Summary
Denne protokol beskriver brugen af centrifugal elutriation til at adskille primære akut lymfoblastær leukæmiceller i forskellige cellecyklus faser.
Abstract
Evnen til at synkronisere celler har været central for fremme vores forståelse af cellecyklus regulering. Fælles anvendte teknikker inkluderer serum afsavn; kemikalier som arrestere celler på forskellige cellecyklus faser; eller brug af mitotiske shake-off som udnytter deres reducerede tilslutning. Dog har alle disse ulemper. For eksempel, fungerer serum sult godt for normale celler, men mindre godt for tumorceller med kompromitteret cellecyklus checkpoints på grund af onkogen aktivering eller tumor suppressor tab. Ligeledes kan kemisk behandlet cellepopulationer harbor narkotika-induceret skade og Vis stress-relaterede ændringer. En teknik, der omgår disse problemer er counterflow centrifugal elutriation (CCE), hvor celler er udsat for to modsatrettede kræfter, centrifugalkraften og væske velocity, hvilket resulterer i adskillelsen af celler på baggrund af størrelse og tæthed. Da celler rykke frem gennem cyklussen typisk forstørre, kan CCE bruges til at adskille celler i forskellige cellecyklus faser. Her anvender vi denne teknik til primære akut lymfoblastær leukæmiceller. Under optimale betingelser, kan en hovedsagelig ren befolkning af celler i G1 fase og en yderst højberiget befolkning af celler i G2/M faser fås i glimrende udbytte. Disse cellepopulationer er velegnet til at studere cellecyklus-afhængige virkningsmekanismer af anticancer narkotika og andre programmer. Vi også vise, hvordan ændringer til standard procedure kan resultere i ikke-optimal ydeevne og diskutere begrænsningerne af teknikken. Den detaljerede metodologi præsenteret bør lette anvendelsen og udforskning af teknikken til andre typer af celler.
Introduction
Dyrkede celler typisk vokse asynkront og enkelte celler findes i forskellige faser af cellecyklus. Nogle organismer udstille naturligt synkron celle cykler eller kan synkroniseres ved specifikke fysiologiske stimuli. For eksempel, kløft kerner i gigantiske plasmodia af slim skimmel Physarum polycephalum i en særdeles synkron mode1, og celler af grønalger Desmodesmus quadricauda kan synkroniseres ved vekslende lyse og mørke perioder2. Mens disse skadeorganismer tilbyder unikke eksperimentelle attributter, model de utilstrækkeligt kompleksiteten i pattedyrsceller. Evnen til at kunstigt synkronisere pattedyr cellepopulationer har været central for fremme vores forståelse af celle cyklus regulering og det molekylære grundlag af cellecyklus checkpoints. Almindelige metoder omfatter serum afsavn, kemiske blok og frigivelse, eller at udnytte fysiske egenskaber3,4. Tilbagetrækning af serum får ofte cellerne til at indtaste ubevægelighed, og fornyet tilsætning af serum fremmer celle cyklus genindtræden i G1 fase5. Kemiske hæmmere omfatter agenter som overskydende thymidine eller hydroxyurea som blokere cellerne i G1/S grænsen eller mikrotubulus-hæmmere, som typisk arrestere celler i M fase3,4. Tilgange, der udnytter fysiske egenskaber omfatte mitotiske shake-off som kan bruges til at berige for mitotiske celler, da de er mindre klæbende end interphase celler6. Men alle disse teknikker har potentielle ulemper. For eksempel, bevare ikke alle celletyper levedygtighed i mangel af serum eller tilstedeværelsen af kemiske hæmmere, og udbyttet af celler efter mitotiske shake-off er begrænset uden forudgående synkronisering med mitotiske hæmmere.
