Summary
Este protocolo estudia el papel de la quimiocina ligando de (motivo C-C) 5 (CCL5) en el hipotálamo mediante la entrega de un antagonista, CCL5 Met, en el cerebro de ratón utilizando un sistema de infusión de cerebro de bomba micro-osmótico. Esta inhibición transitoria de la actividad CCL5 interrumpido insulina hipotalámica señalización, conduce a la intolerancia a la glucosa y sensibilidad a la insulina sistémica periférica.
Abstract
Insulina regula el metabolismo de la sistemática en el hipotálamo y la respuesta de la insulina periférica. Una reacción inflamatoria en los tejidos adiposos periféricos contribuye al tipo 2 mellitus de la diabetes (T2DM) desarrollo y regulación del apetito en el hipotálamo. Receptor de chemokine Chemokine CCL5 y C C tipo 5 niveles (CCR5) se han sugerido para mediar la intolerancia a la arteriosclerosis y de la glucosa en diabetes mellitus tipo 2 (T2DM). Además, CCL5 desempeña un papel neuroendocrino en el hipotálamo regulando alimentos consumo y la temperatura corporal, por lo tanto, incitar a investigar su función en la señalización de insulina hipotalámica y la regulación del metabolismo de la glucosa periférica.
El sistema de infusión de cerebro de bomba micro-osmótico es una forma rápida y precisa manipular CCL5 función y estudiar su efecto en el cerebro. También proporciona una alternativa conveniente para generar un animal transgénico knockout. En este sistema, CCL5 señalización fue bloqueado por la infusión intracerebroventricular (ICV) de su antagonista, CCL5 Met, utilizando una bomba osmótica micro. La sensibilidad de la insulina y el metabolismo de glucosa periférica fue detectada por la prueba de tolerancia de glucosa Oral (OGTT) y prueba de tolerancia de insulina (ITT). Actividad de señalización de la insulina fue analizada luego por blot de proteína de las muestras de tejido de los animales.
Después de 7-14 días de infusión CCL5 Met, el metabolismo de la glucosa y la insulina sensibilidad fue deteriorada en ratones, como se ve en los resultados de la SOG y ITT. La fosforilación de IRS-1 serine302 aumentó y se redujo la actividad de Akt en neuronas hipotalámicas de ratones tras CCL5 inhibición. En conjunto, nuestros datos sugieren que bloquear CCL5 en el cerebro de ratón aumenta la fosforilación de IRS-1 S302 e interrumpe la señalización de insulina hipotalámica, conduce a una disminución en la función de la insulina en tejidos periféricos, así como la debilitación de glucosa metabolismo.
Introduction
Insulina afecta a una gran variedad de tejidos incluyendo el cerebro. La insulina atraviesa la barrera hemato - encefálica, entra en sistema nervioso central (SNC) y se une con el receptor de insulina (IR) en el hipotálamo para regular el consumo de alimentos, la actividad comprensiva y respuesta de la insulina periférica. La inflamación crónica en los tejidos adiposos periféricos se ha propuesto contribuir al tipo 2 mellitus de la diabetes (T2DM), pero cómo estas reacciones inflamatorias afectan insulina señales en el hipotálamo para mediar la respuesta y glucosa intolerancia a la insulina sistémica sigue siendo confuso. Algunas quimiocinas participan en la regulación del apetito y la regulación de la temperatura del cuerpo en el hipotálamo1 como factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), interleukin (IL) -6, IL-1β, monocito chemoattractant protein-1 (MCP-1) y CCL5 (ligando de adorno C C 5 ). Además, la inflamación en el hipotálamo conduce a resistencia a la insulina en T2DM2,3.
Entre estas quimiocinas, la alteración de los niveles de expresión de quimioquinas CCL5 y su receptor CCR5, en tejidos adiposos se ha asociado con intolerancia a la glucosa y arterioesclerosis en T2DM en seres humanos como en animales. CCL5 también tiene funciones neuroendocrinas, incluyendo la regulación de la temperatura de entrada y el cuerpo los alimentos, en el hipotálamo. Por lo tanto es importante investigar si CCL5 participa en la activación de señales de insulina en el hipotálamo o en los tejidos periféricos.
