Summary
Denne protokollen beskriver bruk av sentrifugal elutriation skille primære akutt lymfatisk leukemi celler i forskjellige cellen syklus faser.
Abstract
Muligheten til å synkronisere celler har vært sentralt å fremme vår forståelse av cellen syklus. Vanlige teknikker ansatt inkluderer serum deprivasjon; kjemikalier som arrestere cellene på ulike celle syklus faser. eller bruk av mitotisk riste av som utnytter deres redusert etterlevelse. Men har alle disse ulemper. For eksempel, fungerer serum sult godt for normale celler, men mindre godt for kreftceller med kompromittert celle syklus sjekkpunkter på grunn oncogene aktivisering eller tumor suppressor tap. Tilsvarende kan kjemisk behandlet celle populasjoner havn narkotikainduserte skade og Vis stress-relaterte endringer. En teknikk som omgår problemene er motstrøm sentrifugal elutriation (Screen), der celler er utsatt for to motstridende krefter, sentrifugalkraften og væske hastighet, noe som resulterer i separasjon av cellene basert på størrelsen og tettheten. Siden celler bla gjennom syklusen vanligvis forstørre, kan Screen brukes til å skille celler i forskjellige cellen syklus faser. Her bruker vi denne teknikken primære akutt lymfatisk leukemi celler. Under optimale forhold, kan en i hovedsak ren populasjon av celler i G1 fase og høyanriket innbyggere celler i G2/M faser fås i god avkastning. Disse celle populasjoner er ideell for studere celle syklus-avhengige virkningsmekanismer av anticancer narkotika og andre programmer. Vi viser hvordan endringer i standard prosedyre kan resultere i ytelse under det optimale og diskutere begrensningene av teknikken. Detaljert metodikken presentert skal lette program og utforsking av teknikken til andre typer celler.
Introduction
Kultivert cellene vokse vanligvis asynkront og individuelle celler finnes i forskjellige faser av cellen syklus. Noen organismer viser naturlig synkron cellen sykluser eller kan synkroniseres ved bestemte fysiologiske stimuli. For eksempel dele kjerner innenfor gigantiske plasmodia av Slim mold Physarum polycephalum i en svært synkron mote1, og celler i de grønne algene Desmodesmus quadricauda kan synkroniseres av vekslende lyse og mørke perioder2. Slike organismer tilbyr unike eksperimentelle egenskaper, modell de mangelfullt kompleksiteten i pattedyrceller. Muligheten til å synkronisere kunstig pattedyr celle populasjoner har vært sentralt å fremme vår forståelse av cellen syklus og molekylære grunnlaget for cellen syklus sjekkpunkter. Vanlige metoder omfatter serum deprivasjon, kjemiske blokk og løslate eller utnytte fysiske egenskaper3,4. Tilbaketrekning av serum fører ofte til cellene inn gågaten og the re-tillegg av serum fremmer celle syklus reentry i G1 fase5. Kjemisk hemmere inkluderer agenter som overflødig thymidine eller hydroxyurea som blokkerer cellene på G1/S grensen eller microtubule hemmere som vanligvis arrestere celler i M fase3,4. Tilnærminger som utnytte kjennetegn inkluderer mitotisk riste-off som kan brukes til å berike for mitotisk celler siden de er mindre tilhenger enn interphase celler6. Men har alle disse teknikkene potensielle ulemper. For eksempel opprettholde ikke alle celletyper levedyktighet i fravær av serum- eller tilstedeværelsen av kjemiske hemmere og avkastningen av cellene etter mitotisk riste-off er begrenset, uten forutgående synkronisering med mitotisk hemmere.
