocrino nell’ipotalamo regolando cibo l’assunzione e la temperatura corporea, così, ci spinge a indagare la sua funzione nella segnalazione dell’insulina ipotalamico e la regolazione del metabolismo del glucosio periferico.
Il sistema di infusione cervello pompa micro-osmotica è un modo rapido e preciso per manipolare CCL5 funzione e studiare il suo effetto nel cervello. Fornisce inoltre un conveniente approccio alternativo per generare un animale transgenico knockout. In questo sistema, CCL5 segnalazione è stato bloccato da infusione intracerebroventricular (ICV) del suo antagonista, MetCCL5, utilizzando una pompa micro-osmotica. La reattività del metabolismo e dell’insulina periferica del glucosio è stata rilevata dal Test di tolleranza orale al glucosio (OGTT) e Test di tolleranza dell’insulina (ITT). Attività di segnalazione dell’insulina è stato quindi analizzato dalla macchia di proteina da campioni di tessuto derivati dagli animali.
Dopo 7-14 giorni di infusione MetCCL5, il metabolismo del glucosio e dell’insulina è stata alterata reattività nei topi, come visto nei risultati dell’OGTT e ITT. La fosforilazione di serine302 di IRS-1 è stata aumentata e l’attività di Akt è stata ridotta in neuroni ipotalamici topi dopo CCL5 inibizione. Complessivamente, i nostri dati suggeriscono che bloccando CCL5 nel cervello del topo aumenta la fosforilazione di IRS-1 S302 e interrompe la trasmissione del segnale insulinico ipotalamico, portando ad una diminuzione nella funzione dell’insulina nei tessuti periferici, come pure il danno del glucosio metabolismo.
Insulina interessa un’ampia varietà di tessuti compreso il cervello. L’insulina passa attraverso la barriera emato – encefalica, entra nel sistema nervoso centrale (SNC) e si lega con il recettore dell’insulina (IR) nell’ipotalamo di regolare assunzione di cibo, attività simpatica e periferica dell’insulina risposta. Infiammazione cronica in tessuti adiposi periferici è stata proposta per contribuire al diabete mellito tipo 2 (T2DM), ma come queste reazioni infiammatorie influenzano insulina segnala nell’ipotalamo di mediare sistemica dell’insulina risposta e intolleranza al glucosio rimane poco chiaro. Alcune chemochine partecipare alla regolazione dell’appetito e regolazione della temperatura corporea in ipotalamo1 come fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF), interleuchina (IL) -6, IL-1 β, monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) e CCL5 (ligando di motivo C-C 5 ). Inoltre, l’infiammazione nell’ipotalamo conduce ad insulino-resistenza nel T2DM2,3.
Tra queste chemochine, l’alterazione dei livelli di espressione di chemochine CCL5 e del suo recettore, CCR5, in tessuti adiposi è stato associato con arteriosclerosi e intolleranza al glucosio in T2DM in esseri umani così come gli animali. CCL5 ha anche funzioni neuroendocrine, tra cui la regolazione della temperatura di corpo e l’assunzione di cibo, nell’ipotalamo. Così è importante indagare se CCL5 partecipa l’attivazione del segnale dell’insulina all’interno dell’ipotalamo o tessuti periferici.
Segnalazione dell’insulina è strettamente regolato all’interno delle cellule. L’associazione dei recettori di insulina (IR) attiva proteine di substrato (IRS) del ricevitore dell’insulina, seguite da fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K) e della proteina chinasi B (PKB/AKT) attivazione e glucosio transporter-4 (GLUT4) traslocazione di membrana4 . Le proteine IRS sono i regolatori chiave in questa via di segnalazione: hanno più residui di serina e tirosina, che possono essere fosforilati in risposta a positivo o negativo dell’insulina segnala5. Ad esempio, fosforilazione della serina 302 su IRS-1 può portare alla dissociazione fisica di IRS-1 da IR e bloccare la trasduzione del segnale dell’insulina, che porta a insulina resistenza6. La compromissione dell’attività delle proteine IRS nell’ipotalamo è stata indicata per indurre l’insulino-resistenza e intolleranza al glucosio in topi7.