Señalización de insulina es regulada firmemente dentro de las células. La Unión de receptores de la insulina a la insulina (IR) activa las proteínas sustrato (IRS) de la insulina receptor, seguidas de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y proteína quinasa B (PKB/AKT) activación y glucosa transportador-4 (GLUT4) membrana translocación4 . Las proteínas IRS son los reguladores principales en esta vía de señalización: tienen múltiples residuos de tirosina y serina, que pueden ser phosphorylated en respuesta al positivo o negativo insulina señales5. Por ejemplo, la fosforilación de la serina 302 en IRS-1 puede conducir a la disociación física de IRS-1 de IR y bloquean la transducción de la señal de insulina, conduce a la resistencia de insulina6. El deterioro de la actividad de las proteínas IRS en el hipotálamo se ha demostrado para inducir resistencia a la insulina y la intolerancia a la glucosa en ratones7.
Una manera común de estudiar la función de un gen específico es la manipulación de la expresión de genes de la blanco distribuidos a lo largo de todo el cuerpo del organismo. Sin embargo, esto puede tener varios inconvenientes: 1) que podría generar efectos regulatorios o compensatorio comentarios diferentes en el tiempo y 2) este método no nos ayuda a ilustrar el papel de la proteína diana en las regiones específicas del cerebro. También, tejidos y células específicos gene nocaut animales tardan mucho tiempo para criar y son costosos. Por lo tanto, utilizamos un a corto plazo sistema de bomba osmótica infusión cerebro - una forma relativamente rápida y conveniente para interferir con la señalización de la proteína diana en el cerebro usando la droga antagonista para superar los temas antes mencionados. Estereotácticas inyecciones solía requieren intrincada habilidad quirúrgica y grandes inversiones en instrumentación y tiempo. En este protocolo, le ofrecemos una manera simple y segura para realizar la inyección stereotactic y un método rápido, menos dañino e instantáneo para detectar la concentración de glucosa en sangre e investigar el papel de CCL5 en insulina hipotalámica Reglamento de señalización.
Protocol
Nota: Todos los protocolos y métodos utilizados en sujetos animales han sido aprobados por el cuidado de Animal institucionales y comités de uso (IACUC) de la Universidad médica de Taipei (números de protocolo: LAC-2014-0387)
1. preparación de sistemas de infusión de la bomba Micro-osmótica
Nota: Preparar la bomba, tampón líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) y drogas (solución de proteína Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL en aCSF)) bajo condiciones estériles utilizando buffers filtrados con 0,2 μm filtros y realizar todos los procedimientos bajo el capó de la cultura con guantes. Los procedimientos quirúrgicos se llevan a cabo como sigue:
- Preparar las bombas micro-osmótico un día antes de la cirugía: llenar la bomba micro-osmótico del cerebro con líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) con una jeringa de 1 mL y aguja Roma cabeza proporcionada junto con el kit. Sumerja la bomba micro-osmótica en aCSF y colocar en una coctelera y agite suavemente durante la noche.
PRECAUCIÓN: La bomba debe llenarse con aCSF, y deben evitarse las burbujas de aire dentro de la bomba (figura 1A). - Antes de comenzar la cirugía, prepare la solución de proteína recombinante del Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL, diluida en aCSF) para ser utilizado en el experimento. ACSF Retire la bomba y llene la bomba con la solución farmacológica poco a poco hasta que sale el exceso.
Nota: 15 mL aCSF o Met-CCL5/RANTES solución basta con bombas de 5-8.
PRECAUCIÓN: Repita el procedimiento para asegurar que la bomba está completamente llena de la droga sin burbujas dentro. - Cortar los tubos del catéter la longitud deseada y fijar con la aguja de infusión de cerebro de Roma-final en el kit de infusión de cerebro. Llene el equipo de infusión y los tubos con la droga.
- Finalmente, montar y conectar el kit de infusión de cerebro a la bomba micro-osmótico.
PRECAUCIÓN: no deben ser formadas burbujas en el tubo o la bomba (figura 1A). - Sumerja la fusión de bomba osmótica entero del cerebro situada en aCSF en un tubo de 50 mL esterilizados para evitar la bomba de la desecación. El conjunto de fusión de bomba osmótica del cerebro está ahora listo para ser utilizado para la cirugía.
Nota: Los sistemas de bomba micro-osmótico pueden utilizarse para infusión de medicamentos a largo plazo. Esto asegura un modo seguro y conveniente de administración de fármacos en el cerebro de ratón.
2. cirugía Ventricular intracerebral-implantación de la micro bomba osmótica
PRECAUCIÓN: Esterilizar el ambiente quirúrgico con etanol al 75% y asegurar que las personas involucradas en el estudio están usando guantes estériles y una bata de laboratorio limpia. Herramientas quirúrgicas instrumentos deben ser esterilizado y secado antes de su uso y posteriormente esterilizado con cirugías entre ratones de etanol del 75%.