Med unntak av tidlig embryonale cellen sykluser, der celler gradvis reduksjon i størrelse som de dele7, de fleste cellene bla gjennom syklusen gjennomgå vekstfaser og bli større. Denne egenskapen er utnyttet i teknikken for motstrøm sentrifugal elutriation (CCE), som kan brukes til å skille celler ulik størrelse og dermed i cellen syklus fase8,9. Screen, celler er under påvirkning av to motstridende krefter: sentrifugalkraften, som driver cellene fra rotasjonsaksen, og flytende hastighet (motstrøm), som driver cellene mot rotasjonsaksen (figur 1). Celler i det elutriation kammeret nå en likevekt stillingen der disse styrkene er like. De viktigste faktorene dikterer likevekt stillingen er cellen diameter og tetthet. Som flyten hastighet på buffer løsning er økt og motstrøm dra kraft enn sentrifugalkraften, en ny likevekt er etablert, forårsaker en endring i plasseringen av celler inne i kammeret. Alle celler flyttes mot kammer utgangen, resulterer i mindre de forlater kammeret først mens større cellene bo innenfor kammeret til motstrøm hastigheten er økt tilstrekkelig til å fremme sine avslutte. Cellene unnslippe elutriation kammeret med en påfølgende økning i motstrøm rate kan samles i bestemte fraksjoner og hver fraksjon inneholder celler med sekvensielt øke størrelser. I stedet for å gjennomføre elutriation med trinnvis økning i motstrøm rate, vil sekvensielle nedgang i sentrifugalkraften ved å redusere sentrifugering hastighet oppnå samme resultat. Prosessen av elutriation krever optimalisering av celle type, elutriation buffer ansatt og bestemt apparater. Frekvensen av sedimentering celler under disse forholdene er best beskrives Stokes loven: SV = [d2(ρp- ρm) / 18η] .ω2r, der SV = sedimentering hastighet; d = diameter av partikkel; Ρp = tetthet av partikkel; Ρm = tettheten av bufferen; Η = viskositet av bufferen; Ω = vinkelhastighet av rotoren; og r = radial posisjon av partikkel. Dermed SV er proporsjonal med cellen diameter og tetthet, og siden diameter er opphøyd andre, den bidrar mer betydelig enn tetthet som er vanligvis konstant gjennom cellen syklus.
En viktig fordel med Screen er at cellene ikke utsettes for harde forhold av kjemisk behandling eller ernæringsmessig deprivasjon og kan gjenopprettes i utmerket avkastning i hovedsak Uaffisert. Et krav er at cellene aktuelle gjennomgå en betydelig økning i diameter, på minst 30%, som de traversen cellen syklus. Den største ulempen er kostnadene av spesialiserte sentrifuge, rotor og tilbehør. Likevel har muligheten til å forberede celler beriket bestemt celle syklus faser av Screen mye lettere celle syklus forskning i organismer fra gjær pattedyrceller9,10. Videre utvide nylige fremskritt bruker til separasjon av celler fra sunn mot kreft tissue, separasjon av ulike celletyper i heterogene blandinger og produksjon av spesifikke celletyper for immunterapi9.
Vår store interesse har vært forstå virkningsmekanismen av microtubule målretting agenter (MTAs) som vinca alkaloider og taxanes. Disse stoffene var tenkt å fungere i mitose, blokkerer spindel microtubule funksjonen11,12, men nyere bevismateriale tyder på de kan også målrette interphase piskehale som henger13,14. Vi har nylig rapportert at primære akutt lymfatisk leukemi (alle) celler gjennomgå død i enten den G1 fasen eller i M fase når behandlet med vincristine og andre MTAs i en celle syklus-avhengige måte15. Muligheten til å dele alle celler i forskjellige cellen syklus faser av Screen var medvirkende i å nå denne konklusjonen. I denne artikkelen vi beskrive de tekniske detaljene og tilbyr praktiske tips for bruk av Screen til utarbeidelse av primære alle celler i forskjellige cellen syklus faser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: denne protokollen er optimalisert for primære B-alle celler som spenner seg over ca 8 µm (G1 fase) til 13 µm (G2/M faser). Dermed kanskje bestemte sentrifuge hastigheter og pumpe strømningshastigheter ikke gjelder for celler med forskjellig størrelse områder. Likevel hensiktsmessig elutriation parametere kan beregnes ved hjelp av sedimentering rate formelen. Celler er kultivert i et definert serum-fri medium som beskrevet 16 på en optimal tettheten av 1-3 x 10 6 celler/mL. Med unntak av samling av brøker som er utført på 4 ° C med is-avkjølt rør, alle trinn gjennomføres ved romtemperatur og sentrifuge satt til 20 ° C med maksimalt 24 ° C.
1. forberedelse av Elutriation Buffer og materialer
- for å redusere klumper av celler, forberede en elutriation buffer av Hank ' s balansert saltvannsoppløsning (HBSS) med fenol rød supplert med 2% () fetal bovin serum FBS), å beskytte cellene fra mekanisk stress under elutriation prosessen og 1.6 g/L 2-naphthol-6,8-disulfonic syre dipotassium salt (NDA), noe som gjør celle utvendig negativt ladet og reduserer klumper.
- Legge til 1.6 g NDA slik 50 mL konisk.
- Under sterile forhold, legge 35 mL av HBSS fra en 1 L flaske til 50 mL konisk røret som inneholder NDA. Swirl røret til NDA har oppløst.
- Bruke filtere 0,2 µm overføre oppløst NDA i en ny sterilt 50 mL konisk tube. Deretter legge NDA til den gjenværende 1 L HBSS.
- Til slutt legger 21 mL FBS til HBSS å få en endelig konsentrasjon på 2% (v/v).