Med undtagelse af tidlige embryonale cellen cyklusser, hvor celler gradvist falde i størrelse, som de deler7, de fleste celler gennem cyklussen gennemgå vækst faser og blive større. Denne egenskab udnyttes i en teknik, counterflow centrifugal elutriation (CCE), som kan bruges til at adskille celler forskellige i størrelse og dermed i cellecyklus fase8,9. Under CCE, celler er under indflydelse af to modsatrettede kræfter: centrifugalkraft, der driver celler væk fra rotationsaksen, og væske velocity (counterflow), der driver celler mod rotationsakse (figur 1). Celler i elutriation kammer nå en ligevægt stilling hvor disse kræfter er ens. Nøglefaktorerne dikterer ligevægt stilling er celle diameter og densitet. Som strømmen sats stødpudeopløsning er øget og counterflow træk kraft opvejer centrifugalkraften, en ny ligevægt er etableret, forårsager en ændring i holdning af celler inde i salen. Alle celler er flyttet mod salen exit, resulterer i mindre virksomheder forlader salen først, mens de større celler blive inden for sal, indtil counterflow er steget tilstrækkeligt til at fremme deres exit. Cellerne undslippe elutriation salen med på hinanden følgende stigninger i counterflow sats kan indsamles i bestemte fraktioner og hver fraktion indeholder celler af sekventielt stigende størrelser. I stedet for at gennemføre elutriation med mindre stigninger i counterflow sats, vil sekventiel falder i centrifugalkraften ved faldende centrifugering hastighed opnå det samme resultat. Processen med elutriation kræver optimering afhængigt af celletype, elutriation buffer ansat, og de specifikke apparater, der anvendes. Satsen for sedimentation af celler under disse betingelser er bedst beskrives ved Stokes lov: SV = [d2(Rhop- Rhom) / 18η] .ω2r, hvor SV = sedimentering hastighed; d = diameter af partikler; Rhop = massefylde af partiklen; Rhom = massefylde af buffer; Η = viskositet af buffer; Ω = vinkelhastighed rotorens; og r = radiale position af en partikel. Således SV er proportional med celle diameter og densitet, og da diameter er opløftet til anden potens, det bidrager mere væsentligt end tæthed, som er generelt konstant gennem cellecyklus.
En vigtig fordel af CCE er, at cellerne ikke udsættes for barske betingelser for kemisk behandling eller ernæringsmæssige afsavn og kan inddrives i fremragende udbyttet hovedsagelig uforstyrrede. Et krav er, at de pågældende celler undergår en betydelig stigning i diameter på mindst 30%, når de krydser den celle cyklus. Den største ulempe er udgifterne til det specialiserede centrifuge, rotor og tilbehør. Ikke desto mindre har evnen til at forberede celler beriget med specifikke cellecyklus faser af CCE høj grad lettet celle cyklus forskning i organismer fra gær til pattedyrceller9,10. Derudover udvider de seneste fremskridt anvendelser til separation af celler fra sunde versus cancervævet, adskillelse af forskellige celletyper i heterogene blandinger, og at produktionen af specifikke celletyper for immunterapi9.
Vores store interesse har været i forståelse af virkningsmekanismen af mikrotubulus målretning agenter (MTA'er) som vinca alkaloider og taxanes. Disse lægemidler blev anset for at handle udelukkende i mitosen, blokerer spindel mikrotubulus funktion11,12, men de seneste tyder på, de kan også være rettet mod interphase mikrotubuli13,14. Vi har for nylig rapporteret, at primære akut lymfoblastær leukæmi (alle) celler gennemgå død i enten G1-fase eller i M fase når behandlet med Vincristin og andre MTA'er i en celle cyklus-afhængige måde15. Evnen til at adskille alle celler i forskellige cellecyklus faser af CCE var medvirkende til at nå frem til denne konklusion. I denne artikel vil vi beskrive de tekniske detaljer og tilbyde praktiske tips til anvendelsen af CCE til forberedelse af primær alle celler i forskellige cellecyklus faser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: denne protokol er blevet optimeret for primære B-alle celler der spænder i diameter fra ca 8 µm (G1 fase) til 13 µm (G2/M faser). Således, den specifikke centrifuge hastigheder og pumpe strømningshastigheder må ikke anvendes til celler med forskellige intervaller. Ikke desto mindre kan passende elutriation parametre estimeres ved hjælp af sedimentation sats ligning. Celler er kulturperler i en defineret serumfrit medium som beskrevet 16 med en optimal tæthed på 1-3 x 10 6 celler/mL. Med undtagelse af den samling af fraktioner, som er gennemført ved 4 ° C ved hjælp af is-køles rør, alle trin er udført ved stuetemperatur og centrifugeres ved 20 ° C med et maksimum på 24 ° C.
1. forberedelse af Elutriation Buffer og materialer
- for at reducere sammenklumpning af celler, forberede en elutriation buffer af Hank ' s afbalanceret saltopløsning (HBSS) med phenol rød suppleret med 2% føtal bovint serum ( FBS), til at beskytte celler mod mekanisk stress i løbet af elutriation proces, og 1,6 g/L 2-naphthol-6,8-disulfonic syre dikalium salt (NDA), hvilket gør cellen udvendige negativt ladede og reducerer sammenklumpning.
- Tilføje 1,6 g NDA til en 50 mL konisk tube.
- Under sterile forhold, tilføje 35 mL af HBSS fra en 1 L flaske til 50 mL konisk rør indeholdende NDA. Swirl røret indtil NDA har opløst.
- Ved hjælp af en 0,2 µm filter, overføre den opløste NDA ind i en ny steril 50 mL konisk rør. Derefter tilføje NDA til de resterende 1 L, HBSS.
- Endelig tilføje 21 mL FBS til HBSS at opnå en endelig koncentration på 2% (v/v).