- Peso del ratón y anestesiar mediante inyección intraperitoneal (IP) con ketamina/xilacina (ketamina 50 mg/kg xilacina 10 mg/kg).
PRECAUCIÓN: Los pesos corporales de ratones inferiores a 24 g no se recomiendan para la cirugía de implantación de bomba osmótica. - Montar y fijar la cabeza de ratón en el aparato estereotáctico (figura 1B).
- Utilice un par de tijeras quirúrgicas y pinzas para cortar abierto la piel externa que cubre el cráneo. Uso de yodo para limpiar el cráneo periférico.
- Separar la capa más externa de la piel la piel subcutánea con la ayuda de un par de pinzas de la cabeza de Roma cerca de la región del cuello para la implantación de sistema fusión de bomba osmótica-cerebro (figura 1).
- Marque el punto de infusión con referencia al mapa del cerebro (figura 1) usando el aparato estereotáctico. En este experimento, la aguja debe ser implantado en la región del ventrículo 3rd (Bregma: lateral de 0.0 mm, 1.3 mm posterior, ventral 5,7 mm).
- Taladre un agujero con un taladro de uñas alrededor de la zona marcada en el cráneo (Figura 1E).
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no romper el ratón meninges y los vasos sanguíneos, evitando la interrupción de los vasos de la sangre en el cerebro. - Coloque el conjunto de fusión de bomba micro-osmótico del cerebro que contienen aCSF (como control) o drogas (solución de proteína Met-CCL5/RANTES) bajo la piel detrás de la región del cuello e insertar la infusión de cerebro de la aguja en el orificio taladrado para infundir la droga en el cerebro de ratón ( Figura 1E). La aguja se penetran las meninges y entrar en el ventrículo. Fijar la aguja en el cráneo usando el gel desensibilizante superficial (Figura 1F) y esperar 1-2 min hasta que el pegamento se seca. A continuación, corte la parte saliente en la cima de la aguja (figura 1- H).
- Usar un pegamento adhesivo de tejidos para curar a la operación de la herida en la cabeza. Aplicar 50 μl del pegamento encima de la herida, junte los dos lados de la piel y sostenga en 30 s para permitir que la piel se sello (figura 1I).
PRECAUCIÓN: Use cojín 100% de alcohol para limpiar la herida después de la cirugía y 100 de ul de penicilina con estreptomicina para prevenir la infección. Nota: Piel de ratón forman tejido cicatricial y curan en unos días tras la administración de la cola quirúrgica. La principal ventaja del pegamento es la evitación de suturas quirúrgicas que puede causar irritación de la piel o inflamación. - El ratón en una jaula limpia guardan en un plato caliente (calentado a 37 ° C) y espere hasta que el ratón se recupera del efecto anestésico.
PRECAUCIÓN: Es fundamental para mantener la temperatura corporal del ratón para aumentar la probabilidad de supervivencia después de la cirugía. - Después de un período de recuperación de una semana, los ratones estarán listos para experimentos adicionales, tales como la prueba de tolerancia de glucosa Oral (OGTT) y prueba de tolerancia de insulina (ITT).
3. prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT)
Nota: Realice la prueba de tolerancia oral a la glucosa 7 días después de la infusión de la aCSF y MetCCL5/RANTES (10 ng/mL, 100 μL). Mantener un 6 h para los ratones antes de OGTT con suficiente suministro de agua. Mantener los animales en el mismo Banco de trabajo donde se realizarán los experimentos que pueden aclimatarse al medio ambiente para reducir el estrés durante el procedimiento.
- Preparación de solución de glucosa: antes de realizar el experimento, preparar la solución de glucosa disolviendo 3.75 g glucosa en 15 mL de agua H2O.
- Establecer un calendario para registrar las lecturas durante el procedimiento experimental (tabla 1).
Nota: Es importante establecer un calendario con intervalos adecuados entre cada examen de sangre para permitir exacto de grabación durante el experimento. - Peso de cada ratón después de un ayuno y calcular la cantidad adecuada de glucosa para ser inyectado.
- Glucómetro (Presione el botón de inicio para comprobar el estado de la batería, asegúrese de que funciona antes de la prueba.)
- Chip de glucosa
- Jeringa de insulina (jeringa de insulina de 0,3 mL)
- Hojas de afeitar
- Contador de tiempo
Nota: El chip de glucosa requiere sólo una gota de sangre. Cuando la muestra de sangre debe recogerse más de una vez, basta con aplicar presión mediante la ejecución de los dedos a lo largo de la cola del ratón varias veces mientras sostiene el extremo de la cola directamente sobre la viruta para recolectar sangre. No es necesario cortar el extremo de la cola cada vez mientras recogían muestras de sangre.