Merk: Elutriation bufferen kan være forberedt og lagret på 4 ° C før utløpsdatoen på HBSS eller inntil det er en stor endring i pH som angitt av en gulfarging av indikator fargestoff.
- Merke 50 mL konisk rør for samling av fraksjoner slik at rør merket vaske 1 og 2 (W1 og W2), brøker 1-20 (F1 - F20), og stoppe.
- Pre chill disse rørene på is før samle brøker.
2. Montering av Elutriation
- først installerer strobe forsamlingen i sentrifugen slik at strømledningen er lei av kammeret gjennom porten på venstre side. Kontroller at strobe blits lampen er på forsiden av kammeret så det vil stille opp med visningsvinduet når sentrifuge er lukket.
- Sikre forsamlingen på plass ved å stramme første to Phillips-head skruene i de to hullene på toppen av hver braketten og deretter av stramme tommeskruene nederst på hver av brakettene.
- Koble strømledningen til strobe strømkontakten på baksiden av en sentrifuge.
- Deretter angi rotoren rett ned på drivnavet sentrifuge og sikre med en T-håndtak hex fastnøkkel.
Merk: Hvis sentrifugen ikke er nødvendig for ikke-elutriation formål, strobe forsamlingen og rotoren kan oppbevares i sentrifugen mellom kjøres. - Når rotoren er sikret, plassere hurtiglås samlingen som inneholder den elutriation chamber, counter balance, roterende segl montering og en monteringsplate i rotoren.
- Trykk ned jevnt med én hånd på elutriation kammeret og den andre hånden på counter balance til bolter i rotoren klikker inn i hullene på monteringsplaten.
- Kobler til slutt, forankring kabelen ved å plassere pin på den ene siden av kabelen inn i hullet i samlingen for roterende segl og sikre eyehole på den andre siden av kabelen med en Phillips-head skruene (nevnt i 2.1.1) på braketten på venstre o f kammeret.
- Deretter montere flyt systemet ved hjelp av en variabel hastighet pumper og rør til pumpen bufferen i elutriation kammer og samle bufferen som det renner ut av elutriation kammeret.
- Sett inn størrelse 16 input slangen kommer fra variabel hastighet pumpen gjennom porten øverst til venstre i sentrifuge kammeret slik at den kommer inn i kammeret.
- Feste en passende til gratis slutten av input slangen og montering inn inndata hullet på siden av samlingen for roterende segl.
- Sett inn størrelsen 16 utgang rør gjennom porten og knytte den til overføring røret på toppen av den roterende forsegle montering.
Merk: Flyt systemet kan også være montert mellom elutriation kjøres.
- Til slutt aktivere sentrifuge og angi spesifikasjoner nødvendig for eksperimentet.
- Endre rotoren ID.
- Hvis en sentrifuge krever en tid-inngang, satt for 2 h, som er mer enn tilstrekkelig til å fullføre en elutriation kjøre.
- Still inntemperaturen 20 ° c med en max temp 24 ° C.
- Angi akselerasjon for maks og retardasjon for langsom.
- Sett til slutt hastigheten til 867 x g.
3. Grunning av Elutriation
- først for å sterilisere elutriation systemet, plassere reservoaret slangen i en 500 mL plastflaske som inneholder 5% blekemiddel og plassere utdata slangen inn i en tom 1 L plast avfall flaske.
- Slå på pumpen og angi hastigheten til 25 mL/min og la 5% blekemiddel å flyte helt gjennom elutriation systemet før det pumpes ut av produksjon røret i avfall flasken.
- Aktivere sentrifuge og tillate det å komme til maksimalt angitt hastighet (867 x g) for å frigjøre bobler og backpressure.
- Stopper sentrifuge. Når rotoren har sluttet å rotere, åpne lokket og inspisere kammeret eventuelle lekkasjer.
- Hvis det ikke er noen lekkasjer, la den bleike løsningen strømme gjennom systemet for minst 5 min.
- Deretter flush systemet med autoklaveres vann som blekemiddel kan føre til dannelse av precipitates fra elutriation-bufferen som kan føre til klumper av celler, samt skade cellene.
- Sted reservoaret slangen i en 1 L flaske autoklaveres vann og la den til å tømme gjennom i minst 10 min.
- Etter spyle med vann, innføre elutriation buffer i systemet. Bruk en 150 mL glassflaske som har vært autoklaveres opprette et reservoar for elutriation buffer og celler.
- Legge til 100 mL elutriation buffer til flasken og flytte den reservoaret rør til glassflaske slik at røret er nederst.
- Starter sentrifuge og lar bufferen kan strømme gjennom systemet å skylle ut vannet.