Bemærk: Elutriation buffer kan være forberedt og opbevares ved 4 ° C indtil udløbsdatoen på HBSS, eller indtil der er en større ændring i pH som angivet af en gulfarvning af indikator farvestoffet.
- Mærke 50 mL konisk rør til samling af brøker, så der er rør mærket vask 1 og 2 (W1 og W2), brøker 1-20 (F1 - F20), og STOP.
- Pre chill disse rør på is før indsamling fraktioner.
2. Montering af Elutriation System
- første, installere strobe forsamling i centrifugen så ledningen føres ud af salen gennem porten på venstre side. Sikre at strobe flash lampe er forrest i salen, så det vil line op med fremviservinduet, når centrifugen er lukket.
- Secure forsamling på plads ved først stramning to Phillips-head skruer i de to huller i toppen af hver beslaget og derefter ved stramme fingerskruerne nederst på hvert beslag.
- Sæt netledningen i strobe strømporten på bagsiden centrifugen.
- Næste, angive rotoren lige ned på centrifuge drev hub og fastgør med en T-håndtag hex skruenøgle.
Bemærk: Hvis centrifugen ikke er nødvendige for ikke-elutriation, strobe forsamling og rotoren kan holdes i centrifugen mellem kørsler. - Når rotoren er sikret, Placer quick-release forsamling indeholdende elutriation afdeling, counter balance, roterende seal forsamling og en monteringspladen ind i rotoren.
- Skubbe jævnt med den ene hånd på elutriation afdeling og anden side om counter balance indtil bolte i rotoren snap ind i hullerne på monteringspladen.
- Endelig lægger den forankring kabel ved at placere pin på den ene side af kablet ind i hullet i den roterende seal forsamling og sikre eyehole på anden siden af kablet med en Phillips-head skruer (nævnt i punkt 2.1.1) på beslaget på venstre side o f salen.
- Næste, samle flow system ved hjælp af en variabel hastighed pumpe og slanger til pumpe buffer ind i elutriation afdeling og indsamle buffer, som den løber ud af elutriation afdeling.
- Indsætte størrelse 16 input slangen kommer fra variabel hastighed pumpe gennem porten øverst til venstre i centrifugekammeret så den træder ind i kammeret.
- Tillægger den frie ende af input slangen en montering og indsætte montering i input hullet på siden af den roterende seal forsamling.
- Indsæt størrelse 16 output slanger gennem porten og knytte den til overføringsrøret øverst på den roterende forsegle forsamling.
Bemærk: Flow-system kan også forblive samlet mellem elutriation kører.
- Endelig slå centrifugen og angive specifikationerne, der nødvendige for eksperimentet.
- Ændring rotor ID.
- Hvis centrifugen kræver en gang input, indstillet til 2 h, som er mere end tilstrækkeligt til at fuldføre en elutriation køre.
- Indstil temperaturen til 20 ° C med en max temp på 24 ° C.
- Sat til max acceleration og deceleration for langsom.
- Endelig, indstille hastighed til 867 x g.
3. Priming af ordningen med Elutriation
- først for at sterilisere elutriation systemet, placere reservoir slangen ind i en 500 mL plastflaske der indeholder 5% blegemiddel og placere output slangen ind i en tom 1 L plastic affald flaske.
- Tænd pumpen og indstille hastigheden til 25 mL/min. og tillade 5% blegemiddel til flow hele vejen igennem elutriation systemet, indtil det pumpes ud af output røret i affald flasken.
- Slår centrifugen og gør det muligt at komme til det maksimale udpeget hastighed (867 x g) for at frigive bobler og modtryk.
- Stoppe centrifugen. Når rotoren er stoppet, roterende, åbne låget og inspicere kammer for eventuelle lækager.
- Hvis der er nogen lækager, lad blegemiddelopløsning flow gennem systemet i mindst 5 min.
- Næste, skylle systemet med autoklaveres vand som blegemiddel kan føre til dannelse af bundfald fra elutriation buffer, som kan føre til sammenklumpning af celler, samt forårsage skade på cellerne.
- Sted reservoir slangen ind i en 1 liter flaske autoklaveres vand og gøre det muligt at skylle igennem i mindst 10 min.
- Efter skylning med vand, indføre elutriation buffer ind i systemet. Bruge en 150 mL glasflaske, der har været autoklaveres til at oprette et reservoir for elutriation buffer og celler.
- Tilsættes 100 mL af elutriation buffer til flasken og flytte reservoir slanger til glasflaske, således at røret er allernederst.
- Start centrifugen og tillade bufferen til at flyde gennem systemet til at skylle ud af vandet.
- Når reservoir flasken er næsten tom og vandet er helt skyllet ud af systemet, flytte den output slanger fra affald flasken til reservoiret for at bufferen er bliver genanvendt gennem systemet.