4. insulina prueba de tolerancia (ITT)
Nota: La prueba de tolerancia a insulina y prueba de tolerancia oral a la glucosa deben programarse al menos 7 días aparte para reducir el efecto del ayuno en los animales. Para la prueba de tolerancia a insulina (ITT), se administrará insulina humana (0.75 U/Kg) mediante inyección de IP.
- Preparación de 0.25 U insulina solución: diluir 100U insulina humana a la proporción de 1: 400 en solución salina.
- Peso de cada ratón después de un ayuno y calcular la cantidad inyectada de insulina en consecuencia: el volumen (μL) de 0.25 insulina U ser inyectado IP = 3 X BW (0,75 U insulina/Kg de peso corporal). Por ejemplo: para un ratón pesa 28,8 g, inyectar: 28.8 X 3 = 86,4 μL (insulina de 0.25 U diluido) (tabla 2).
PRECAUCIÓN: Los mismos animales podrían tener pesos corporales diferentes después de 6 h de ayuno en días diferentes. Por lo tanto, es necesario medir el peso del cuerpo antes y después de ayunar y realice que prueban de OGTT los ITT. Peso corporal de ratón podría bajar dependiendo de la especie, género y duración ayuno. Dosis más altas de insulina pueden causar shock insulínico y conducirían a la muerte del animal. - Crear una tabla (tabla 2) para registrar las lecturas durante el procedimiento experimental. Repita los pasos 3.4. a 3.8. para los medición los niveles de glucemia.
Representative Results
Implantes quirúrgicos de bombas de infusión osmótica que contiene cualquier aCSF como control o CCL5 antagonista MetCCL5 (bloque CCL5 efectos en el cerebro) se realizaron en los ratones. A los 7 y 14 días después de la cirugía, la tolerancia periférica de la glucosa y la sensibilidad de la insulina de los ratones se analizaron OGTT (después de 7 días) e ITT (después de 14 días) como se menciona en el protocolo. La prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT) y prueba de tolerancia a insulina (ITT) de ratones fueron realizados después de 6 horas de ayuno. Ratones fueron administrados con glucosa por vía oral, con el monto en función de sus pesos respectivos del cuerpo. Se registraron los cambios en los niveles de glucosa en sangre, como se muestra en la figura 3. Se realizó la prueba de sensibilidad de la insulina por inyección de insulina intraperitoneal (IP) en ratones y el cambio de nivel de glucosa en sangre se midió inmediatamente. Se registraron los cambios de niveles de glucosa en sangre por estimulación de la insulina en ratones con medicamentos de infusión diferentes, como se muestra en la figura 4. El nivel de glucosa en sangre se redujo ligeramente después de la administración de glucosa (figura 3B) y la inyección de insulina (Figura 4B) en ratones con CCL5 infusión de antagonista (MetCCL5) en comparación con ratones con la infusión de la aCSF. Estos resultados sugieren deficiencias en función de la insulina sobre el metabolismo periférico de la glucosa en ratones con CCL5 Metadministrado en el cerebro.
A continuación, analizamos la activación de la señal de insulina mediante la evaluación de la fosforilación de IRS-1 y niveles de activación de Akt en tejidos hipotalámicos. La fosforilación de serina en el 302 de IRS-1 era upregulated en ratones tratados con el antagonista (MetCCL5) (figura 5B-C) cuando los ratones fueron alimentados normalmente. En el grupo control, aCSF fue administrado en el hipotálamo de los ratones y el desafío de la insulina activa la molécula señal descendente Akt (473 de serina Akt fosforilada) (figura 5, F) sin el aumento (de la activación de IRS-1 serine302 Figura 5 -E) y serine473 fosforilación de Akt. Por el contrario, la señal de la Akt no aumentó en los ratones con CCL5 Met, pero hubo un aumento en la fosforilación de la serina de IRS-1 302 en lugar de otro. Mientras tanto, bloqueando la señal CCL5 en el cerebro de ratón interrumpe la actividad de la insulina en el hipotálamo y la función de la insulina periférica deteriorada. De nuestros resultados generales, como los resultados de la ITT, OGTT y ex vivo el desafío de insulina, llegamos a la conclusión que CCL5 en el hipotálamo contribuye a la activación de la señal de insulina y el metabolismo de la glucosa periférica sobre el estímulo de la insulina.