- Når reservoaret flasken er nesten tomt og vannet er helt skylles ut av systemet, gå i produksjon rør fra avfall flasken til reservoaret slik at bufferen blir resirkulert gjennom systemet.
- Endelig justere visningsvinduet slik at elutriation kammeret kan sees på gjeldende hastighet.
- Trykk strobe lampe strøm-knappen på utsiden av centrifuge slik at lampen tennes. Slå på elutriation kNob også på utsiden av centrifuge helt til venstre.
- Mens du ser gjennom visningsvinduet, sakte slå på bryteren til høyre til elutriation kammeret kommer i visningen og strobe lys er i tid med rotasjonen av rotoren.
Merk: Elutriation systemet kan stå i denne tilstanden til cellene er prepped.
4. Utarbeidelse av cellen prøven
- antall celler og aliquot 300 til 400 millioner i vekstmediet i flere 50 mL konisk rør. Nedspinning cellene 1210 x g for 3 min.
- Leveringstanken av veksten medier og resuspend celler i 25 mL av elutriation buffer av pipettering opp og ned forsiktig.
- For å redusere celle clumping, pass cellene to ganger til en 25 måle pinne.
- Bruker en 10 mL sprøyte trekke cellene knytte 25 gauge nål og passere cellene til på innsiden av et sterilt 50 mL konisk rør. Gjenta dette til alle 25 mL har gått gjennom nålen.
- Få en ny sprøytespiss- og sprøytebytteprogrammer og gjenta prosessen ovenfor gang.
Forsiktig: Sprøyte nåler plasseres i sharps beholdere.
Merk: Det er viktig at cellene er presset gjennom nålen umiddelbart før du introduserer dem til elutriation systemet å holde celle clumping til et minimum.
5. Innføring i celle utvalg i Elutriation systemet og samling av brøker
- Presenter celle prøven inn i elutriation-systemet ved å helle celle prøven i reservoaret tanken som har gjenværende elutriation bufferen resirkulering gjennom .
- La cellene inn i systemet og nå likevekt innenfor elutriation kammeret.
Merk: Denne prosessen tar ca 5 min og fremdriften kan spores ved å se cellene som de kommer inn i kammeret via visningsvinduet. For å sikre alle celler i kammeret, ta en dråpe eluent, plassere på et glass lysbilde og se under et mikroskop. Hvis prøven er gratis intakt celler, dette bekrefter deres oppbevaring i kammeret.
- La cellene inn i systemet og nå likevekt innenfor elutriation kammeret.
- Begynne å samle fraksjoner når alle cellene har gått inn i kammeret og det er en tydelig grense på den bredeste delen av kammeret hvor cellene er i likevekt.
- Begynner ved å flytte ut røret til 50 mL konisk røret merket W1. Samle 50 mL av elutriation bufferen for denne fraksjonen, sørge for å holde øye med reservoaret tanken og fylle med elutriation buffer når nødvendig.
Merk: For å sikre at alle celler har inngått systemet, Tillat reservoaret tanken å bli nesten tom før beholder den første gang. Etter det første påfyllet vil det ikke være nødvendig å vente til reservoaret for å bli nesten tom. Også, ikke noen gang la tanken å bli tomt som dette vil skape bobler og mottrykk i systemet. - Når 50 mL har vært samlet for W1, samtidig endre på 821 x g og flytte ut røret til konisk røret merket W2 og samle 50 mL mer på denne hastigheten.
- Fortsett endre hastigheten og samle brøker som vist i tabell 1. Kontroller at det er media i reservoaret tank og oppbevare konisk rørene på is til alle tider. Til slutt, justere visningsvinduet ved langsomt å dreie på bryteren til høyre som senkes.
- Når alle 20 fraksjoner har blitt samlet, stoppe sentrifuge og samle 50 mL i konisk røret merket stopp.
- Begynner ved å flytte ut røret til 50 mL konisk røret merket W1. Samle 50 mL av elutriation bufferen for denne fraksjonen, sørge for å holde øye med reservoaret tanken og fylle med elutriation buffer når nødvendig.
6. Flushing av Elutriation
- etter sentrifuge har stoppet helt flush systemet ved at reservoaret røret 1 L flaske autoklaveres vann og utgang tuben tilbake i avfall flasken.
- Slå pumpen fart opptil 50 mL/min og la vannet gå gjennom systemet før den er tømt.
- Slå av pumpen, fjerne input og output slangen fra samlingen hurtiglås og trekke ut pin fra forankring kabelen.
- Fjern hurtiglås samlingen fra rotoren.