Un modo comune per studiare la funzione di un gene specifico è la manipolazione dell’espressione di geni bersaglio distribuiti in tutto il corpo dell’organismo. Tuttavia, questo può avere diversi inconvenienti: 1) potrebbe generare effetti di regolamentazione o compensativo di feedback diverso nel tempo e 2) questo metodo non ci aiuta a illustrare il ruolo della proteina bersaglio nelle regioni specifiche del cervello. Inoltre, tessuto e cellula-specifico gene knockout animali richiedere molto tempo per riprodursi e sono costosi. Quindi, utilizziamo un sistema a breve termine cervello infusione pompa osmotica – un modo relativamente rapido e conveniente per interferire con la segnalazione della proteina nel cervello usando il farmaco antagonista per superare i problemi di cui sopra. Stereotactic iniezioni richiedeva abilità chirurgica intricato e ingenti investimenti in strumentazione e tempo. In questo protocollo, forniamo un modo semplice e sicuro per eseguire l’iniezione stereotactic e un metodo rapido, meno nocivo e istantaneo per rilevare la concentrazione di glucosio nel sangue e indagare il ruolo di CCL5 nella segnalazione regolamento ipotalamico dell’insulina.
Il meccanismo di infiammazione cronica e citochine correlate, quali CCL5 e del suo recettore – CCR5 nello sviluppo del diabete di tipo 2 rimane poco chiaro. L’infiammazione cronica provoca l’infiltrazione del macrofago in tessuto adiposo e colpisce il regolamento di adipochine; nel frattempo, inoltre, attira le β-cellule e altera la secrezione dell’insulina dalle isole di Langerhans in risposta al glucosio nel sangue. Ipotalamo nel cervello svolge un ruolo importante come centro di controllo nel coordinamento dell’insulina e adipokine segnali dai tessuti periferici sistemici nella regolazione dell’appetito, metabolismo del glucosio di anima periferica e risposta dell’insulina. Molti studi indicano anche che l’infiammazione ipotalamico conduce a difettosa regolazione dell’omeostasi energetica, nonché dell’isolotto pancreatico difettoso e funzione epatica2,3,9,10. CCL5 nel cervello contribuisce alla regolazione della temperatura aspirazione e corpo cibo nell’ipotalamo11,12; Tuttavia, la correlazione di CCL5 con segnalazione ipotalamica e sistemica dell’insulina è poco chiara. Un mouse di knockout di tutto il corpo CCL5 (CCL5– / –) è stato generato per rispondere a questo interrogativo, che mostra un fenotipo di resistenza di insulina con livelli elevati dell’insulina e i livelli ematici del glucosio nel sangue8. Tuttavia, richiede molto tempo per sviluppare il fenotipo di T2DM ed è difficile indagare il ruolo e il meccanismo di CCL5 nel segnale ipotalamico dell’insulina a causa di possibili effetti compensativi a lungo termine. Di conseguenza, una manipolazione diretta di CCL5 segnalazione nei neuroni ipotalamici è l’approccio migliore. Ci sono, tuttavia, più tipi di neuroni nella regione ipotalamica ed è abbastanza costoso e richiede tempo per generare topi knockout specifico delle cellule. Utilizzando un ICV sistema di infusione può così risparmiare tempo e fornire un approccio più specifico per manipolare CCL5 funzione direttamente nel cervello, evitando possibili reazioni infiammatorie periferiche.
Studi che utilizzano pompe osmotiche sono già stati pubblicati in precedenza, fornendo grandi esempi e dimostrazioni di tecniche inerenti l’impianto di pompe osmotiche in roditori13. Tuttavia, abbiamo affrontato alcune sfide mentre a seguito di questi protocolli nel nostro studio. In primo luogo, alcune delle attrezzature utilizzate nel protocollo è piuttosto costoso, compreso 1) il sistema elettrico per raggiungere la posizione, disegnare e inserire l’ago nel cervello di topo, 2) il sistema thermo per il mantenimento della temperatura corporea del mouse e 3) l’ossigeno-isoflurano sistema di fornitura per somministrazione di anestesia ai topi. In secondo luogo, le tecniche descritte in altri articoli erano difficili da replicare perché eravamo solo in grado di utilizzare gli animali all’interno di una piccola gamma di pesi corporei e a certe età per il nostro studio. Siamo consapevoli che i topi più grandi sono più adatti per la chirurgia e l’impianto. Tuttavia, nel nostro studio, abbiamo dovuto usare topi più piccoli e più giovani per evitare il sovrappeso e gli effetti di invecchiamento sul regolamento di glucosio insulina e sangue: solo topi maschi con corpo peso 25 ± 2 g e l’età circa 2 mesi di età sono stati scelti nello studio. Così, è difficile eseguire un intervento chirurgico e suturare la ferita sulla testa del mouse. In terzo luogo, la risposta infiammatoria deve essere ridotto al minimo dopo l’intervento chirurgico poiché una citochina infiammatoria è l’obiettivo in questo studio. Topi e ratti possono rimuovere la sutura e ferite aperte facilmente dopo la chirurgia, che causare infiammazione e aumentare le reazioni delle chemochine. Di conseguenza, è necessaria una strategia per raggiungere la posizione e disegnare e inserire l’ago nel cervello di topo che evita l’infezione secondaria. Di conseguenza, abbiamo modificato i protocolli descritti in precedenza per rendere questa tecnica conveniente, più facile e meno dannosi per gli animali, come descritto nel paragrafo seguente.