- Endelig, justere visningsvinduet, så elutriation kammer kan ses på den aktuelle hastighed.
- Presse strobe lampen power knappen på ydersiden af centrifugen, således at lampen tændes. Drej elutriation kNob også på ydersiden af centrifuge hele vejen til venstre.
- Mens ser gennem visningsvinduet langsomt drej drejeknappen til højre indtil elutriation salen kommer ind i Se og strobe lys er i gang med rotation af rotoren.
Bemærk: Elutriation ordning kan igen i denne tilstand, indtil cellerne er prepped.
4. Fremstilling af celle
- tælle celler og alikvot 300 til 400 millioner i vækstmediet i flere 50 mL konisk rør. Spin ned celler ved 1210 x g i 3 min.
- Aspirat off vækst medier og resuspend celler i af elutriation buffer af pipettering op og ned forsigtigt 25 mL.
- For at reducere celle sammenklumpning, pass celler to gange gennem en 25 gauge kanyle.
- Ved hjælp af en 10 mL sprøjte udarbejde cellerne og derefter vedhæfte 25 gauge kanyle og passere celler gennem på indersiden væg af en steril 50 mL konisk slange. Gentag dette, indtil alle 25 mL har passeret gennem nålen.
- Få en ny kanyle og sprøjte og Gentag processen ovenfor gang.
Forsigtig: Sprøjte nåle skal placeres i klid containere.
Bemærk: Det er afgørende, at cellerne er skubbet gennem nålen umiddelbart før at indføre dem til elutriation systemet til at holde celle sammenklumpning til et minimum.
5. Indførelsen af celle prøve i Elutriation System og samlingen af brøker
- indføre celle prøven i elutriation systemet ved at hælde den celle prøve i reservoir tank, der har den resterende elutriation buffer genanvendelse gennem .
- Lad celler ind i systemet og nå til ligevægt inden for elutriation afdeling.
Bemærk: Denne proces vil tage omkring 5 min og fremskridt kan spores ved at se cellerne, som de kommer ind i salen via visningsvinduet. For at sikre, at alle celler er til stede i salen, tage en dråbe af elueringsvæsken, Placer på et glas dias, og se under et mikroskop. Hvis prøven er fri for intakt celler, dette bekræfter deres opbevaring i kammeret.
- Lad celler ind i systemet og nå til ligevægt inden for elutriation afdeling.
- Begynde at indsamle fraktioner, når alle celler er gået ind i kammeret, og der er en tydelig grænse på den bredeste del af salen, hvor cellerne er i ligevægt.
- Begynder ved at flytte output tube til 50 mL konisk rør mærket W1. Indsamle 50 mL af elutriation buffer for denne fraktion, og sørg for at holde øje med reservoir tank og genopbygge med elutriation buffer når nødvendigt.
Bemærk: For at sikre, at alle celler har indført i systemet, Tillad reservoir tank til at blive næsten tom før genpåfyldning reservoiret første gang. Efter den første refill vil det ikke være nødvendigt at vente på reservoir til at blive næsten tom. Også, ikke nogensinde tillade tank at blive tomme, da dette vil skabe bobler og modtryk i systemet. - Når 50 mL er blevet opkrævet for W1, samtidig ændre hastigheden til 821 x g og flytte output røret til det koniske rør mærket W2 og indsamle 50 mL flere ved denne hastighed.
- Fortsætte skiftende hastighed og indsamle fraktioner, som angivet i tabel 1. Sørg for der er medie i reservoiret tank og holde de koniske rør på is på alle tidspunkter. Endelig, justere visningsvinduet ved langsomt at dreje knappen til højre, som hastigheden aftager.
- Når alle 20 fraktioner indsamles, stoppe centrifugen og indsamle 50 mL i den koniske rør mærket STOP.
- Begynder ved at flytte output tube til 50 mL konisk rør mærket W1. Indsamle 50 mL af elutriation buffer for denne fraktion, og sørg for at holde øje med reservoir tank og genopbygge med elutriation buffer når nødvendigt.
6. Flushing af ordningen med Elutriation
- efter centrifugen er stoppet helt skylle systemet ved at sætte reservoir røret i 1 L flaske autoklaveres vand og output tube tilbage i affald flasken.
- Drej pumpens omdrejningstal op til 50 mL/min og så vandet kan løbe gennem systemet, indtil det er forarmet.
- Slå off pumpe, fjerne input og output slangen fra quick-release forsamling og trække PIN-koden fra den forankring kabel.
- Fjern quick-release forsamling fra rotoren.