Merk: Avhengig av hva sentrifuge vil bli brukt, elutriation systemet kan nå stå som er. Ellers kan hele forsamlingen tas ned i motsatt rekkefølge som beskrevet ovenfor. Den elutriation chamber kan fjernes fra samlingen hurtiglås og renset mellom kjøres ved hjelp av en ultralyd vannbad. Dette fjerner rusk og forurensninger fra chamber veggen som kan negativt påvirke senere går.
- Fjern hurtiglås samlingen fra rotoren.
7. Analyse av brøker og samling av G1 eller G2/M bassenger.
Merk: for å demonstrere effektiviteten av elutriation, hver fraksjon er analysert for celletall, celle diameter og DNA innhold, og bassenger opprettes av celler i G1 eller G2/M faser for immunoblot analyser, som beskrevet i Representant resultater. Denne protokollen delen beskriver hvordan du oppretter disse bassengene og forberede dem for rekreasjonsbruk.
- Spin hver fraksjon 2000 x g i 5 min på 4 ° C og leveringstanken av elutriation buffer.
- Kombinerer fraksjoner sammen for å oppnå både G1 fase svømmebasseng og et G2/M faser basseng.
- For G1 fase bassenget, resuspend brøker som ble samlet i hastighet rekke 788 x g 661 x g (F1 - F5) i totalt 1 mL av fosfat buffer saltvannsoppløsning (PBS) og overføre til en 15 mL konisk rør. For G2/M faser bassenget, resuspend brøker som ble samlet i hastighet rekke 387 x g og 333 x g (F17 - F20).
- Nedspinning cellene på 2000 x g i 5 min på 4 ° C og leveringstanken av PBS.
- Resuspend celler i 10 mL vekst medier og ta en celletall.
- Ta en aliquot fra hvert utvalg skal analyseres for DNA innhold via propidium iodide flekker og flow cytometric analyse 15.
Merk: Resten av hvert utvalg kan brukes til videre eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primære alle celler (3-4 x 108) ble utsatt for sentrifugal elutriation og samlet i to vask brøker og tjue viktigste fraksjoner, som beskrevet i protokollen. Tabell 1 viser representant data der antall celler i hver fraksjon samt tilsvarende rotoren fart presenteres. Total var kapasitet typisk over 80%. Måling av cellen diameter i individuelle fraksjoner bekreftet at cellen diameter økt med fremskridende elutriation (figur 2). Disse resultatene representerer gjennomsnitt for to uavhengige bestemmelser og reflektere høye grad av data reproduserbarhet. Brøker ble deretter utsatt for propidium iodide flekker og flow cytometri for å fastslå DNA innhold (Figur 3). Tidlig brøker (F1 - F5) inneholdt nesten utelukkende celler med 2N DNA innhold som representerer G1 fase. En blanding av celler i G1 fase og S fasen ble observert i mellomliggende fraksjoner (F6 - F9) og celler med 4N DNA innhold ble observert starter i F10. Senere fraksjoner hadde hovedsakelig celler med 4N DNA innhold som representerer G2/M faser. Disse dataene med resultatene av figur 2 bekreftet en relasjon mellom Cellestørrelse og celle syklus fase.
Basert på disse resultatene, brøker F1 - F5 ble kombinert for å opprette en gruppe med celler i G1 fase og brøker F17 - F20 ble kombinert for å opprette en gruppe med celler i G2/M fase. Andelen av celler med 2N DNA innhold i G1 fase bassenget var vanligvis 99%, og andelen av celler med 4N DNA innhold i G2/M bassenget var vanligvis 85%, som bestemmes av propidium iodide flekker og flow cytometri. Under asynkron forhold er 60-70% av primære alle celler er G1 fase og 15-20% i G2/M faser15, dermed verdiene innhentet etter elutriation gjenspeiler høye nivåer av berikelse. For ytterligere godkjenning i to bassenger med hensyn til celle syklus fase, ble utdrag fra hver utsatt for immunoblotting med indikatorer G1 eller G2/M faser. Først utnyttet vi en phospho-spesifikke antistoffer som gjenkjenner retinoblastoma (Rb) protein fosforylert Ser-807 eller Ser-811, siden det er godt etablert at Rb blir stadig fosforylert som cellene advance gjennom cellen syklusen17 . Som vist i Figur 4, var nivåer av phospho-Rb mye høyere i celler i G2/M bassenget versus G1 fase bassenget, konsekvent med forventninger. Vi også analysert for cyclin B1, som er uttrykt mest i G2/M fase celler, og cyclin D1, mest uttrykt i G1 fase celler18 (Figur 4). G2/M bassenget hadde mye høyere nivåer av cyclin B1 sammenlignet G1 bassenget, konsekvent med forventninger. Cyclin D1 ga bare et svakt signal i disse forberedelsene, men likevel var i G1 bassenget og undetectable i G2/M bassenget. GAPDH brukte en kontroll for å bekrefte lik protein lasting.