Figura 1. Procedimiento quirúrgico preparación e implantación de bomba osmótica en ratón. (A) la infusión de cerebro preparación kit y la bomba de perfusión con solución farmacológica. Flechas rojas indican los tubos del catéter llenados de líquido. (B) fijar y montar la cabeza de ratón en el aparato estereotáctico. (C) se separa la capa más externa de la piel de la piel subcutánea para la implantación de micro-osmótico bomba-cerebro de infusión; el tablero las líneas indican la ubicación de los implantes de bomba osmótica. (D) la flecha indica el lado de la infusión. (E) Perfore un orificio en la zona marcada en el cráneo. (F) la infusión de cerebro de bomba osmótica en la parte posterior del ratón e Inserte la aguja de infusión de cerebro en el orificio taladrado (guión en un círculo). (G) fijar la aguja en el cráneo usando pegamento adhesivo tisular y separar la parte superior de la aguja (tijera acentuado en G) como se muestra en (H). () Selle la herida usando tejido adhesivo pegamento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Imágenes representativas de la zona de difusión de drogas cuando se administra la droga en la región ventricular mediante la bomba osmótica. Azul de Evan es representante medicamento utilizado en la ilustración de la infusión de drogas bomba osmótica en la región ventricular (A) y difusión en los ventrículos terceros y laterales (B). Barra de escala = 0,5 cm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Metabolismo de la glucosa de los ratones después de la cirugía, medido por la prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT). La distribución de los niveles de glucosa en sangre cambia siguiendo la administración oral de la glucosa en ratones WT infundida con antagonista, CCL5 My aCSF (A) (B). Datos mostrados como media ± SE. (figura modificada de8). * p < 0.05 por ANOVA de dos vías. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Función de la insulina en glucosa de la sangre de ratones - la prueba de tolerancia a insulina (ITT). La distribución de los niveles de glucosa en sangre cambia después de la inyección de insulina en los ratones WT con aCSF (A) e infundido con antagonista, CCL5 M(B). Datos presentados como medias ± SE (figura modificada de8). p < 0.001, por ANOVA de dos vías. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Actividad de la señal de insulina en ratones después de la cirugía. (A) Western blot de la forma de fosforilación serina 302 inhibitoria de IRS-1 (insulina respuesta sustrato-1, pIRS1S302) en tejidos de hipotálamo de ratones tratados con aCSF o CCL5 antagonista, CCL5 Met(CCL5M) bomba de infusión. (B) niveles de fósforo-IRS-1S302 después de la infusión en hipotálamo, ratones con alimentación normal.(C) Western blot de la S302 fosforilación de IRS-1 y Akt activación (fósforo-Akt S473, pAktS473) con o sin estimulación de la insulina en el tejido hipotalámico después aCSF o infusión CCL5 MET. (D-E) Niveles relativos de PIR-1S302pS6KT421y pAktS473. ("2" de cada gráfico de barras representa: n = 2 para todas las cuantificaciones). (Las barras en blanco en 5D-E, a la izquierda: sin insulina; las barras de las tiras en 5D-E, derecho: con insulina). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| # | ID de ratón | Cuerpo | Glucosa | Inicio | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| peso | ΜL = 10xBW | tiempo | minutos | minutos | minutos | minutos | minutos | ||
| 1 | 501 | 25,8 g | 258 | 9:00 | 9:00 | 9:00 | 9:15 | 9:30 | 10:00 |
| 2 | 502 | g 25,3 | 253 | 9:07 | 9:07 | 9:07 | 9:22 | 9:37 | 10:07 |
Tabla 1. Calendario para la grabación de la prueba de tolerancia de glucosa Oral (OGTT)
| # | ID de ratón | Cuerpo | Insulina 0,25 UI | Inicio | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| peso | ΜL = 3xBW | tiempo | minutos | minutos | minutos | minutos | minutos | ||
| 1 | 501 | 28,8 g | 86.4 | 9:00 | 9:00 | 9:15 | 9:30 | 10:00 | 10:30 |
| 2 | 502 | g 25,3 | 75.9 | 9:07 | 9:07 | 9:22 | 9:37 | 10:07 | 10:37 |
Tabla 2. Calendario para la grabación de la prueba de tolerancia de insulina (ITT)
Discussion
El mecanismo de la inflamación crónica y quimiocinas relacionados como CCL5 y su receptor – CCR5 en el desarrollo de diabetes tipo 2 sigue siendo confuso. La inflamación crónica causa la infiltración de macrófagos en los tejidos adiposos y afecta a la regulación de los adipokines; mientras tanto, también atrae a las células β y deteriora la secreción de insulina de los islotes de Langerhans en respuesta a la glucosa en la sangre. Hipotálamo en el cerebro desempeña un papel importante como un centro de control en la coordinación de señales de insulina y adipoquinas desde los tejidos periféricos sistémicos en la regulación del apetito, metabolismo de la glucosa de sangre periférica y la respuesta de la insulina. Muchos estudios también indican que la inflamación hipotalámica conduce a la defectuosa regulación