Bemærk: Afhængigt af hvad centrifugen skal bruges til, elutriation system kan nu stå som er. Ellers kan hele forsamlingen taget ned i den modsatte rækkefølge som beskrevet ovenfor. Elutriation kammer kan fjernes fra quick-release forsamling og rengøres mellem kører ved hjælp af en ultralyds vandbad. Dette fjerner snavs og forurenende stoffer fra kammerets væg, som kan indvirke negativt på senere kører.
- Fjern quick-release forsamling fra rotoren.
7. Analyse af brøker og samling af G1 eller G2/M Pools.
Bemærk: for at påvise effektiviteten af elutriation, hver fraktion er analyseret for celletal, celle diameter og DNA indhold, og pools er lavet af celler i G1 eller G2/M faserne for immunblot analyse, som beskrevet i Repræsentative resultater. Denne protokol afsnit vil beskrive hvordan du opretter disse puljer og forberede dem til eksperimenterende brug.
- Spin hver fraktion på 2000 x g i 5 min. ved 4 ° C og aspirat off elutriation buffer.
- Kombinerer brøker sammen for at opnå både en G1 fase swimmingpool og G2/M faser pool.
- For G1 fase pool, resuspend fraktioner, som blev indsamlet i hastighedsområde 788 x g til 661 x g (F1 - F5) i alt 1 mL af fosfat buffer saltopløsning (PBS) og overførsel til en 15 mL konisk slange. For G2/M faser pool, resuspend fraktioner, som blev indsamlet i hastighedsområde af 387 x g og 333 x g (F17 - F20).
- Spin ned celler på 2000 x g i 5 min. ved 4 ° C og aspirat off PBS.
- Resuspend celler i 10 mL af vækst medier og tage en celletal.
- Tage en prøve fra hver pulje skal analyseres for DNA indhold via propidium Iodid farvning og flow cytometric analyse 15.
Bemærk: Resten af hver pulje kan bruges til yderligere eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primære alle celler (3-4 x 108) blev udsat for centrifugal elutriation og indsamlet i to wash brøker og tyve vigtigste fraktioner, som beskrevet i protokollen. Tabel 1 viser repræsentative data, hvor det samlede antal celler i hver del samt den tilsvarende rotorens hastighed er præsenteret. Samlet var udbytte typisk over 80%. Måling af celle diameter i enkelte fraktioner bekræftet, at celle diameter steg med fremrykkende elutriation (figur 2). Disse resultater udgør gennemsnit af to uafhængige bestemmelser og afspejler den høje grad af data reproducerbarhed. Fraktioner var næste underkastes propidium Iodid farvning og flow flowcytometri Bestem DNA indhold (figur 3). Tidlig fraktioner (F1 - F5) indeholdt næsten udelukkende celler med 2N DNA indhold repræsenterer G1 fase. En blanding af celler i G1 og S fase blev observeret i mellemliggende fraktioner (F6 - F9) og celler med 4N DNA indhold blev observeret starter i F10. Senere fraktioner var hovedsageligt celler med 4N DNA indhold repræsenterer G2/M faser. Disse data sammen med resultaterne af figur 2 bekræftet en sammenhæng mellem Cellestørrelse og cellecyklus fase.
Baseret på disse resultater, brøker F1 - F5 blev kombineret til at oprette en pulje af celler i G1 fase, og fraktioner F17 - F20 blev kombineret til at oprette en pulje af celler i G2/M fase. Andelen af celler med 2N DNA indhold i G1 fase pool var typisk 99%, og andelen af celler med 4N DNA indhold i G2/M pool var typisk 85%, som bestemmes af propidium Iodid farvning og flow flowcytometri. Asynkron betingelser er 60-70% af primær alle celler er i G1 fase og 15-20% i G2/M faser15, således de værdier, der opnås efter elutriation afspejler høje niveauer af berigelse. For yderligere at godkende de to pools med hensyn til cellecyklus fase, blev ekstrakterne fra hver udsat for immunoblotting med markører for enten G1 eller G2/M faser. Først, vi udnyttede en phospho-specifikke antistof, som anerkender Retinoblastom (Rb) protein fosforyleret på enten Ser-807 eller Ser-811, da det er godt etableret, Rb bliver i stigende grad fosforyleret som celler fremrykning gennem cellecyklus17 . Som vist i figur 4, var niveauer af phospho-Rb meget højere i celler i G2/M pool versus G1 fase pool, overensstemmelse med forventninger. Vi spurgte også til cyclin B1, som er udtrykt mest i G2/M fase celler, og cyclin D1, som er mest udtrykt i G1 fase celler18 (figur 4). G2/M pool havde langt højere niveauer af cyclin B1 i forhold til G1 pool, overensstemmelse med forventninger. Cyclin D1 gav kun et svagt signal i disse præparater, men ikke desto mindre var påvises i G1 poolen og målbart i G2/M pool. GAPDH blev brugt en kontrol at bekræfte lig protein lastning.