In primo luogo, abbiamo usato un chiodo trapano per manualmente un foro intorno alla zona di destinazione contrassegnata sul cranio, come descritto al punto 2.6. Questo metodo è conveniente e permette di monitorare l’intera procedura in modo da evitare di danneggiare il mouse meningi e vasi sanguigni. Regolazione del glucosio di anima è alterata dopo il colpo acuto, ad esempio un’emorragia nel cervello. L’iperglicemia acuta e diabete-come le sindromi sono state osservate anche dopo il colpo in contesti clinici14,15. Allo stesso modo, abbiamo anche trovato risposta dell’insulina e livello alterato del glucosio nei topi con emorragia e pus nel cervello. Siamo consapevoli che migliore controllo della chirurgia basata su manuale è necessaria per garantire la coerenza dei risultati. In secondo luogo, abbiamo approfittato di un biomateriale medico recente sviluppato comunemente utilizzato nelle cliniche, colla per tessuti (punto 2.8), per sigillare la pelle sulla testa del mouse dopo la chirurgia, quindi, evitando punti di sutura e accelerando il tasso di guarigione. Questo rende più facile per eseguire le procedure chirurgiche e riduce la possibilità di infiammazione secondaria. In terzo luogo, il tempo necessario per eseguire l’intera procedura chirurgica è comparativamente più breve, che aumenta la probabilità di sopravvivenza per i topi e abbassa il dosaggio del farmaco anestetico viene iniettato intraperitonealmente. Abbiamo osservato un alto tasso di sopravvivenza (95%) e ha ottenuto risultati relativamente accurati seguendo questo protocollo modificato.
La limitazione di questa tecnica è il lasso di tempo relativamente breve di consegna della droga. Anche se una pompa osmotica può essere posizionato nel corpo del mouse in alternativa senza riapertura il cervello, il nostro studio solo si concentra sull’effetto delle chemochine infiammatorie sul cervello per regolare la segnalazione insulina periferica sistemica. Ulteriori interventi chirurgici nei tessuti periferici possibilmente potrebbero indurre una reazione infiammatoria nei tessuti periferici, che sarebbe poi aumentano l’espressione di chemochine infiammatorie e influenzare i risultati. In secondo luogo, il tempo di dimezzamento del farmaco limita inoltre la durata dello studio. Proteine ricombinanti come chemokine di solito hanno un’emivita più breve, che perde la sua attività nel corso del tempo, anche se permette anche di studiare l’effetto di blocco CCL5 segnalazione nel cervello nel breve termine. Nostri studi precedenti hanno anche descritto un approccio di modificazione genetica per la generazione di un topo knockout CCL5, che fornisce un modello a lungo termine effetti8.
Ci sono alcune nuove tecniche e metodi alternativi per consegnare i farmaci nel cervello. La nanotecnologia è una tecnica potente, che può essere utilizzata per consegnare i farmaci nel sistema nervoso centrale. Tuttavia, molti farmaci sono termosensibili e possono essere distrutti quando si cerca di assemblarli in nanoparticelle16. Inoltre, le nanoparticelle possono passare attraverso BBB ed essere uptaken dalle cellule che sono adatti per siRNA o farmaci più comuni, ma non si tratta di un metodo ideale per legame ligando-recettore.CCL5 richiede l’associazione al suo recettore, CCR5, nei neuroni dell’ipotalamo ARC a prendere effetto8, e la consegna di CCL5 antagonista CCL5 Metin neuroni attraverso nanoparticelle potrebbe causare una perdita della capacità di legare e bloccare CCR5 sulla cella superficie.