de la homeostasis de energía así como defectuoso islote pancreático y función hepática2,3,9,10. CCL5 en el cerebro contribuye a la regulación de alimentos entrada y cuerpo de temperatura en el hipotálamo11,12; sin embargo, la correlación de CCL5 para señalización de la insulina hipotalámica y sistémica es incierta. Un ratón de nocaut de cuerpo entero CCL5 (CCL5- / -) se ha generado para abordar esta cuestión, que muestra un fenotipo de resistencia de insulina con niveles más altos de insulina y los altos niveles de glucemia en sangre8. Sin embargo, requiere mucho tiempo para desarrollar el fenotipo de T2DM y es difícil de investigar la función y mecanismo de CCL5 en señal de insulina hipotalámica debido a posibles efectos compensatorios a largo plazo. Por lo tanto, una manipulación directa de CCL5 señalización en neuronas hipotalámicas es el mejor enfoque. Sin embargo, hay varios tipos de neuronas en la región hipotalámica y es bastante costoso y desperdiciador de tiempo generar ratones knockout específicas de la célula. Sistema de infusión utilizando un ICV puede así ahorrar tiempo y ofrecer un enfoque más específico para manipular CCL5 función directamente en el cerebro, evitando posibles reacciones inflamatorias periféricas.
Estudios utilizando bombas osmóticas han sido publicados anteriormente, proporcionando ejemplos y demostraciones de técnicas involucradas en la implantación de bombas de osmóticas en roedores13. Sin embargo, nos enfrentamos a unos retos siguiendo estos protocolos en nuestro estudio. En primer lugar, algunos de los equipos utilizados en el protocolo es bastante caro, incluyendo 1) el sistema eléctrico para llegar a la ubicación, el dibujo y la inserción de la aguja en cerebro de ratón, 2) el sistema de termo para mantener la temperatura corporal del ratón y 3) el oxígeno-isoflurano suministro de sistema para la administración de anestesia a los ratones. En segundo lugar, las técnicas descritas en otros artículos eran difíciles de replicar ya que solamente hemos podido utilizar animales dentro de una gama pequeña de pesos corporales y a ciertas edades para nuestro estudio. Somos conscientes de que los ratones más grandes son más convenientes para la cirugía y la implantación. Sin embargo, en nuestro estudio, tuvimos que utilizar ratones más pequeños y más jóvenes para evitar el sobrepeso y los efectos del envejecimiento sobre la regulación de glucosa insulina y sangre: sólo ratones machos con el cuerpo peso 25 ± 2 g y la edad de alrededor de 2 meses de edad fueron escogidos en el estudio. Por lo tanto, es difícil realizar la cirugía y la sutura de la herida en la cabeza de ratón. En tercer lugar, la respuesta inflamatoria tiene que reducirse después de la cirugía ya que una citoquina inflamatoria es el objetivo de este estudio. Las ratas y ratones pueden quitar la sutura y heridas abiertas fácilmente después de la cirugía, que resultan en inflamación y aumentar las reacciones de chemokine. Por lo tanto, es necesaria una estrategia para llegar a la situación y sacar e introducir la aguja en cerebro de ratón que evita infección secundaria. Por lo tanto, modificamos los protocolos previamente descritos para hacer esta técnica eficaz, más fácil y menos perjudiciales a los animales, como se describe en el párrafo siguiente.
En primer lugar, se utilizó un taladro del clavo para perforar manualmente un agujero en el área del objetivo marcado en el cráneo, como se describe en el paso 2.6. Este método es eficaz y nos permite controlar todo el proceso para evitar dañar las meninges de ratón y los vasos sanguíneos. Regulación de la glucosa de sangre se deteriora después de un accidente cerebrovascular agudo, como una hemorragia en el cerebro. Hiperglucemia aguda y los síndromes parecidos a la diabetes también se observaron después del accidente cerebrovascular en ajustes clínicos14,15. Del mismo modo, también se encontró respuesta de insulina y el nivel de intolerancia a la glucosa en ratones con hemorragia y pus en el cerebro. Somos conscientes de que el mejor control de la cirugía basada en el manual es necesario para asegurar la consistencia de los resultados. En segundo lugar, aprovechó de un nuevo biomaterial médico utilizado en clínicas, pegamento adhesivo de tejido (paso 2.8), para sellar la piel en la cabeza del ratón después de la cirugía, por lo tanto, evitando puntos y acelera la tasa de curación. Esto hace más fácil de realizar procedimientos quirúrgicos y reduce la posibilidad de inflamación secundaria. En tercer lugar, el tiempo necesario para llevar a cabo todo el procedimiento quirúrgico es relativamente más corto, que aumenta la probabilidad de supervivencia de los ratones y disminuye la dosis de fármaco anestésico se inyecta por vía intraperitoneal. Se observó una tasa de supervivencia alta (95%) y se obtuvieron resultados relativamente precisos siguiendo este protocolo modificado.