Ændringer til standard-protokol blev udført at vurdere deres virkninger og til at fastsætte betingelser for optimal ydeevne. Først, antallet af fraktioner indsamles faldt, fra den standard tyve til kun tre, ved hjælp af hastigheder bestemmes ud fra tabel 1 til at repræsentere de terminal punkter for indsamling af celler i G1, S og G2/M faserne, som vist i tabel 2. Analyse af DNA indhold af fraktioner F1 og F3 er vist i figur 5A. Fraktion 1 indeholdt celler stærkt beriget i G1 fase (95%) og var dermed af lignende renhed, der opnås under standardbetingelser (figur 3). Men brøk 3, angiveligt celler, stærkt beriget i G2/M fase, gav en blandet befolkning, med celler i G1 og S faser også til stede. G2/M celler repræsenteret kun 51% af samlet, i forhold til 85% under standardbetingelser. Disse resultater viser, at forsøg på at forenkle proceduren ved at reducere antallet af fraktioner kompromiser prøve kvalitet. Næste, vi har testet effekten af at reducere brøkdel volumen, som et middel til at reducere reagensforbruget. En standard elutriation blev udført, bortset fra at 40 mL i stedet for 50 mL fraktioner blev indsamlet. Brøker F1 og F20 blev analyseret for DNA indhold. Som vist i figur 5B, var brøkdel F1 stærkt beriget i G1 fase celler (98%), svarer til opnået under standardbetingelser. Imidlertid brøkdel F20 indeholdt celler i alle tre faser, med celler i G2/M fase kun svarende til 64% af samlet sammenlignet med 85% under standardbetingelser. Disse resultater viser, at reducere brøkdel volumen også kompromiser prøve kvalitet.
Figur 1 . Princippet om counterflow centrifugal elutriation.
Bemærk at elutriation af celler kan opnås enten ved at øge antallet af counterflow, som angivet her eller ved at reducere rotorens hastighed. Tilpasset med tilladelse fra Macmillan udgivere Ltd: [natur protokoller] (Ref 8.), copyright (2008)8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Diameter af primære alle celler stiger med elutriation brøkdel.
Den gennemsnitlige diameter blev fastsat for hver fraktion, ved hjælp af en celle analyzer, der registrerer data fra 500-4.500 individuelle celler pr. prøve. De viste data er gennemsnit ± SD fra to uafhængige forsøg. Bemærk at fejllinjer for mange point mindre end symbolet og blev udeladt af hensyn til klarheden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Analyse af DNA indhold bekræfter vellykket adskillelse af primær alle celler i forskellige cellecyklus faser.
10 mL af hver fraktion blev fastsat i 70% EtOH, farves i propidium Iodid og analyseret ved flowcytometri, som beskrevet15. Propidium Iodid integreret intensitet (x-aksen) blev afbildet versus celletal (y-aksen) til at bestemme del af celler i hver fase, hvor 2N DNA indhold angiver G1 fase og 4N DNA indhold angiver celler i enten G2 eller M faser. De viste data er fra en repræsentativ eksperiment og væsentlige identiske resultater er opnået i fire gentagelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Sammenlægges, immunblot analyse af cellecyklus-relaterede proteiner ifraktioner.
Efter en standard elutriation af primær alle celler, brøker F1 - F5 blev kombineret til at skabe en G1 fase pool og fraktioner F17 - F20 blev kombineret til at skabe en G2/M fase pool. Uddrag blev forberedt og 40 µg/lane underkastes immunblot analyse, som beskrevet tidligere15, med antistoffer mod phospho-Rb (Ser807/811), cyclin B1, eller cyclin D1, alle anvendt på 1:2,000 fortynding. GAPDH (1:10, 000) blev brugt som en loading kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Vejledende data fra ikke-optimal elutriations.