Standard protokoll endringer ble utført til å vurdere deres effekter og betingelser for optimal ytelse. Først ble antall fraksjoner samlet redusert, fra den standard tjue bare tre, bruke hastigheter bestemmes fra tabell 1 for å representere terminal poengene for samling celler i G1, S eller G2/M faser, som vist i tabell 2. Analyse av DNA innholdet i fraksjoner F1 og F3 er vist i figur 5A. Brøkdel 1 inneholdt celler høyanriket i G1 fase (95%), og var dermed lignende renhet som innhentet under standard betingelser (Figur 3). Imidlertid brøkdel 3, tilsynelatende celler høyanriket i G2/M fase, ga en blandet befolkning, med celler i G1 og S faser også tilstede. G2/M celler representerte bare 51% av totalen forhold til 85% under standard betingelser. Disse resultatene indikerer som forsøker å forenkle fremgangsmåten ved å redusere antall fraksjoner kompromisser utvalg kvalitet. Neste testet vi reduserer brøkdel volum, å redusere reagens forbruk. En standard elutriation ble utført bortsett fra at 40 mL i stedet for 50 mL fraksjoner ble samlet. Brøker F1 og F20 ble analysert for DNA innhold. Som vist i figur 5B, var brøkdel F1 svært beriket i G1 fase celler (98%), lik som oppnås under standard betingelser. Brøkdel F20 inneholdt celler i alle tre faser, med celler i G2/M fase bare representerer 64% av totalen sammenliknet 85% under standard betingelser. Disse resultatene indikerer at redusere brøkdel volum også kompromisser utvalg kvalitet.
Figur 1 . Prinsippet om motstrøm sentrifugal elutriation.
Merk at elutriation celler kan oppnås ved å øke hastigheten av motstrøm som angitt her eller redusere rotoren fart. Tilpasset med tillatelse fra Macmillan utgivere Ltd: [natur protokoller] (Ref 8.), copyright (2008)8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Diameter primær alle celler øker med elutriation brøkdel.
Gjennomsnittlig diameter er bestemt for hver fraksjon bruker en celle analysator som registrerer data fra 500-4500 individuelle celler per prøve. Dataene er gjennomsnittlig ± SD fra to uavhengige eksperimenter. Merk at feilfelt for mange poeng er mindre enn symbolet og ble utelatt for klarhet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Analyse av DNA innhold bekrefter vellykket separasjon av primære alle celler i forskjellige cellen syklus faser.
10 mL av hver fraksjon ble løst i 70% EtOH, beiset i propidium iodide og analysert av flowcytometri, som beskrevet15. Propidium iodide integrert intensitet (x-aksen) var plottet mot celletall (y-aksen) til å fastslå delen av cellene i hver fase, der 2N DNA innhold angir G1 fase og 4N DNA innhold angir celler i G2 eller M faser. Dataene er fra en representant eksperimentet viktig identiske resultater er anskaffet i fire ganger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Immunoblot analyse av cellen syklus-relaterte proteiner i samletbrøker.
Etter en standard elutriation primær alle celler, brøker F1 - F5 ble kombinert for å lage et G1 fase basseng og brøker F17 - F20 ble kombinert for å opprette et G2/M fase basseng. Ekstrakter var forberedt og 40 µg/lane utsatt for immunoblot analyse, som beskrevet tidligere15, antistoffer mot phospho-Rb (Ser807/811) cyclin B1 eller cyclin D1, alle brukt på 1:2,000 fortynning. GAPDH (1:10, 000) ble brukt som en lasting. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Illustrerende data fra suboptimal elutriations.