La limitación de esta técnica es el relativamente corto tiempo de entrega de la droga. Aunque una bomba osmótica puede ser colocada en el cuerpo del ratón alternativamente sin volver a abrir el cerebro, nuestro estudio sólo se centra en el efecto de quimioquinas inflamatorias en el cerebro para regular la señalización de insulina sistémica periférica. Cirugía adicional en los tejidos periféricos posiblemente podría inducir una reacción inflamatoria en los tejidos periféricos, que luego aumentaría la expresión de quimioquinas inflamatorias y afectar los resultados. En segundo lugar, la vida media del fármaco también limita la duración del estudio. Proteínas recombinantes como chemokine generalmente tienen una vida media más corta, que pierde su actividad con el tiempo, aunque también nos permite estudiar el efecto de bloqueo CCL5 señalización en el cerebro a corto plazo. Nuestros estudios anteriores también han descrito un enfoque de modificación genética para la generación de un ratón knockout CCL5, lo que proporciona un modelo de efectos a largo plazo8.
Hay algunas nuevas técnicas y métodos alternativos para administrar medicamentos en el cerebro. La nanotecnología es una técnica poderosa, que puede utilizarse para administrar medicamentos en el sistema nervioso central. Sin embargo, muchas drogas son termosensibles y pueden ser destruidas cuando se trata de paquete en nanopartículas16. Además, las nanopartículas pueden pasar a través de BBB y ser captados por las células que son convenientes para el siRNA o medicamentos más comunes, pero no es un método ideal para el atascamiento del ligand-receptor.CCL5 requiere unión a su receptor CCR5, en las neuronas del ARC hipotálamo para tomar efecto8, y la entrega de CCL5 antagonista CCL5 Meten las neuronas a través de nanopartículas puede causar una pérdida de la capacidad de enlazar y bloquear CCR5 en la célula superficie.
El nivel de glucosa en sangre fue significativamente mayor en los ratones administrados con el antagonista CCL5 MetCCL5 en comparación con los controles (ratones administrados con aCSF) en la prueba de tolerancia oral a la glucosa. Administración de insulina adicional (prueba de tolerancia a insulina) también era incapaz de bajar el nivel de glucemia en MetCCL5 recibir ratones (Figura 4B), que sugiere que la insulina endógena y externa no puede reducir niveles de glucosa en sangre Cuando el bloqueo hipotalámico CCL5 señalización. Ratones se convirtió en resistencia a la insulina sin CCL5 actividad en el hipotálamo. Serine302 aumento de fosforilación de IRS-1 se encontró en los ratones recibiendo Met-CCL5 en comparación con ratones control recibiendo aCSF (figura 5A-B). Fosforilación de la serina 302 de IRS-1 se ha demostrado para inducir una disociación física de IRS-1 del receptor de insulina, que es una causa importante de insulina resistencia6; la insulina es incapaz de activar las señales descendentes como la vía de la PI3K-Akt. Un estudio ex vivo insulina estimulación confirmó la insulina molécula aguas abajo de señalización Akt (p-AktS473) no se ha activado por la insulina en el tejido hipotalámico ratón infundido con Met-CCL5 y, en cambio, aumentó la fosforilación de serina 302. En conjunto, datos fisiológicos (OGTT y ITT) y estudio molecular demuestran que hipotalámico CCL5 señalización interviene en la regulación de la señal de insulina hipotalámica, que contribuye al metabolismo de glucosa y la resistencia de la insulina sistemática.
El papel y el mecanismo de CCL5 y CCR5 en la diabetes asociada a obesidad sigue siendo confuso. Kitade et al reportó que la deficiencia CCR5 protegido ratones de inflamación inducida por la obesidad, el reclutamiento de macrófagos e insulina resistencia17. Sin embargo, otros estudios realizados por Kennedy et al encontraron resultados opuestos que indican que la deficiencia CCR5 deteriora la tolerancia a la glucosa sistémica así como músculo y adipocito insulina señalización18. Ambos estudios aplican una dieta alta en grasas para inducir a la obesidad, que lleva a la inflamación crónica de todo el cuerpo y la respuesta compensatoria. Estos estudios no proporcionaron mecanismos limpios y claros de CCL5 y CCR5 en Reglamento de señalización de la insulina. Por otro lado, la técnica de bomba osmótica permite una infusión específica del cerebro y evita respuesta compensatoria con su entrega de tiempo limitado.