A) virkningerne af faldende antal af fraktioner indsamles. Kun tre vigtigste fraktioner (F1 - F3), i stedet for standarden tyve, hver af 100 mL, blev indsamlet ved hastigheder som angivet i tabel 2. Brøker F1 og F3 blev analyseret for DNA indhold som i figur 3. B) virkning af at reducere brøkdel volumen. Tyve fraktioner blev indsamlet, på samme betingelser som i tabel 1, men kun 40 mL elutriation buffer i stedet for den standard 50 mL blev brugt til hver. Brøker F1 og F20 blev analyseret for DNA indhold som i figur 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Brøk | Hastighed (rpm) | G-Force | Cellerne i alt (x 10 ^ 6) |
| W1 | 3000 | 867 x g | 17.75 |
| W2 | 2920 | 821 x g | 7,00 |
| F1 | 2860 | 788 x g | 4,60 |
| F2 | 2800 | 755 x g | 10,75 |
| F3 | 2740 | 723 x g | 15.25 |
| F4 | 2680 | 692 x g | 22,50 |
| F5 | 2620 | 661 x g | 26.75 |
| F6 | 2560 | 631 x g | 25,00 |
| F7 | 2500 | 602 x g | 22,75 |
| F8 | 2440 | 573 x g | 18.00 |
| F9 | 2380 | 546 x g | 14.00 |
| F10 | 2320 | 518 x g | 10,75 |
| F11 | 2260 | 492 x g | 7.43 |
| F12 | 2200 | 466 x g | 8.63 |
| F13 | 2140 | 441 x g | 6,63 |
| F14 | 2100 | 425 x g | 4,98 |
| F15 | 2060 | 409 x g | 3.46 |
| F16 | 2020 | 393 x g | 3.43 |
| F17 | 1980 | 378 x g | 2,63 |
| F18 | 1940 | 363 x g | 3.17 |
| F19 | 1900 | 248 x g | 2.78 |
| F20 | 1860 | 333 x g | 1.66 |
| Stop | 0 | 0 x g | 5.19 |
| Samlede udbytte | 245.06 | ||
| Procent udbytte | 81.69 | ||
Tabel 1. Celle udbytte og tilsvarende rotorens hastighed for hver fraktion.
Celletal blev bestemt ved hjælp af en automatiseret celle counter. Samlede udbytte blev bestemt af summen af individuelle fraktioner versus input (3 x 108 celler). Data er et gennemsnit af to repræsentative eksperimenter. Centrifugalkraften og tilsvarende rotorens hastighed er givet.
| Brøk | Hastighed (rpm) | G Force |
| W1 | 3000 | 867 x g |
| W2 | 2920 | 821 x g |
| F1 | 2620 | 661 x g |
| F2 | 2020 | 393 x g |
| F3 | 1860 | 333 x g |
| Stop | 0 | 0 x g |
Tabel 2. Hastighed parametre for suboptimal elutriation.
Vist er centrifugale kræfter og tilsvarende rotor hastigheder for vasker og tre fraktioner indsamles i en komprimeret suboptimal elutriation. Se figur 5A for tilsvarende DNA indhold og tekst for detaljer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en metode til at indhente primære alle celler i forskellige faser i cellecyklus ved hjælp af CCE. Under optimale betingelser en hovedsagelig ren befolkning af celler i G1 fase og en yderst højberiget befolkning af celler i G2/M faser kunne let opnås i fremragende udbytte, og celler stærkt beriget i S fase kan også fås, hvis det ønskes. Resultaterne præsenteres her blev opnået med en primær alle kultur (specifikt, ALL-5), og det væsentlige identiske resultater er opnået med en uafhængig kultur, ALL-215. Derudover alle andre primære alle kulturer undersøgt til dato har lignende tæthed intervaller under asynkron vækst, og vil sandsynligvis Udfør samme måde når de udsættes for CCE. Vores forudgående undersøgelser har også vist, at andre leukæmi cellelinjer, herunder HL60 og K562, kan opdeles i forskellige cellecyklus faser ved hjælp af CCE19,20. Kritiske trin i proceduren omfatter at sikre at cellerne er mono-spredt og ikke klumpet i begyndelsen af run; optimering af vilkårene for counterflow sats og rotor hastighed; at sikre komponenterne i systemet er ren og fri for snavs; og at undgå indførelsen af luftbobler i flow linjer. CCE fungerer bedst med celler, der væsentlig stigning i Cellestørrelse som de fremskridt gennem cellecyklus. For en given befolkning af celler i suspension, kan dette være etableret i første omgang og nemt ved at undersøge forholdet mellem DNA indhold og side-scatter, den sidstnævnte afhængig af Cellestørrelse. Begge parametre kan måles samtidigt ved flowcytometri efter propidium Iodid farvning, som vi har beskrevet15. En lineær sammenhæng mellem side-scatter og DNA indhold giver tillid at Cellestørrelse stiger med cellecyklus forskud og dermed at CCE har potentiale til at adskille celler baseret på celle cyklus fase.
Som vi har vist (figur 5), resultere afvigelser fra den optimerede procedure i kompromitteret prøve kvalitet, især for celler i G2/M faser. Men reduktion i antallet af fraktioner eller brøkdel volumen ikke mærkbart påvirkede renheden af celler i G1 fase (figur 5). Genveje til proceduren kan således tolereres, hvis kun renset G1 fase celler er nødvendigt. Selvom CCE er let indstillet til suspension cellekulturer, kan den også anvendes til subcellulært fraktioner. For eksempel, har kerner fra murine præ-B-celler været korrekt størrelse-adskilt ved hjælp af CCE8. Vedhængende celletyper potentielle problemer på grund af deres tilbøjelighed til sammenklumpe og mulige tilslutning til overflader af slangen og elutriation kammer og dermed bør undersøges med forsigtighed.