A) effekt av å redusere antall fraksjoner samlet. Bare tre viktigste fraksjoner (F1 - F3), istedenfor vanlige tjue, hver på 100 mL, ble samlet, med hastigheter som vist i tabell 2. Brøker F1 og F3 ble analysert for DNA innhold som Figur 3. B) effekt av å redusere brøkdel volum. Tjue fraksjoner ble samlet, under samme vilkår som tabell 1, men bare 40 mL elutriation buffer i stedet for det standard 50 mL ble brukt for hver. Brøker F1 og F20 ble analysert for DNA innhold som Figur 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Brøk | Hastighet (rpm) | G-Force | Totalt antall celler (x 10 ^ 6) |
| W1 | 3000 | 867 x g | 17.75 |
| W2 | 2920 | 821 x g | 7.00 |
| F1 | 2860 | 788 x g | 4.60 |
| F2 | 2800 | 755 x g | 10.75 |
| F3 | 2740 | 723 x g | 15.25 |
| F4 | 2680 | 692 x g | 22,50 |
| F5 | 2620 | 661 x g | 26.75 |
| F6 | 2560 | 631 x g | 25.00 |
| F7 | 2500 | 602 x g | 22.75 |
| F8 | 2440 | 573 x g | 18.00 |
| F9 | 2380 | 546 x g | 14.00 |
| F10 | 2320 | 518 x g | 10.75 |
| F11 | 2260 | 492 x g | 7.43 |
| F12 | 2200 | 466 x g | 8.63 |
| F13 | 2140 | 441 x g | 6.63 |
| F14 | 2100 | 425 x g | 4,98 |
| F15 | 2060 | 409 x g | 3,46 |
| F16 | 2020 | 393 x g | 3.43 |
| F17 | 1980 | 378 x g | 2.63 |
| F18 | 1940 | 363 x g | 3.17 |
| F19 | 1900 | 248 x g | 2,78 |
| F20 | 1860 | 333 x g | 1.66 |
| stopp | 0 | 0 x g | 5.19 |
| Totale avkastning | 245.06 | ||
| Prosent avkastning | 81.69 | ||
Tabell 1. Celle avkastning og tilsvarende rotoren fart for hver fraksjon.
Celletall var fast bestemt på å bruke en automatisert celle teller. Totale avkastning ble bestemt av summen av personlige fraksjoner versus inndata (3 x 108 celler). Dataene er gjennomsnittlig to representant eksperimenter. Sentrifugalkraften og tilsvarende rotoren fart er gitt.
| Brøk | Hastighet (rpm) | G-Force |
| W1 | 3000 | 867 x g |
| W2 | 2920 | 821 x g |
| F1 | 2620 | 661 x g |
| F2 | 2020 | 393 x g |
| F3 | 1860 | 333 x g |
| stopp | 0 | 0 x g |
Tabell 2. Hastighet parametere for suboptimal elutriation.
Vises sentrifugalkreftene og tilsvarende rotoren hastigheter for vasker og tre fraksjoner samlet i en komprimert suboptimal elutriation. Se figur 5A tilsvarende DNA innhold og tekst for detaljer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en metode for å få primære alle celler i forskjellige faser av cellen syklus bruker Screen. Under optimale forhold en i hovedsak ren populasjon av celler i G1 fase og høyanriket innbyggere celler i G2/M faser kan lett fås i god avkastning, og cellene høyanriket i S fase kan også oppnås hvis ønskelig. Resultatene presenteres her ble innhentet med en primær alle kultur (spesielt alle-5), og i hovedsak identiske resultater er anskaffet med en uavhengig kultur, ALL-215. I tillegg alle andre primære alle kulturer undersøkt hittil har lignende tetthet områder under asynkron vekst, og ville sikkert utføre tilsvarende når de utsettes for Screen. Våre tidligere studier har også vist at andre leukemi linjer, inkludert HL60 og K562, kan deles inn i ulike celle syklus faser med Screen19,20. Kritisk trinn i prosedyren er at cellene er mono-spredt og ikke klumpet seg i begynnelsen av kjøringen; optimalisering av betingelsene for motstrøm rate og rotoren hastighet; sikre komponenter i systemet er rene og fri for rusk; og unngå innføring av luftbobler i flyt linjene. Screen fungerer best med celler som betydelig økning i Cellestørrelse som de gå gjennom cellen syklus. For en gitt befolkning på celler i suspensjon, kan dette etableres først og enkelt ved å undersøke forholdet mellom DNA innhold og side-scatter, det sistnevnte avhengighet Cellestørrelse. Begge parameterne kan måles samtidig av flowcytometri etter propidium iodide flekker, som vi har beskrevet15. En lineær sammenheng mellom side-scatter og DNA innhold gir tillit at Cellestørrelse øker med cellen syklus forhånd og dermed at Screen har potensial til å skille cellene basert på celle syklus fase.
Som vi har vist (figur 5), føre avvik fra optimalisert prosedyren kompromittert utvalg kvalitet, spesielt for cellene i G2/M faser. Imidlertid påvirke reduksjon i antall brøker eller brøkdel volumet ikke merkbart renheten av celler i G1 fase (figur 5). Snarveier til prosedyren kan dermed bli tolerert hvis bare renset G1 fase celler kreves. Selv om Screen er lett mottakelig for suspensjon cellekulturer, kan den også brukes subcellular fraksjoner. For eksempel har kjerner fra murine pre-B celler blitt størrelse-atskilt med Screen8. Tilhenger celletyper posere potensielle problemer på grunn av deres tilbøyelighet for gruppe og mulig overholdelse overflater av rør og elutriation kammeret og dermed bør undersøkes med forsiktighet.