En conclusión, aunque la bomba osmótica con el sistema de infusión cerebral parece ser una técnica "antigua", proporcionan un método más barato, más fácil y menos dañino de la entrega de la droga y ayuda a investigar la función de ligando-receptor en la cerebro.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos el apoyo del Ministerio de ciencia y tecnología, Taiwán – suplemento MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3), salud y bienestar de productos de tabaco - MOHW106-TDU-B-212-144001 a S Y C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | #1049SB | The glue used to seal the lesion site on the mouse head |
| LOCTITE 454 instant adhesive | Durect Corporation | #8670 | The glue used to fix the needle on the mouse skull |
| Alzet Micro- Osmotic Pump | Durect Corporation | #9922 | 0.11 μl per hour, 28 days |
| Brain infusion system | Durect Corporation | #8851 | 1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain |
| Glucometer | Roche | #06870244001 | Used to measure the blood glucose level |
| Glucose chip | Roche | #06454011020 | Used to load the blood sample |
| Evan's blue | Sigma | #MKBK0523V | To demonstrate the drug infusion area |
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | #3232145 C | Used to administer insulin intraperitoneally |
| MIO NE116 CONTROL UNIT (nail drill) |
Mio System | #E235-015 | To drill a hole in the skull of the mouse |
| CCL5/Met-RANTES Protein | R&D | #ADB0111081 | Recombinant Human CCL5, E-coli derived |
| aCSF formula | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
Filter sterilize with a 0.22 μm filter apparatus, and store at 4°C. aCSF is stable for 3-4 weeks |
|
| Phospho-IRS-1 Serine302 antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
| IRS-1 (D23G12) antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
| Phospho-Akt Serine 473 antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:2000 dilution |
| Akt (pan) (C67E7) antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:1000 dilution |
| Animals: C57BL/6 | NAR Labs | Wild type mice strain used in the study |
References
- Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. Chemokines/intercrines and central regulation of feeding. Am J Physiol. 266, R1711-R1715 (1994).
- Milanski, M., et al. Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver. Diabetes. 61, 1455-1462 (2012).
- Wang, X., et al. Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet. Experimental diabetes research. 2012, 847246 (2012).
- Benomar, Y., et al. Insulin and leptin induce Glut4 plasma membrane translocation and glucose uptake in a human neuronal cell line by a phosphatidylinositol 3-kinase- dependent mechanism. Endocrinology. 147, 2550-2556 (2006).
- Gual, P., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Positive and negative regulation of insulin signaling through IRS-1 phosphorylation. Biochimie. 87, 99-109 (2005).
- Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302. The Journal of biological chemistry. 279, 35298-35305 (2004).
- Boura-Halfon, S., Zick, Y. Phosphorylation of IRS proteins, insulin action, and insulin resistance. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism. 296, E581-E591 (2009).
- Chou, S. Y., et al. CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5. Sci Rep. 6, 37659 (2016).
- Calegari, V. C., et al. Inflammation of the hypothalamus leads to defective pancreatic islet function. J Biol Chem. 286, 12870-12880 (2011).
- Mighiu, P. I., Filippi, B. M., Lam, T. K. Linking inflammation to the brain-liver axis. Diabetes. 61, 1350-1352 (2012).
- Tavares, E., Minano, F. J. RANTES: a new prostaglandin dependent endogenous pyrogen in the rat. Neuropharmacology. 39, 2505-2513 (2000).
- Appay, V., Rowland-Jones, S. L. RANTES: a versatile and controversial chemokine. Trends in immunology. 22, 83-87 (2001).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. J Vis Exp. , e50326 (2013).
- Wang, N., et al. Admission blood glucose and in-hospital clinical outcome among patients with acute stroke in Inner Mongolia, China. Clin Invest Med. 32, E151-E157 (2009).
- Olsen, T. S. Blood glucose in acute stroke. Expert Rev Neurother. 9, 409-419 (2009).
- De Jong, W. H., Borm, P. J. Drug delivery and nanoparticles:applications and hazards. Int J Nanomedicine. 3, 133-149 (2008).
- Kitade, H., et al. CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status. Diabetes. 61, 1680-1690 (2012).
- Kennedy, A., et al. Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305, E897-E906 (2013).