Den største begrænsning af CCE er omkostningerne ved udstyr; en mulig løsning er at samarbejde med en lab, som har den nødvendige apparater. Bemærk dog, at mens rotoren er en dedikeret instrument, centrifugen kan anvendes til generelle centrifugering formål, dermed reducere omkostningerne investeret udelukkende i CCE. En anden begrænsning er, at planlægningen af eksperimenter er mere problematisk i forhold til fleksibiliteten i andre metoder såsom serum sult eller kemiske synkronisering. Elutriation løber typisk tager 5-6 timer, og hvis cellerne opnået er efterfølgende behov for kortsigtede eller multi tid punkt eksperimenter, dette kan resultere i planlægning ulemper. Den største fordel er, at celler fremstillet ved denne metode er uforstyrrede og kan dyrkes i mange dage uden tegn på angst, som vi har vist15. Dette er i kontrast med celler synkroniseret med kemiske midler, som kan havnen narkotika-induceret skade. En nylig undersøgelse, ved hjælp af NB4 celler, der stammer fra akut myeloid leukæmi Blaster, direkte sammenlignet CCE og andre metoder, herunder anholdelse med serum sult, hydroxyurea eller behandling med en cyclin-afhængig kinase 1 inhibitor, RO-330621. Elutriated celler og celler anholdt på sammenlignelige faser syntes lignende DNA indhold og cyclin udtryk. Men når proteomet undersøgtes, større ændringer i protein overflod, navnlig stress-relaterede og anholdelse-specifikke proteiner, blev observeret i de anholdte celler og ikke i de elutriated celler ved tilsvarende celle størrelse positioner. Disse resultater fremhæve nytten af CCE til produktion af uforstyrrede celler og understrege, at forsigtighed bør anvendes, når fortolke data fra celler synkroniseret med andre midler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Anisha Kothari er i øjeblikket på afdeling af celle- og molekylærbiologi på St. Jude children's Research Hospital.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH CA109821 (til TCC). Vi takker Beckman Coulter for generøst at give midler til at dække udgifter og teknisk bistand i opsætning og drift af elutriation systemet. Vi takke Dr. Fred Falkenburg for at give første primære alle kulturer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks' balanced salt solution | Lonza | 10-508Q | 1 L bottle |
| Fetal Plus bovine serum | Atlas Biologicals | FP-0500-A | 500 mL bottle |
| 2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt | Acros Organics | 212-672-4 | 100 g powder |
| 50 mL concial tubes | Denville Scientifics | C1062-P | 500/case |
| PES Membrane 0.22 µm filter unit | Millipore | SLGP033RB | 250/pack |
| Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V | Beckman Coulter | B14544 | centrifuge compatible with elutriation system |
| JE 5.0 elutriator rotor kit | Beckman Coulter | 356900 | rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly |
| Chamber, standard, 4-mL, "A" | Beckman Coulter | 356943 | standard elutriation chamber |
| Masterflex L/S Easy-Load pump head | Cole-Parmer | EW-07518-10 | |
| Masterflex L/S Variable-Speed Drive | Cole-Parmer | EW-07528-10 | |
| Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 | Cole-Parmer | EW-96420-16 | |
| 25 G x 1.5 Precision Glide needle | BD | 305127 | sterile, single-use needles |
| 10 mL Luer-Lok syringe | BD | 309604 | sterile, single-use syringes |
| Vi-Cell XR | Beckman Coulter | 383556 | |
| PI/RNase staining buffer | BD Pharmingen | 550825 | propidium iodide/RNase staining buffer |
| cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | |
| cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 | |
| P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 8516s | |
| GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 2118s | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6516 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6515 |
References
- Beach, D., Piper, M., Shall, S. Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum. Exp cell res. 129, 211-221 (1980).
- Sevcikova, T., et al. Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda. FEBS letters. 587, 743-748 (2013).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat protoc. 8, 602-626 (2013).
- Banfalvi, G. Overview of cell synchronization. Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).
- Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation. Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).
- Dulla, K., Margalef, A. S. Large-Scale Mitotic Cell Synchronization. Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat protoc. 3, 663-673 (2008).
- Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments. Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).
- Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. Synchronization of Yeast. Meth mol. 1524, 215-242 (2017).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).
- Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell death diff. 19, 369-377 (2012).
- Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors. Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).
- Furst, R., Vollmar, A. M. A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment. Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).
- Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells. Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).
- Nijmeijer, B. A., et al. Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors. Exp hematol. 37, 376-385 (2009).
- Knudsen, E. S., Wang, J. Y. Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation. Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).
- Malumbres, M., Barbacid, M. Mammalian cyclin-dependent kinases. Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).
- Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1. Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).
- Sen, S., et al. Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).
- Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells. eLife. 4, (2015).