Den viktigste begrensningen av Screen er kostnaden for utstyret. en mulig løsning er å samarbeide med en lab som har nødvendig apparatet. Merk at mens rotoren er en dedikert instrument, centrifuge kan brukes til generelle sentrifugering formål, dermed redusere kostnaden investert utelukkende i Screen. En annen begrensning er at planleggingen av eksperimenter er mer problematisk sammenlignet med fleksibiliteten til andre metoder som serum sult eller kjemiske synkronisering. Elutriation går vanligvis ta 5-6 timer, og hvis cellene fikk senere trengs for kortsiktige eller multi-tid eksperimenter, kan dette medføre planlegging ulemper. Den største fordelen er at cellene ved denne metoden er Uaffisert og kan utdannet i mange dager uten noen tegn på distress, som vi har vist15. Dette står i kontrast med celler synkroniseres av kjemiske midler som kan havn narkotikainduserte skade. En fersk studie, bruke NB4 celler avledet fra akutt myelogen leukemi eksplosjonene, direkte forhold Screen og andre metoder, inkludert arrestasjonen serum sult, hydroxyurea eller behandling med en cyclin-avhengige kinase 1 inhibitor, RO-330621. Elutriated cellene og arrestert på sammenlignbare faser dukket opp lignende forhold til DNA innhold og cyclin uttrykk. Men når proteom ble undersøkt, store endringer i protein overflod, spesielt stress-relatert og arrestere-spesifikke proteiner, ble observert i arrestert cellene og ikke i de elutriated cellene på tilsvarende cellen størrelse posisjoner. Disse resultatene markere nytten av Screen for produksjon av Uaffisert celler og understreke at forsiktighet bør brukes når tolke data fra celler på andre måter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Anisha Kothari er avdelingen av cellen og molekylærbiologi ved St. Jude Children's Research Hospital.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH CA109821 (å TCC). Vi takker Beckman Coulter sjenerøst gir midler til å dekke publikasjonen kostnader og teknisk assistanse i oppsett og drift av elutriation. Vi takker Dr. Fred Falkenburg for å gi første primære alle kulturer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks' balanced salt solution | Lonza | 10-508Q | 1 L bottle |
| Fetal Plus bovine serum | Atlas Biologicals | FP-0500-A | 500 mL bottle |
| 2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt | Acros Organics | 212-672-4 | 100 g powder |
| 50 mL concial tubes | Denville Scientifics | C1062-P | 500/case |
| PES Membrane 0.22 µm filter unit | Millipore | SLGP033RB | 250/pack |
| Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V | Beckman Coulter | B14544 | centrifuge compatible with elutriation system |
| JE 5.0 elutriator rotor kit | Beckman Coulter | 356900 | rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly |
| Chamber, standard, 4-mL, "A" | Beckman Coulter | 356943 | standard elutriation chamber |
| Masterflex L/S Easy-Load pump head | Cole-Parmer | EW-07518-10 | |
| Masterflex L/S Variable-Speed Drive | Cole-Parmer | EW-07528-10 | |
| Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 | Cole-Parmer | EW-96420-16 | |
| 25 G x 1.5 Precision Glide needle | BD | 305127 | sterile, single-use needles |
| 10 mL Luer-Lok syringe | BD | 309604 | sterile, single-use syringes |
| Vi-Cell XR | Beckman Coulter | 383556 | |
| PI/RNase staining buffer | BD Pharmingen | 550825 | propidium iodide/RNase staining buffer |
| cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | |
| cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 | |
| P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 8516s | |
| GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 2118s | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6516 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6515 |
References
- Beach, D., Piper, M., Shall, S. Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum. Exp cell res. 129, 211-221 (1980).
- Sevcikova, T., et al. Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda. FEBS letters. 587, 743-748 (2013).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat protoc. 8, 602-626 (2013).
- Banfalvi, G. Overview of cell synchronization. Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).
- Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation. Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).
- Dulla, K., Margalef, A. S. Large-Scale Mitotic Cell Synchronization. Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat protoc. 3, 663-673 (2008).
- Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments. Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).
- Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. Synchronization of Yeast. Meth mol. 1524, 215-242 (2017).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).
- Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell death diff. 19, 369-377 (2012).
- Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors. Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).
- Furst, R., Vollmar, A. M. A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment. Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).
- Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells. Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).
- Nijmeijer, B. A., et al. Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors. Exp hematol. 37, 376-385 (2009).
- Knudsen, E. S., Wang, J. Y. Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation. Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).
- Malumbres, M., Barbacid, M. Mammalian cyclin-dependent kinases. Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).
- Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1. Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).
- Sen, S., et al. Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).
- Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells. eLife. 4, (2015).