Il livello di glucosio nel sangue era significativamente più alto nei topi amministrati con il CCL5 MetCCL5-antagonista rispetto ai comandi (topi amministrati con aCSF) nel test di tolleranza al glucosio orale. La somministrazione di insulina aggiuntivi (prova di tolleranza dell’insulina) era in grado di abbassare il livello della glicemia in MetCCL5 ricezione topi (Figura 4B), che suggerisce che l’insulina endogena sia esterna non può ridurre i livelli di glucosio nel sangue Quando il blocco ipotalamico CCL5 segnalazione. Topi è diventato resistenti dell’insulina senza CCL5 attività nell’ipotalamo. Serine302 aumentata fosforilazione di IRS-1 è stata trovata in topi che ricevono Met-CCL5 rispetto ai topi di controllo ricezione aCSF (Figura 5A-B). Fosforilazione della serina 302 di IRS-1 è stata indicata per indurre una dissociazione fisica di IRS-1 dal ricevitore dell’insulina, che è delle principali cause di insulino resistenza6; l’insulina è in grado di attivare segnali a valle come la PI3K-Akt. Un ex vivo insulina stimolazione studio ha confermato l’insulina molecola di segnalazione a valle Akt (p-AktS473) non è stata attivata dall’insulina nel tessuto ipotalamico del mouse infuso con Met-CCL5 e, invece, ha aumentato la fosforilazione della serina 302. Complessivamente, sia dati fisiologici (OGTT e ITT) e studio molecolare dimostrano che ipotalamico CCL5 segnalazione media il regolamento del segnale ipotalamico dell’insulina, che contribuisce al metabolismo di glucosio e resistenza di insulina sistematica.
Il ruolo e il meccanismo di CCL5 e CCR5 in associate all’obesità diabete rimane poco chiaro. Kitade et al ha segnalato che la carenza di CCR5 topi protetti da infiammazione obesità-indotta, del reclutamento del macrofago e insulino resistenza17. Tuttavia, altri studi di Kennedy et al. trovato risultati opposti che indica che la carenza di CCR5 altera la tolleranza al glucosio sistemico nonché segnalazione18dell’insulina del muscolo e degli adipociti. Entrambi gli studi applicati una dieta ad alta percentuale di grassi per indurre l’obesità, che conduce all’infiammazione cronica di tutto il corpo e risposta compensativa. Questi studi non forniscono meccanismi puliti e chiari di CCL5 e CCR5 nel regolamento di segnalazione dell’insulina. D’altra parte, la tecnica di pompa osmotica consente un’infusione di specifici del cervello ed evita risposta compensativa con relativa consegna di tempo limitato.
In conclusione, anche se la pompa osmotica con il sistema di infusione del cervello sembra essere una tecnica “all’antica”, fornisce un metodo più economico, più facile e meno nocivo di drug delivery e aiuta a studiare la funzione del ligando-recettore segnalazione nella cervello.
The authors have nothing to disclose.
Siamo grati supportato dal Ministero della scienza e tecnologia, Taiwan – MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3), salute e benessere a pagamento dei prodotti del tabacco – MOHW106-TDU-B-212-144001 a C. S-Y
Vetbond Tissue Adhesive | 3M | #1049SB | The glue used to seal the lesion site on the mouse head |
LOCTITE 454 instant adhesive | Durect Corporation | #8670 | The glue used to fix the needle on the mouse skull |
Alzet Micro- Osmotic Pump | Durect Corporation | #9922 | 0.11 μl per hour, 28 days |
Brain infusion system | Durect Corporation | #8851 | 1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain |
Glucometer | Roche | #06870244001 | Used to measure the blood glucose level |
Glucose chip | Roche | #06454011020 | Used to load the blood sample |
Evan's blue | Sigma | #MKBK0523V | To demonstrate the drug infusion area |
Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | #3232145 C | Used to administer insulin intraperitoneally |
MIO NE116 CONTROL UNIT (nail drill) |
Mio System | #E235-015 | To drill a hole in the skull of the mouse |
CCL5/Met-RANTES Protein | R&D | #ADB0111081 | Recombinant Human CCL5, E-coli derived |
aCSF formula | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
Filter sterilize with a 0.22 μm filter apparatus, and store at 4°C. aCSF is stable for 3-4 weeks |
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Phospho-IRS-1 Serine302 antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
IRS-1 (D23G12) antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
Phospho-Akt Serine 473 antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:2000 dilution |
Akt (pan) (C67E7) antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:1000 dilution |
Animals: C57BL/6 | NAR Labs | Wild type mice strain used in the study |